Summary
IVIL-metoden (in vivo immunofluorescence lokalisering) kan brukes til å undersøke in vivo-biodistribusjon av antistoffer og antistoff konjugater for onkologiske formål i levende organismer ved hjelp av en kombinasjon av in vivo tumor målretting og ex vivo immunostaining Metoder.
Abstract
Monoklonale antistoffer (mAbs) er viktige verktøy i kreft deteksjon, diagnose og behandling. De brukes til å avdekke rollen til proteiner i tumorigenesis, kan rettes til kreft biomarkører slik at tumor deteksjon og karakterisering, og kan brukes for kreft terapi som mAbs eller antistoff-narkotika konjugater å aktivere immun Effektor celler, for å hemme signalering trasé, eller direkte drepe celler som bærer det spesifikke antigen. Til tross for kliniske fremskritt i utvikling og produksjon av romanen og svært spesifikke mAbs, diagnostiske og terapeutiske anvendelser kan svekkes av kompleksiteten og heterogenitet av tumor mikromiljøet. Således, for utvikling av effektive antistoff-baserte terapier og diagnostikk, er det avgjørende å vurdere biodistribusjon og samspillet mellom antistoff-baserte bøy med den levende tumor mikromiljøet. Her beskriver vi in vivo Immunofluorescence lokalisering (IVIL) som en ny tilnærming for å studere interaksjoner av antistoff-baserte legemidler og diagnostikk i in vivo fysiologiske og patologiske tilstander. I denne teknikken, en terapeutisk eller diagnostisk antigen-spesifikt antistoff er intravenøst injisert in vivo og lokaliserte ex vivo med en sekundær antistoff i isolerte svulster. IVIL reflekterer derfor in vivo-biodistribusjon av antistoff-baserte legemidler og målrettings agenter. To IVIL-applikasjoner er beskrevet for å vurdere biodistribusjon og tilgjengeligheten til antistoff-baserte kontrastmidler for molekylær bildebehandling av brystkreft. Denne protokollen vil tillate fremtidige brukere å tilpasse IVIL-metoden for sine egne antistoff-baserte forskningsprogrammer.
Introduction
Monoklonale antistoffer (mAb) er store glykoproteiner (ca. 150 kDa) av de immunglobulin overfamilie som skilles ut av B-celler og har en primær funksjon i immunsystemet for å identifisere og enten hemme den biologiske funksjonen til, eller merke for ødeleggelse, bakteriell eller viral patogener, og kan gjenkjenne unormale protein uttrykk på kreftceller1. Antistoffer kan ha en ekstremt høy affinitet til sine spesifikke epitopes ned til femtomolar konsentrasjoner gjør dem svært lovende verktøy i biomedisin2. Med utviklingen av hybridoma teknologi av Milstein og Köhler (tildelt Nobel prisen i 1984) ble produksjonen av mAbs mulig3. Senere ble Human mAbs generert ved hjelp av phage skjermteknologi eller transgene Mouse-stammer og revolusjonerte bruken som ny forskningsverktøy og legemiddel terapi4,5.
Kreft er et verdensomspennende helseproblem og en viktig dødsårsak som skaper behovet for nye tilnærminger for forebygging, deteksjon og terapi6. Hittil har mAbs tillatt frigjøring av rolle gener og deres proteiner i tumorigenesis og når rettet mot kreft biomarkører, kan aktivere tumor deteksjon og karakterisering for pasienten lagdeling. For kreft terapi, bispecific mAbs, antistoff-narkotika konjugater, og mindre antistoff fragmenter utvikles som legemiddel, og for målrettet legemiddellevering å forbedre terapeutisk effekt7. I tillegg antistoffer tjene for biomarkør målretting av kontrastmidler for molekylær Imaging modaliteter som fluorescens-guidet kirurgi, photoacoustic (PA) Imaging, ultralyd (US) molekylær Imaging, og klinisk brukt positron utslipp tomografi (PET) eller enkelt Foton-utslipp beregnet tomografi (SPECT)8. Til slutt, antistoffer kan også brukes som theranostic midler muliggjør lagdeling av pasienter og respons overvåking for målrettet behandling9. Derfor romanen mAbs begynner å spille en avgjørende rolle i kreft deteksjon, diagnose og behandling.
Til tross for kritiske fremskritt i utvikling og produksjon av romanen og svært spesifikke mAbs, diagnostiske og terapeutiske programmer kan gjengis ineffektiv på grunn av kompleksiteten i tumor miljøet. Antistoff interaksjoner er avhengig av typenepitope, det vil si,om det er lineær eller conformational10. I tillegg til anerkjennelse av antigener, antistoffer må overvinne naturlige barrierer som fartøy vegger, basale membraner, og svulsten stroma å nå målcellene uttrykker antigen. Antistoffer samhandle med vevet ikke bare gjennom den variable fragment antigen bindende (fab) domene, men også gjennom konstant krystallinsk fragment (FC) som viderefører til off-site interaksjoner11. Målretting er også komplisert av den heterogene uttrykk for tumor markører i hele tumor bulk og heterogenitet i tumor endometrial blodkar og lymphatics system12,13. I tillegg er tumor mikromiljøet består av kreft-assosiert fibroblaster som støtter tumorceller, tumor immunceller som undertrykker anti-tumor immunreaksjoner, og tumor endotelet som støtter transport av oksygen og næringsstoffer, alle som forstyrrer inntrengning, distribusjon og tilgjengelighet av antistoff-baserte legemidler eller diagnostikk. Samlet sett kan disse hensyn begrense terapeutisk eller diagnostisk effekt, redusere behandlingen respons, og kan føre til tumor motstand.
