Summary
In vivo immunofluorescenstest lokalisering (ivil) metode kan anvendes til at undersøge in vivo Biodistribution af antistoffer og antistof konjugater til onkologiske formål i levende organismer ved hjælp af en kombination af in vivo tumor målretning og ex vivo immunofarvning Metoder.
Abstract
Monoklonale antistoffer (mAbs) er vigtige værktøjer i kræft påvisning, diagnose og behandling. De er vant til at opklare rollen af proteiner i tumorigenesis, kan rettes til kræft biomarkører muliggør tumor detektion og karakterisering, og kan anvendes til kræftbehandling som mAbs eller antistof-Drug konjugater til at aktivere immun Effector celler, at hæmme signalering veje, eller direkte dræbe celler, der bærer det specifikke antigen. På trods af kliniske fremskridt i udviklingen og produktionen af nye og meget specifikke mAbs, diagnostiske og terapeutiske anvendelser kan blive forringet af kompleksiteten og heterogenitet af tumor mikromiljø. Således, for udvikling af effektive antistof-baserede terapier og diagnostik, det er afgørende at vurdere Biodistribution og interaktion af antistof-baserede konjugat med levende tumor mikromiljø. Her beskriver vi in vivo immunofluorescens lokalisering (IVIL) som en ny metode til at studere interaktioner mellem antistof baseret terapeutisk og diagnostik i in vivo fysiologiske og patologiske tilstande. I denne teknik injiceres et terapeutisk eller diagnostisk antigen-specifikt antistof intravenøst in vivo og lokaliseret ex vivo med et sekundært antistof i isolerede tumorer. IVIL derfor afspejle in vivo Biodistribution af antistof-baserede lægemidler og målretning agenter. To IVIL-applikationer er beskrevet vurdering af Biodistribution og tilgængelighed af antistof-baserede kontrastmidler til molekylær billeddannelse af brystkræft. Denne protokol vil give fremtidige brugere mulighed for at tilpasse IVIL-metoden til deres egne antistof baserede forsknings applikationer.
Introduction
Monoklonale antistoffer (MAB) er store glycoproteiner (ca. 150 kDa) af immunglobulin superfamilien, der udskilles af B-celler og har en primær funktion i immunsystemet til at identificere og enten hæmme den biologiske funktion af, eller Mark for ødelæggelse, bakterielle eller virale patogener, og kan genkende unormalt protein udtryk på cancerceller1. Antistoffer kan have en ekstremt høj affinitet til deres specifikke epitoper ned til femtomolære koncentrationer, hvilket gør dem meget lovende værktøjer i biomedicin2. Med udviklingen af hybridom celle-teknologien af Milstein og Köhler (tildelt Nobelprisen i 1984) blev produktionen af MABS mulig3. Senere blev humane MABS genereret ved hjælp af fagtypning display teknologi eller transgene muse stammer og revolutionerede deres anvendelse som nye forskningsværktøjer og Therapeutics4,5.
Kræft er et verdensomspændende sundhedsproblem og en væsentlig dødsårsag, der skaber behovet for nye tilgange til forebyggelse, opdagelse og terapi6. Til dato, MABS har tilladt udstråling af rollen af gener og deres proteiner i tumor og når rettet mod kræft biomarkører, kan muliggøre tumor detektion og karakterisering for patient stratificering. For kræftbehandling, bispecifikke mAbs, antistof-Drug konjugater, og mindre antistof fragmenter er ved at blive udviklet som Therapeutics, og for den målrettede Drug levering til at forbedre terapeutisk virkning7. Derudover tjener antistoffer for biomarkør målretning af kontrastmidler til molekylære billedbehandlings metoder såsom fluorescens-guidet kirurgi, photoacoustic (PA) Imaging, ultralyd (US) molekylær billeddannelse, og klinisk anvendte Positron emission tomografi (PET) eller enkelt foton emission computertomografi (SPECT)8. Endelig kan antistoffer også anvendes som theranostiske midler, der muliggør stratificering af patienter og respons overvågning for målrettede terapier9. Derfor er nye mAbs begyndt at spille en afgørende rolle i kræft påvisning, diagnose, og behandling.