For utviklingen av effektive antistoff-baserte terapier og diagnostikk er det derfor avgjørende å vurdere biodistribusjon og samspillet mellom antistoff-baserte bøy i tumor mikromiljøet. For tiden, i prekliniske studier, markør uttrykk i tumor forsknings modeller er analysert ex vivo av immunofluorescence (IF) farging av tumor seksjoner14. Standard IF farging utføres med primære markør spesifikke antistoffer som deretter fremhevet av sekundære fluorescensmerkete merket antistoffer på ex vivo tumor vev skiver som har blitt isolert fra dyret. Denne teknikken fremhever den statiske plasseringen av markøren på tidspunktet for vev fiksering og gir ikke innsikt i hvordan antistoff-baserte legemidler eller diagnostikk kan distribuere eller samhandle i fysiologiske forhold. Molekylær Imaging av pet, SPECT, oss, og pa kan gi informasjon om antistoff-bøyd kontrast agent distribusjon i levende prekliniske modeller8,15. Som disse Imaging modaliteter er ikke-invasiv, langsgående studier kan utføres og tidssensitive data kan samles med et minimalt antall dyr per gruppe. Men disse ikke-invasiv molekylær Imaging tilnærminger er ikke følsom nok og ikke har nok oppløsning for lokalisering av antistoff distribusjon på cellenivå. I tillegg kan de fysiske og biologiske egenskapene til det primære antistoff bli drastisk endret av Bøyning av et kontrastmiddel16.
For å ta in vivo fysiologiske og patologiske tilstander i betraktning av hvordan antistoff-baserte legemidler og diagnostikk samhandle innenfor tumor miljøet og for å oppnå høyoppløselig mobil og selv sub-cellulære distribusjon profiler av ikke-bøyd antistoffer, foreslår vi en IF-tilnærming, som anses in vivo Immunofluorescence lokalisering (IVIL), der antigen-spesifikke antistoff er intravenøst injisert i vivo. Den antistoff-baserte terapeutiske eller diagnostiske, fungerer som en primær antistoff, sirkulerer i funksjonelle blodårer og binder seg til sin mål protein i svært nøyaktige, levende tumor miljøet. Etter isolering av in vivo-merkede svulster med det primære antistoff, brukes et sekundært antistoff til å lokalisere akkumulert og beholdt antistoff-konjugater. Denne tilnærmingen er lik en tidligere beskrevet IF histologi tilnærming sprøytebruk fluorescensmerkete merket antistoffer17. Selv her unngår bruken av ikke-bøyd antistoffer en potensiell endring i biodistribusjon egenskaper indusert av antistoff modifisering. Videre, ex vivo anvendelse av fluorescerende sekundære antistoff unngår et mulig tap av fluorescens signal under vevs Oppsamling og prosessering og gir forsterkning av fluorescens signal intensitet. Vår merking tilnærming reflekterer in vivo biodistribusjon av antistoff-baserte legemidler og målrettede agenter og kan gi viktig innsikt i utviklingen av romanen diagnostiske og terapeutiske midler.
Her beskriver vi to anvendelser av IVIL metoden som anvendes i tidligere studier som undersøker biodistribusjon og tilgjengelighet av antistoff-baserte kontrastmidler for molekylær Imaging tilnærminger for brystkreft deteksjon. Først biodistribusjon av et antistoff-nær infrarød Dye bøye (anti-B7-H3 antistoff bundet til nær infrarød fluorescens fargestoff, indocyanine grønn, B7-H3-ICG) og isotype kontroll agent (ISO-ICG) for fluorescens og photoacoustic molekylær Imaging er utforsket18. Dette programmets metode er beskrevet i protokollen. Deretter blir de biodistribusjon resultatene av en conformationally følsom antistoff til netrin-1, vanligvis ikke synlig med tradisjonell IF Imaging, brukes med ultralyd molekylær Imaging, er kvantifisert og presentert i representative resultater19. Ved avslutningen av denne protokollen papiret, bør leserne føler seg komfortable vedta IVIL metoden for sine egne antistoff-baserte forskningsprogrammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle administrative panel på laboratorium Animal Care (APLAC) av Stanford University.
1. transgene Mouse modell av brystkreft utvikling
- Observer mus fra ønsket kreft modell for riktig tumor vekst via palpasjon eller tykkelse måling før du fortsetter.
Merk: Her ble transgene murine-modellen av brystkreft utvikling (FVB/N-TG (MMTV-PyMT) 634Mul/J) (MMTV-PyMT) brukt. Disse dyrene utvikler spontant en invasiv brystkreft svulster mellom 6 og 12 ukers alder i hver melke kjertel20. Normale brystkjertler ble brukt som kontroller fra den transgene, alders-matchet littermates.
2. intravenøs injeksjon av spesifikke og ikke-spesifikke antistoff midler
- Rens kanin anti-mus B7-H3 og kanin IgG isotype kontroll antistoffer på en avsaltingsspisser overlegne sammenlignet kolonne (f. eks PD-10) for å fjerne konserveringsmidler og lagring buffere etter produsentens instruksjoner.
Merk: noen antistoffer kan trenge ytterligere rensing med protein-A agarose perler basert protokoll21. - Alikvot doser på 33 μg av hvert antistoff bøye i individuelle mikrosentrifugen rør.
Merk: dosering av administrert agent kan variere avhengig av programmet og samsvarer med doser der antistoff bøy brukes rutinemessig. Konsentrasjonen av antistoff løsninger er nødvendig hvis volumet er mer enn 100 μL for dyrs sikkerhet. - På ønsket tidspunkt før vev samlingen, her 96 h, bedøve svulsten bærende dyr med 2% isoflurane som strømmer i oksygen ved 2 L/min, og plasser på en 37 ° c oppvarmet stadium. Gjør en tå knipe for å sikre at riktig nivå av anesthsia ble nådd før inngrepet.
- For å forberede halen vene inoculation av antistoff løsninger, desinfisere halen av dyret ved å tørke tre ganger med en alkohol tørke. Dilate halen årer ved oppvarming med en varmepute for ca 30 s. unngå å varme opp hele dyret. Tørk halen igjen med en alkohol tørke etter fjerning av varmeputen.
- Ved hjelp av en 27G hale venekateter, sett sommerfugl nålen inn i en av de to laterale halen årer og forsiktig feste halen med nålen til scenen med et stykke kirurgisk tape.
Merk: synlig blod tilbakestrømning inn i kateteret indikerer riktig plassering av nålen i halen blodåre. - Skyll kateteret med 25 μL av sterilt fosfat bufret saltvann (PBS), og Injiser deretter antistoff oppløsningen inn i kateteret ved hjelp av insulinsprøyter. Skyll kateteret igjen med 25 μL sterilt PBS.
- Fjern nålen fra halen og påfør press for å stoppe eventuelle blødninger.
- Slå av anestesi og observere dyret til helt våken for noen tegn til nød.
3. innsamling og utarbeidelse av målet tumor vev
- På ønsket tidspunkt, humant euthanize dyret i henhold til akseptable institusjonelle prosedyren, her, ved gradvis inhalasjon av 100% CO2 fra en komprimert gass tank med et kammer forskyvning strømningshastighet på 10-30% volum/min.
Merk: noen anvendelser av IVIL teknikken krever dødshjelp av hjerte-og med PBS å fjerne fritt sirkulerende antistoff19,22. - Etter bekreftelse av Human dødshjelp via opphør av luftveiene og CARDIAC bevegelse, mangel på tå knipe respons, og greying av slimhinner, avgiftsdirektoratet tumor vev ved hjelp av kirurgiske saks og tang som følger:
- Legg musen i liggende posisjon og fatte bare det ytterste laget av huden mellom settet av brystkjertler nærmest halen (5th) med tang, lage et lite snitt med et par kirurgiske saks.
- Introduser den lukkede saks i kuttet og langsomt åpne spissen for å nøye skille huden fra den underliggende bukveggen membran holde den intakt.
- Lag en vertikal snitt opp magen, fortsetter å skille huden fra den indre membranen. Mellom 3Rd og 4th brystkjertler, lage en horisontal kutt over magen for å tillate tilbaketrekking av hud og visualisering av brystkjertlene.
Merk: melke svulster og kjertler ligger overfladisk under huden. - Fatte hver svulst eller normal kjertel med tang, forsiktig trimme bort den vedlagte huden ved hjelp av kirurgisk saks.
- Plasser excised vev i vev disponibel base muggsopp, prelabeled og fylt med optimal skjæring temperatur (OCT) innebygging medium og fryse formene raskt ved plassering på tørr is. For å studere off-Target levering, avgiftsdirektoratet andre vev eller organer av interesse (f.eks, leveren eller lungene).
Merk: for å stanse protokollen midlertidig på dette tidspunktet, Oppbevar frosne vevs blokker ved-80 ° c til klar til å fortsette. - Ved hjelp av en kryostaten, seksjon frosset vev blokker på 10 μm tykkelse og plasser tilstøtende seksjoner på prelabeled vedheft glass lysbilder.
Merk: Hvis du vil stanse protokollen midlertidig, lagrer du lysbildene ved-80 ° c til du er klar til å fortsette.
4. ex vivo fargeprotokoll
Merk: for kvantitativ sammenligning mellom fluorescens mikroskopi bilder, alle lysbildene er farget på samme tid med de samme forberedt løsninger.
- Skyll frosne vevs lysbilder med romtemperatur PBS for 5 min for å fjerne OCT.
- Avgrense vev seksjoner med en hydrofobe barriere penn for å redusere volumet av løsninger som trengs under farging.