På trods af kritiske fremskridt i udviklingen og produktionen af nye og meget specifikke mAbs, diagnostiske og terapeutiske applikationer kan gøres ineffektive på grund af kompleksiteten af tumor miljøet. Antistof interaktioner er afhængige af typen af epitope, dvs,om det er lineær eller konformationel10. Ud over anerkendelsen af antigener skal antistoffer overvinde naturlige barrierer såsom fartøjs vægge, basal membraner og tumor stroma for at nå målcellerne, som udtrykker antigenet. Antistoffer interagerer med vævet ikke kun gennem det variable fragment antigen binding (Fab) domæne, men også gennem det konstante krystallinske fragment (FC), som yderligere fører til off-site interaktioner11. Målretning er også kompliceret af det heterogene udtryk af tumor markører i hele tumor bulk og heterogenitet i tumor vaskularisering og lymfesystemet12,13. Desuden er tumor mikromiljø sammensat af Cancer-associerede fibroblaster, som understøtter tumorceller, tumor immunceller, der undertrykker anti-tumor immunreaktioner, og tumor endotelet som understøtter transport af ilt og næringsstoffer, alle som interfererer med penetration, distribution, og tilgængelighed af antistof-baserede Therapeutics eller diagnostik. Samlet set kan disse overvejelser begrænse terapeutisk eller diagnostisk virkning, reducere behandlingsrespons, og kan resultere i tumor resistens.
Derfor, for udvikling af effektive antistof-baserede terapier og diagnostik, det er afgørende at vurdere Biodistribution og interaktion af antistof-baserede konjugat i tumor mikromiljø. I øjeblikket, i prækliniske undersøgelser, markør udtryk i tumor forskningsmodeller analyseres ex vivo ved immunofluorescens (hvis) farvning af tumor sektioner14. Standard hvis farvning udføres med primære markør-specifikke antistoffer, som derefter fremhæves af sekundære fluorescently mærkede antistoffer på ex vivo tumor væv skiver, der er blevet isoleret fra dyret. Denne teknik fremhæver den statiske placering af mærket på tidspunktet for vævs fiksering og giver ikke indsigt i, hvordan antistof-baserede Therapeutics eller diagnostik kan distribuere eller interagere i fysiologiske forhold. Molekylær billeddannelse af PET, SPECT, US og PA kan give oplysninger om antistof-konjugeret kontraststof fordeling i levende prækliniske modeller8,15. Da disse billedbehandlings metoder er ikke-invasive, kan der udføres longitudinale undersøgelser, og tidsfølsomme data kan indsamles med et minimalt antal dyr pr. gruppe. Men, disse ikke-invasive molekylære Imaging tilgange er ikke følsomme nok og ikke har nok opløsning til lokalisering af stof fordeling på cellulært niveau. Desuden kan de fysiske og biologiske karakteristika af det primære antistof ændres drastisk ved konjugering af et kontrastmiddel16.
For at tage in vivo fysiologiske og patologiske betingelser i betragtning af, hvordan antistof-baserede Therapeutics og diagnostik interagerer inden for tumor miljøet og for at opnå høj opløsning cellulære og endda sub-cellulære distribution profiler af ikke-konjugeret antistoffer, foreslår vi en IF-tilgang, der anses in vivo immunofluorescens lokalisering (IVIL), hvor det antigen specifikke antistof intravenøst injiceres in vivo. Den antistof-baserede terapeutiske eller diagnostiske, fungerer som et primært antistof, cirkulerer i funktionelle blodkar og binder sig til sit mål protein i den meget nøjagtige, levende tumor miljø. Efter isolering af in vivo-mærkede tumorer med det primære antistof bruges et sekundært antistof til at lokalisere akkumulerede og bevarede antistof konjugater. Denne fremgangsmåde svarer til en tidligere beskrevet, hvis histologi tilgang injicerer fluorescently mærkede antistoffer17. Selv om her, brugen af ikke-konjugeret antistoffer undgår en potentiel ændring i Biodistribution egenskaber induceret af antistof modifikation. Desuden undgår ex vivo-påføring af fluorescerende sekundært antistof et muligt tab af fluorescens signal under vævs opsamling og-behandling og giver forstærkning af fluorescens signalintensitet. Vores mærknings tilgang afspejler in vivo Biodistribution af antistof-baserede lægemidler og målrettede agenter og kan give vigtig indsigt i udviklingen af nye diagnostiske og terapeutiske agenter.
Her beskriver vi to anvendelser af IVIL-metoden som anvendt i tidligere undersøgelser, der undersøger biodistributionen og tilgængeligheden af antistof baserede kontrastmidler til molekylære billedbehandlings metoder til påvisning af brystkræft. For det første er biodistributionen af et antistof-nær infrarød farvestof konjugat (anti-B7-H3-antistof bundet til det nær infrarøde fluorescens farvestof, indocyanine Green, B7-H3-ICG) og isotype Control agent (ISO-ICG) for fluorescens og foto akustisk molekyl billeddannelse udforskes18. Denne applikation metode er beskrevet i protokollen. Dernæst kvantificeres biodistributionsmæssigt følsomt antistof til netrin-1, typisk ikke detekterbart med traditionel, hvis billeddannelse, der anvendes med ultralyd molekyle dannelse, og præsenteres i de repræsentative resultater19. Ved indgåelsen af denne protokol papir, læsere bør føle sig trygge vedtage IVIL metode til deres egne antistof-baserede forskningsprogrammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af det institutionelle administrative panel for Laboratoriedyrs pleje (APLAC) på Stanford University.
1. transgene musemodel af brystkræft udvikling
- Observere mus fra den ønskede kræft model for den relevante tumorvækst via palpering eller caliper måling før du fortsætter.
Bemærk: her blev den transgene murine model af brystcancer udvikling (FVB/N-TG (MMTV-PyMT) 634Mul/J) (MMTV-PyMT) anvendt. Disse dyr udvikler spontant invasive bryst karcinomer mellem 6 og 12 ugers alderen i hver Brystkirtel20. Normale brystkirtler blev brugt som kontrol fra de transgene-negative, alders matchede litterær.
2. intravenøs injektion af specifikke og ikke-specifikke antistof agenser
- Rense kanin anti-mus B7-H3 og kanin IgG isotype kontrol antistoffer på en afsaltningkolonne (f. eks. PD-10) for at fjerne konserveringsmidler og opbevarings buffere efter producentens anvisninger.
Bemærk: nogle antistoffer kan have brug for yderligere rensning med protein-en agopstået perler baseret protokol21. - Aliquot doser på 33 μg af hvert antistof konjugat i individuelle mikrocentrifuge glas.
Bemærk: dosering af den administrerede agens kan variere afhængigt af applikationen og svarer til de doser, hvor antistof konjugat rutinemæssigt anvendes. Koncentrationen af antistof opløsninger er påkrævet, hvis volumenet er mere end 100 μL for dyrs sikkerhed. - På det ønskede tidspunkt før vævs samlingen, her 96 h, anæstetisere tumor bærende dyr med 2% isofluran flyder i ilt på 2 L/min, og sted på en 37 °C opvarmet fase. Gør en tå knivspids for at sikre den korrekte niveau af anesthsia blev nået forud for proceduren.
- For at forberede halen vene inokulering af antistof opløsninger, desinficerer dyrets hale ved at tørre tre gange med en spritserviet. Dilate hale vener ved opvarmning med en varmepude for ca. 30 s. undgå opvarmning af hele dyret. Tør halen igen med en spritserviet efter fjernelse af varmepuden.
- Ved hjælp af en 27G hale venekateter, indsætte Butterfly nål i en af de to laterale hale vener og forsigtigt ordne halen med den indsatte nål til scenen med et stykke kirurgisk tape.
Bemærk: synlig blodgennemstrømning i kateteret indikerer den korrekte placering af nålen i halen vene. - Kateteret skylles med 25 μL sterilt fosfatbuffer saltvand (PBS), og derefter indsprøjtes antistof opløsningen i kateteret ved hjælp af insulin sprøjter. Kateteret skylles igen med 25 μL sterilt PBS.
- Fjern nålen fra halen og pres for at stoppe enhver blødning.
- Sluk anæstesi og observere dyret indtil helt vågen for eventuelle tegn på angst.
3. indsamling og forberedelse af Target tumor væv
- På det ønskede tidspunkt, humant aflive dyret i henhold til den acceptable institutionelle procedure, her, ved gradvis indånding af 100% Co2 fra en komprimeret gas tank med en kammer forskydning flow på 10-30% volumen/min.
Bemærk: nogle anvendelser af ivil-teknikken kræver eutanasi ved kardiel perfusion med PBS for at fjerne frit cirkulerende antistof19,22. - Efter bekræftelse af humane eutanasi via ophør af respiratorisk og hjertets bevægelse, mangel på tå knivspids respons, og grå slimhinder, punktformet tumor væv ved hjælp af kirurgisk saks og pincet som følger:
- Læg musen i liggende position og fatte kun det yderste lag af huden mellem sættet af brystkirtler tættest på halen (5th) med pincet, lav et lille snit med et par kirurgisk saks.
- Introducere den lukkede saks i snittet og langsomt åbne spidsen for omhyggeligt at adskille huden fra den underliggende abdominalvæg membran holde det intakt.