Merk: Vær forsiktig så du ikke lar pennen kjøre over vevsprøvene, da den kan enten fjerne vevet fra lysbildet eller forhindre at det blir riktig flekker på den berørte vevs delen. Ikke la vevs delene tørke på noe punkt. - Fest vevs delene med 4% paraformaldehyde oppløsning i 5 min.
- Skyll lysbildene i PBS i 5 min.
- Permeabilize vev seksjoner med 0,5% Triton-X 100 i PBS for 15 min.
- Skyll lysbildene i PBS i 5 min.
- Blokker vev med 3% w/v storfe serum albumin (BSA) og 5% v/v geit serum, både i PBS (blokkering løsning) for 1 t ved romtemperatur.
Merk: match blokkerings løsningen serum til den sekundære antistoff verts dyret. - Skyll lysbildene i PBS i 5 min.
- Ruge seksjoner med rekord-holde primære antistoffer som ønsket, muligens en felles kjernefysisk (f. eks, DAPI), vaskulær (f. eks, CD31), eller cytoplasmatiske markør (f. eks, utgangen). Her, rotte anti-mus CD31 (vaskulær markør) ved en 1:100 fortynning ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner i blokkerings løsningen over natten ved 4 ° c beskyttet mot dehydrering på en sklie skuff.
Merk: ikke Legg til ekstra primær antistoff eller antistoff bøye. Bøy som ble injisert og tillatt å akkumulere i vev in vivo fungere som primær antistoff. - Skyll lysbildene i PBS i 5 min tre ganger, endre PBS hver gang.
- Ruge lysbilder med sekundære antistoffer for å merke primære antistoffer. For dette programmet, visualisere anti-B7-H3 antistoff bruker AlexaFluor-546 bøyd geit anti-kanin antistoff (1:200 fortynning, optimalisert i henhold til produsentens instruksjoner) og CD31 med AlexaFluor-488 geit anti-Rat sekundære antistoff (1:200 fortynning, optimalisert i henhold til produsentens instruksjoner) i blokkerings løsning, beskyttet mot lys og dehydrering på en lysbilde skuff, for 1 time ved romtemperatur.
Merk: sekundære antistoffer er fra samme vert dyret, men samsvarer med affinitet av sekundære antistoffer til verts arter av de respektive primære antistoff. Lysbilder er beskyttet mot lys fra dette punktet og utover. - Skyll lysbildene i PBS i 5 min tre ganger, endre PBS hver gang.
- Påfør en dråpe av monterings mediet inn i midten av vevet skive og forsiktig plassere en dekkglass unngå å sette luftbobler.
- Forsegle kantene på dekkglass med klar neglelakk og la tørke.
Merk: for å stanse protokollen midlertidig i opptil en uke, må du lagre lysbildene ved-20 ° c til du er klar til å fortsette.
5. konfokalmikroskopi mikroskopi Imaging og kvantitativ bildeanalyse
Merk: klargjøring av konfokalmikroskopi mikroskop og bilde parametre vil avhenge av det konfokalmikroskopi systemet som brukes. Mikroskopet som brukes her, ble kjøpt kommersielt (for eksempel Zeiss LSM 510 meta-system) og den tilhørende anskaffelses programvaren ble brukt (f.eks. Zen 2009). Imidlertid vil mange av disse trinnene gjelde for alle konfokalmikroskopi mikroskop og anta grunnleggende konfokalmikroskopi mikroskopi kunnskap.
- Etter at systemet er slått på og varmet opp, velger du ønsket mål; Her en 20x (numerisk blenderåpning = 0,8) mål ble brukt.
- Legg en positiv kontroll lysbilde, dekkglass ned, for å tillate for å sette optimalisering for det lyseste signalet. Imaging i den røde kanalen, Fokuser systemet på prøven i Live Imaging-modus.
- For hver laser kanal som brukes, optimalisere laser intensiteten, Master Gain, og pinhole størrelse som følger:
- Bytt til kontinuerlig modus for bildebehandling.
- Optimaliser laser intensiteten (som styrer laser strømmen) og Gain (Master) (som styrer spenningen for photomultiplier tube) Glide linjer mens du overvåker histogrammer (lut). Juster disse to innstillingene til det dynamiske området i histogrammet er fylt uten mette bildepunkter.
Merk: Hvis laseren intensitet er for høy photobleaching vil forekomme. Hvis Gain (Master) er for høy, vil bildet bli støyende. Ideelt sett vil Gain (Master) være i midten av sitt utvalg. - Sett pinhole til 1 luftig enhet (au), som gir den høyeste oppløsningen og den tynneste z-sektoren.
- Skyv den digitale Forskyvnings linjen for å minimere støy gulvet på lut histogram for en sann svart bakgrunn.
Merk: Når mikroskopi innstillingene er optimalisert for hver laser kanal og objektiv, holde dem konstant gjennom bildebehandlings økten og for Imaging av alle lysbildene, for å tillate den kvantitative sammenligning mellom lysbildene.
- Under gjennomsnitti kategorien anskaffelses modus velger du ønsket tall og bit dybde. Klikk på knappen optimal for å angi den optimale pikselstørrelsen.
- Bruk snap Acquisition-knappen for å samle et bilde av høy kvalitet. Her ble det valgt tilfeldige felt fra svulsten, men andre områder av interesse kan gjelde for ulike anvendelser (fartøy, tumor marginer, gjennomtrenging dybde, etc.)
- Lagre bildefiler i formatet som brukes av konfokalmikroskopi programvare (her, ". LSM") for offline prosessering og kvantifisering.
Merk: Hvis ikke alle lysbildene er avbildet under samme økt, lagre innstillingene og laste dem på nytt ved senere besøk, men reimaging det samme lysbildet er ikke anbefalt på grunn av photobleaching. - Utfør de kvantitative fluorescens intensitet målinger. Åpne Fiji (Fiji er bare ImageJ programvare)19,23 og laste inn en. LSM bildefil ved å dra inn på statuslinjen.
- Del fargekanal dataene. Gå til bilde ≫ stakker ≫ delte kanaler.
- Forhåndsbehandle de fluorescens bildene etter behov, dvs. trekk fra bakgrunns signalet (prosess ≫ trekk fra bakgrunnen) eller Reduser støyen via en filtreringsmetode.
- Segmentere fargekanalen som tilsvarer referanse proteinet (vaskulær, kjernefysisk, cellulær beis) ved å angi en terskel for signal intensiteten (bilde ≫ juster ≫ terskel).
Merk: manuell terskelverdi introduserer subjektivitet i bildeanalysen, derfor bruker en automatisert terskelverdi algoritme eller refererer bildet histogrammer gjør bildet analyseresultater mindre partisk. - Bruk denne terskelen til å opprette en binær maske (prosess ≫ binær ≫ Konverter til maske).
- Mål og Merk ROIs i masken (analyser ≫ analyser partikler ≫ Merk av for Legg til i overordnet > OK).
- Bruk ROIs på fargekanalen som tilsvarer antistoff av interesse (Klikk på kanalbilde, analyser ≫ verktøy > ROI Manager ≫ mål). Dette vil påføre masken ROIs på antistoff bildet og gi bilde målinger for etikett seksjoner i resultatvinduet. Lagre resultater-vinduet (fil ≫ lagre).
- Beregn ønsket statistikk av interesse, for eksempel gjennomsnittlig fluorescens intensitet som beskrevet her24.
- Utfør alle behandlingstrinn identisk til hvert bilde i et sett med lysbilder. Opprett en makro for å gjøre dette automatisk for store bilde bunker23.
- For bildevisning bare etter kvantitative målinger, bruk kvalitative bildejusteringer for å optimalisere visualisering av biodistribusjon mønstre ved å justere minimum, maksimum, lysstyrke og kontrast til de samme nivåene på alle lysbildene (bilde ≫ Juster > Lysstyrke/kontrast).
- Konverter bildetypen (bilde ≫ type > RGB-farge) og lagre filer i en bildetype uten datatap, for eksempel TIFF (Fil > Lagre som > TIFF...) for bruk i presentasjoner og publikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den IVIL metoden ble brukt her for å undersøke in vivo biodistribusjon og vev interaksjon av B7-H3-ICG og ISO-ICG, ved å la agentene, etter intravenøs injeksjon i et levende dyr, å samhandle med målet vev for 96 h, og så når vevet er for å fungere som primær antistoffer under ex vivo immunostaining. Den IVIL metoden ble også sammenlignet med standard ex vivo IF farging av vev for B7-H3 markør. Normal murine brystkjertler ikke uttrykke B7-H3 markør, bekreftet i ex Vivo, standard IF farging, og ikke akkumulere antistoffer gjennom andre passive mekanismer, og derfor ingen akkumulering av B7-H3-ICG eller ISO-ICG ble oppdaget, representative av et negativt resultat (figur 1, øverste rad). Men murine melke svulster uttrykker B7-H3 både i blodkar og epitel (som bekreftes av standard IF farging), og IVIL var i stand til å markere B7-H3-ICG agent som hadde samlet sterkt på blodkar og var i stand til delvis extravasate fra blodkar å binde til kreftcellene selv om i en heterogen måte i forhold til uniform fordeling av B7-H3 markør gjennom svulster, også vist i figur 1, nederste rad. Videre, selv om ISO-ICG agent har ingen molekylær spesifisitet, var det likevel vist å akkumulere i en uspesifisert måte, på grunn av FC interaksjoner, dårlig interstitiell drenering, og den forbedrede permeabilitet og oppbevaring effekt innen murine bryst svulster (figur 1). Denne forskjellen er uthevet i biodistribusjon mønstrene vist mellom de to agentene, og ytterligere forsterker de spesifikke bindende resultatene av den spesifikke antistoff agent, og representerer to mulige utfall av et positivt resultat.