- Lav en lodret indsnit op i maven, fortsætter med at adskille huden fra den indre membran. Mellem 3Rd og 4th brystkirtler, lave en vandret snit over maven for at muliggøre tilbagetrækning af huden og visualisering af mælkekirtler.
Bemærk: mammary tumorer og kirtler er placeret overfladisk under huden. - Fatte hver tumor eller normal kirtel med tang, forsigtigt trim væk den vedlagte hud ved hjælp af kirurgisk saks.
- Placer exciseret væv i væv engangsbasis forme, propeled og fyldt med optimal skære temperatur (OCT) indlejring medium og fryse forme hurtigt ved placeringen på tøris. For at studere off-Target levering, punktafgifter andre væv eller organer af interesse (f.eks lever eller lunger).
Bemærk: for at standse protokollen på dette tidspunkt skal du opbevare frosne vævs blokke ved-80 °C, indtil du er klar til at fortsætte. - Ved hjælp af en cryostat, afsnit frosne vævs blokke ved 10 μm tykkelse og Placer tilstødende sektioner på prudlede vedhæftnings glas dias.
Bemærk: Hvis du vil afbryde protokollen på dette tidspunkt, skal du opbevare slides ved-80 °C, indtil du er klar til at fortsætte.
4. ex vivo-farvnings protokol
Bemærk: for den kvantitative sammenligning mellem Fluorescens mikroskopi billeder, er alle slides plettet på samme tid med de samme forberedte løsninger.
- Skyl frosne væv slides med stuetemperatur PBS for 5 min at fjerne OCT.
- Afgrænse vævs sektioner med en hydrofobe barriere pen for at reducere mængden af de opløsninger, der er nødvendige under farvning.
Bemærk: Vær omhyggelig med ikke at lade pennen køre over vævsprøverne, da den enten kan fjerne vævet fra diaset eller forhindre korrekt farvning på den berørte vævs portion. Lad ikke vævs sektionerne dehydrere på noget tidspunkt. - Fastgør vævs sektionerne med 4% PARAFORMALDEHYD opløsning i 5 min.
- Skyl lysbilleder i PBS i 5 min.
- Permeabilize vævs sektioner med 0,5% Triton-X 100 i PBS i 15 min.
- Skyl lysbilleder i PBS i 5 min.
- Væv med 3% w/v bovin serumalbumin (BSA) og 5% v/v gede serum, både i PBS (blokerende opløsning) i 1 h ved stuetemperatur.
Bemærk: match den blokerende opløsning serum til det sekundære antistof værtsdyret. - Skyl lysbilleder i PBS i 5 min.
- Der inkubates i sektioner med primære antistoffer, som det ønskes, muligvis en fælles nuklear (f. eks. DAPI), vaskulær (f. eks. CD31) eller cytoplasmisk markør (f. eks. actin). Her, rotte anti-Mouse CD31 (vaskulær markør) ved en 1:100 fortynding blev anvendt i henhold til producentens anvisninger i blokering løsning natten over ved 4 °C beskyttet mod dehydrering på en slide bakke.
Bemærk: Tilføj ikke yderligere primært antistof eller antistof konjugat. Konjugaten, der blev injiceret og fik lov til at ophobes i vævet in vivo, fungerer som det primære antistof. - Skyl lysbilleder i PBS i 5 min. tre gange, og Skift PBS hver gang.
- Incubate slides med sekundære antistoffer til at mærke primære antistoffer. Til denne applikation visualiserer anti-B7-H3-antistoffer ved hjælp af AlexaFluor-546 konjugeret ged anti-kanin antistof (1:200 fortynding, optimeret i henhold til producentens anvisninger) og CD31 med AlexaFluor-488 ged anti-rat sekundært antistof (1:200 fortynding, optimeret i henhold til producentens anvisninger) i blokerende opløsning, beskyttet mod lys og dehydrering på en slide bakke, for 1 h ved stuetemperatur.
Bemærk: sekundære antistoffer er fra samme værts dyr, men svarer til affiniteten af de sekundære antistoffer til værts arterne for det pågældende primære antistof. Slides er beskyttet mod lys fra dette punkt og fremefter. - Skyl lysbilleder i PBS i 5 min. tre gange, og Skift PBS hver gang.
- Påfør en dråbe af monterings mediet ind i midten af vævs skive og læg forsigtigt en dækseddel, så du undgår at blive klemte af luftbobler.
- Forsegl kanterne af dæksedlen med klar neglelak og lad den tørre.