Den B7-H3-ICG representative resultater demonstrere hvordan IVIL metoden kan brukes som en kvalitativ metode for å beskrive generelle antistoff/antistoff bøye biodistribusjon. Noen ganger kan det imidlertid være nødvendig med en mer kvantitativ tolkning, eller et antistoff kan ha svært følsom, konformasjon spesifikk bindings kapasitet. I slike situasjoner kan IVIL også gi den ønskede informasjonen. I et annet eksempel, der uttrykket av netrin-1 protein i tumor vev og co-lokalisering med CD31-positive tumor endotelet skulle bli studert, IVIL teknikken ble også med hell brukt19.
Netrin-1 er en utskilt 65 KDA protein som er over-uttrykt i visse typer kreft som metastatisk brystkreft25,26. For å utvikle en molekylær Imaging tilnærming for netrin-1, in vivo tilgjengeligheten av proteinet måtte fastsettes19. Også, som anti-netrin-1 antistoff ikke har tilstrekkelig affinitet for sitt antigen etter vev fiksering, en alternativ fargeprotokoll til klassisk immunhistokjemi eller IF farging var nødvendig og IVIL ble iverksatt. Humanisert anti-netrin-1-antistoff og et humant IgG-isotype kontroll antistoff var intravenøst injisert 24 timer før hjerte-og tumor oppsamling. Det ble brukt hjertestans for å redusere løs bakgrunns flekker i blodkar, og for å øke påvisning av signifikant netrin-1 antistoff akkumulering i forhold til isotype kontroll antistoff signal når mål uttrykket er begrenset. Tumor seksjoner ble merket ex vivo med blodkar utheving anti-CD31 antistoff (rotte anti-mus CD31 antistoff (tabell over materialer) og fluorescerende sekundære antistoffer, Alexa 488-kombinert geit anti-rotte IgG, 1:500 fortynning og Alexa fluor 594- kombinert geit anti-humant IgG, 1:500 fortynning henholdsvis) ble brukt til å avdekke anti-netrin-1/isotype og anti-CD31 mAbs. Den fluorescens signal intensiteten av anti-netrin-1 og isotype kontroll antistoff ble kvantifisert for å fastslå forskjeller i farging Co-lokalisert med CD31. Figur 2 viser at anti-netrin-1-antistoff som er spesifikt akkumulert i epitel tumor kammeret til MMTV-PyMT melke svulster (et positivt resultat), mens det ikke var noe signal i normale melkekjertler (et negativt resultat). Antistoff videre lokalisert med endothelial markør CD31. Sammenligning med isotype antistoff-injisert svulster og normale kjertler viste at epitel akkumulering var spesifikk for tumorvevet. Det var signal akkumulering i endothelial cellene i både svulster og normale kjertler på grunn av netrin-1 binding (svulster) og ikke-spesifikke FC interaksjoner (svulster og normal brystkjertler)11. Således, det fluorescens signal kvantifisering benytter en CD31-basert binær maske var krevde og bevist det det anti-netrin-1 antistoff signal var viktig høyere enn det isotype kontroll antistoff signal inne det svulst tissue, hvilke foreslår netrin-1 spesielt akkumulert i tumor endotelet.
Figur 1 : Representative konfokalmikroskopi micrographs av sammenligningen av spesifikke B7-H3 antistoff-ICG bøye og uspesifisert isotype kontroll antistoff-ICG bøye lokalisering i murine brystkjertler inneholder normal eller kreft vev. (Øverst) Normal murine melkekjertler fra et dyr intravenøst injisert med 33 μg av ISO-ICG eller B7-H3-ICG (rød) og mot-farget med CD31 (grønn) som viser ingen flekker av antistoff konjugater. Normal vev ble vist å ha noen uttrykk for B7-H3 av standard ex vivo IF farging. (Nederst) Invasive melke svulster fra et dyr intravenøst injisert med 33 μg av B7-H3-ICG eller ISO-ICG (rød) og vaskulær Counter-beiset CD31 (grønn) viser omfattende, heterogene flekker, men med ulike distribusjon mønstre, for både B7-H3-ICG og ISO-ICG agenter. B7-H3-ICG binder sterkt til blodkar, det første kontaktpunkt in vivo, og deretter er i stand til å extravasate fra blodkar til heterogeneously flekken av tumor epitel. ISO-ICG viser ikke-spesifikk akkumulering i tumor vev. Standard ex vivo IF farging viser ensartet uttrykk for B7-H3 markør på epitel og endothelial celler. Gul farge indikerer co-lokaliserte rødt og grønt kanal signal. Scale bar er 100 μm og konsistent mellom panelene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : In vivo Immuno-lokalisering av netrin-1 i MMTV-PyMT melke svulster. (Venstre) Representative konfokalmikroskopi micrographs av IVIL-metoden for å oppdage netrin-1-uttrykk (rødt) eller isotype kontroll uttrykk (rød) i murine kreft og normale melkekjertler. IVIL bekrefter epitel signal for netrin-1 i MMTV-PyMT svulster, men ikke i normale brystkjertler, og sterk netrin-1 signal på endothelial celler (CD31 farging, grønn) i bryst svulster og betydelig svakere signal av netrin-1 i normale brystkjertler. Gul farge indikerer co-lokaliserte rødt og grønt kanal signal. Skala linjer indikerer 20 μm. For påvisning av netrin-1-protein i tumor endotelet, 100 μg av primær humanisert NET1-H-mAb eller 100 μg av humant IgG-isotype kontroll antistoff ble intravenøst injisert 24 timer før tumor oppsamling. Fritt sirkulerende antistoff ble fjernet ved hjerte-og kryostaten, og tumorvevet ble isolert, blits frosset og delt med en tykkelse på 15 μm. Endothelial celler ble merket med primær rotte anti-mus CD31 antistoff etterfulgt av sekundære Alexa 488-kombinert geit anti-rotte IgG. For å avdekke den primære antistoff målretting netrin-1, sekundære Alexa fluor 594-kombinert geit anti-humant IgG ble brukt. For å unngå løs interaksjon av geit sekundære antistoffer, vevsprøver ble blokkert med geit serum. (Høyre) Søylediagram fremhever kvantifisering av anti-netrin-1 eller isotype-kontroll antistoff signal som colocalizes med anti-CD31 antistoff signal. N = 13 svulster (av to mus) per gruppe av MMTV-PyMT og N = 7 brystkjertler (med en mus) per gruppe av normale kjertler; Feil barer stede SEM; Sammenligninger med to grupper ble utført med student t-test. Figur gjengitt med tillatelse fra 19 under Creative COMMONS License CC by 4,0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden har flere kritiske trinn og krever potensielle endringer for å sikre en vellykket implementering. Først, dosering og timing av antistoff/antistoff bøye intravenøs injeksjon må skreddersys til den spesifikke anvendelse. Generelt bør dosering brukes som er i samsvar med hvordan antistoff bøy vanligvis brukes, det vil si matchende doser av terapeutisk antistoff eller antistoff-basert kontrastmiddel. Også, tidspunktet for innsamling av målet vev bør vurderes nøye. Antistoffer og antistoff konjugater har lengre sirkulasjon ganger enn standard narkotika og kontrastmidler, men disse er svært variable og bør optimaliseres for ønsket program, men det anbefales å tillate minst 24 timer sirkulasjon tid27 . For det andre, under mål vevs samlingen, kan det være nødvendig å iverksette en intrakardielle for å fjerne fritt sirkulerende antistoff fra blod bassenget19. Mens du ser på tumor fordelingen av B7-H3-ICG, ble det funnet unødvendig på grunn av tilstrekkelig lang sirkulasjon ganger (96 h) og ekstravaskulær lokalisering av agenten. For netrin-1-anvendelsen av IVIL-metoden ble imidlertid hjertestans ansett som relevant på grunn av endothelial uttrykk for netrin-1 og dets relativt lave uttrykks nivå. For det tredje, under ex vivo vev farging er det viktig å flekken noen lysbilder som vil bli sammenlignet kvantitativt under samme økt og med de samme løsningene for å hindre normal Inter-batch variasjoner. Sørg for at lysbildene skylles riktig mellom trinnene, og at den hydrofobe Penne løsningen ikke kommer i kontakt med vevet for å unngå suboptimal flekker. Til slutt, under konfokalmikroskopi mikroskopi, opprettholder du de samme bildeinnstillingene mellom lysbildene for å muliggjøre relativ kvantifisering og arbeide raskt for å hindre photobleaching av lysbildene. Disse viktige punktene vil øke sannsynligheten for en vellykket IVIL-implementering.
Det er flere fordeler med IVIL-metoden. For det første, stund metoden er analog med normalen hvis teknikker, det to skaffe viktig annerledes beskjed. IF farging indikerer anatomiske plasseringen av molekylære markører innen vev på et gitt tidspunkt (når vevet ble samlet og fast). Imidlertid gir IVIL informasjon om hvordan et antistoff eller antistoff bøye, som demonstrert av lokalisering av B7-H3-ICG, er distribusjon og samhandling, enten det er spesifikk eller ikke-spesifikk akkumulering, internalisering, eller oppbevaring i målet Vev. Dette er avgjørende for farmakokinetiske/dynamiske og biodistribusjon studier. Andre, tradisjonelle IF metoder er, til tider, begrenset av fiksering av vev som kan forårsake antigen forvrengning eller maskering hindre binding av den primære antistoff28. Derfor kan IVIL være nyttig når standard IF farging eller immunhistokjemi mislykkes. Den IVIL teknikken kan betraktes som en komplementær metode for å verifisere in vivo antistoff aktivitet som ellers ville være umulig å oppdage. Til slutt, de som er kjent med tradisjonelle IF farging teknikker vil finne metoden grei i utførelsen og vil ha det meste av nødvendige materialer på hånden.
IVIL-metoden har noen begrensninger. Først, på grunn av nødvendigheten av å euthanize dyret å høste målet vev, IVIL bare gir biologisk samhandling informasjon på et enkelt tidspunkt. Injeksjon av primære antistoff eller antistoff bøye på varierende tid poeng i forskjellige dyr vil tillate en bredere tid vindu av informasjon om biodistribusjon og in vivo interaksjon. For det andre, hvis brukerne er kjent med in vivo dyr teknikker, slik som intravenøs hale blodåre injeksjon eller potensiell intrakardielle, kan dette være en begrensning til metoden. Disse metodene krever dyktige medarbeidere til å yte pålitelig. Men bruk av et kateter under hale vene injeksjon sikrer administrering av hele dosen som riktig nål plassering kan bekreftes før injeksjon. I tillegg er en alternativ til hale vene injeksjon som kan betraktes som retro-orbital injeksjon, som vanligvis har en høyere suksess rate med mindre erfarne personell. Behovet for å flekk og bilde alle vev lysbilder i samme batch for å tillate kvantitativ vurdering begrenser antall prøver og markører som kan inngå i en enkelt studie. Studien må kanskje organiseres i seriell farging på forskjellige dager og på tilstøtende vev skiver for å samle inn ønsket informasjon. Til slutt, bruk av arter-matchet antistoffer, dvs., murine anti-mus antistoffer i murine prekliniske modeller, reiser en sak av ikke-spesifikk bakgrunn farging med sekundære antistoffer. Dermed er bruken av arter-samsvarer primær antistoffer kreves som presenteres i denne studien, eller fluorescensmerkete merket arter-matchet primære antistoffer måtte brukes.
IVIL-teknikken er nyttig for biodistribusjon analyse av diagnostiske og terapeutiske antistoffer for mange bruksområder. Ulike anvendelser for intravenøs antistoff eller ligand injeksjon og ex vivo vevs analyse har blitt rapportert tidligere og bekrefter interessen for å bredt innføre denne farge prosedyren. Robertson og kolleger merket vaskulære elementer som endothelial blodkar og større fartøy med intravenøs injeksjoner av Lycopersicon esculentum agglutinin (tomat Lektiner)29. Teknikken var forenlig med Histochemistry og immuncytokjemi og avslørte vaskulær mønstre og funksjonell parenkymatøs kjennetegn. Selv om bruken av fluorescerende ligander var begrenset av den raske nedbrytning av fluorescens ved injeksjon30. Som demonstrert i IVIL-protokollen, kan injeksjonen av en primær antistoff in vivo etterfulgt av ex vivo-merking med et sekundært fluorescerende antistoff være en mer robust tilnærming. En annen interessant anvendelse av denne type in vivo IF farging er merkingen av intravaskulær lymfocytter som demonstrert av Anderson og kolleger31. Intravenøst injisert antistoff ble brukt til å merke lymfocytter lokalisert i blodkar, som senere ble samlet inn og videre behandlet for flyt flowcytometri analyse av immunologiske markører. Til slutt, for å vurdere levering og histologiske lokalisering av antistoff legemiddel selskap som ble levert til pasienter med hode og nakke plateepitelkreft (HNSCC), ble en første in-Human studie av antistoff distribusjon utført ved hjelp systemisk administrert nær-infrarød fluorescensmerkete merket terapeutisk antistoff cetuximab-IRDye800CW32. Dataene ble sammenlignet med histologiske analyser og viste at fluorescerende signalet sank med avstand fra svulsten som bekrefter spesifisitet. Skjønt, den terapeutiske antistoff ikke nå alle regioner av antigen uttrykk, spesielt godt differensiert tumor regioner med høye nivåer av epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) antigen. I dagens sammenheng med kreftforskning med fokus på utvikling av målrettede terapier og immunterapi som møter sterk motstand og mangel på effekt, ville IVIL metoden være et utmerket verktøy for å studere fordelingen av terapeutiske antistoffer som PD-1/PD-L-1 eller HER233,34. Disse resultatene er svært verdifulle for å forstå hvorfor målrettede terapier er effektive i visse tilfeller fremme utviklingen av romanen tilnærminger. Til sammen fremhever disse eksemplene den potensielle betydningen av IVIL-tilnærmingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Andrew Olson (Stanford nevrovitenskap mikroskopi service) for diskusjoner og utstyr bruk. Vi takker Dr. Juergen K. Willmann for hans mentorer. Denne studien ble støttet av NIH R21EB022214 Grant (KEW), NIH R25CA118681 Training Grant (KEW), og NIH K99EB023279 (KEW). Stanford nevrovitenskap mikroskopi service ble støttet av NIH NS069375.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
| Indocyanine Green - NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
| Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
References
- Forthal, D. N.
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Lonberg, N., et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).
- McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).
- Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
- Kircher, M. F., Willmann, J. K. Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles. Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).
- Fleuren, E. D. G., et al.
- Forsström, B., Bisławska Axnäs, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).
- Brooks, J. D. Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers. Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).
- Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease. The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M.
- Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
- Freise, A. C., Wu, A. M. In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments. Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).
- Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival. Cancer Research. 78 (3), 758-768 (2018).
- Wilson, K. E., et al. Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent. Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).
- Wischhusen, J., et al. Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer. Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bachawal, S. V., et al. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Research. 73, 1689-1698 (2013).
- Fitamant, J., et al. Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Ryman, J. T., Meibohm, B.
- Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Chen, C. Y., et al. Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels. The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- de Boer, E., et al. In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 5, (2015).
- Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors. British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).
- Rexer, B. N., Arteaga, C. L. Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications. Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).