Bemærk: Hvis du vil sætte protokollen på pause i op til en uge på dette tidspunkt, skal du gemme slides ved-20 °C, indtil du er klar til at fortsætte.
5. Konfokal mikroskopi billeddannelse og kvantitativ billedanalyse
Bemærk: klargøring af konfokale mikroskop-og billedbehandlings parametre afhænger af det anvendte konfokale system. Det mikroskop, der blev brugt her, blev købt kommercielt (f. eks. Zeiss LSM 510 meta system), og den tilhørende anskaffelses software blev anvendt (f. eks. Zen 2009). Men, mange af disse skridt vil gælde for enhver confokale mikroskop og antage grundlæggende confokal mikroskopi viden.
- Når systemet er tændt og varmet op, skal du vælge den ønskede målsætning. Her blev der anvendt en 20x (numerisk blænde = 0,8)-målsætning.
- Læg et positivt kontroldias, dækglas ned, for at gøre det muligt at indstille optimeringen for det lyseste signal. Imaging i den røde kanal, fokusere systemet på prøven i Live Imaging mode.
- For hver anvendte laser kanal optimerer du laser intensiteten, Master Gain og pinhole size som følger:
- Skift til kontinuerlig tilstand for Imaging.
- Optimer laser intensiteten (som styrer laser strømmen) og Gain (Master) (som styrer spændingen for Photomultiplier Tube) slide stænger, mens du overvåger kig op tabel (lut) histogram. Juster disse to indstillinger, indtil det dynamiske område af histogrammet er udfyldt uden at mæere pixels.
Bemærk: Hvis laser intensiteten er for høj, vil der forekomme foto blegning. Hvis Gain (Master) er for høj, vil billedet blive støjende. Ideelt set vil Gain (Master) være i midten af sit sortiment. - Indstil pinhullet til 1 luftig enhed (AU), som giver den højeste opløsning og den tyndeste z-skive.
- Skub den digitale offset bjælke for at minimere støj gulvet på lut-histogrammet for en ægte sort baggrund.
Bemærk: når mikroskopi indstillinger er optimeret for hver laser kanal og objektiv, holde dem konstant i hele Imaging session og til billeddannelse af alle dias, for at muliggøre den kvantitative sammenligning mellem slides.
- Vælg det ønskede antal og bitdybdeunder gennemsnitsberegning under fanen anskaffelses tilstand . Klik på den optimale knap for at indstille den optimale pixelstørrelse.
- Brug knappen Fastgør anskaffelse til at indsamle et billede i høj kvalitet. Her, tilfældige synsfelter blev valgt fra i tumoren, men andre områder af interesse kan gælde for forskellige applikationer (fartøjer, tumor margener, penetration dybde, etc.)
- Gem billedfiler i det format, der bruges af konfokale-softwaren (her, ". LSM") til offline behandling og kvantificering.
Bemærk: Hvis ikke alle slides er afbildet under samme session, skal du gemme indstillingerne og genindlæse dem på efterfølgende besøg, selvom det ikke anbefales at genindføre det samme dias på grund af foto blegning. - Udfør de kvantitative målinger af fluorescens intensitet. Åbne Fiji (Fiji er bare ImageJ software)19,23 og indlæse en. LSM billedfil ved at trække på statuslinjen.
- Opdel farve kanalens data. Gå til billede ≫ stakke ≫ opdelte kanaler.
- Forbehandl fluorescensbilleder efter behov, dvs fratræk baggrunds signalet (proces ≫ subtrahere baggrund) eller Reducer støjen via en filtreringsmetode.
- Segmentér den farvekanal, der svarer til referenceproteinet (vaskulære, nukleare, cellulære pletter) ved at sætte en tærskel på signal intensiteten (billede ≫ justere ≫ tærskel).
Bemærk: manuel tærskel introducerer subjektivitet i billedanalysen, derfor, ved hjælp af en automatiseret tærskel algoritme eller refererende billede histogrammer gør billedet analyseresultater mindre partisk. - Brug denne tærskel til at oprette en binær maske (proces ≫ binær ≫ Konverter til maske).
- Mål og mærk ROIs i masken (analysér ≫ Analysér partikler ≫ tjek Føj til Manager > OK).
- Anvend ROIs på den farvekanal, der svarer til antistof af interesse (Klik på kanal billede, Analysér ≫ værktøjer > ROI Manager ≫ mål). Dette vil anvende masken ROIs til antistof billedet og give billed målinger for etiket sektioner i resultatvinduet. Vinduet Gem resultater (fil ≫ Gem).
- Beregn den ønskede statistik af interesse, såsom den gennemsnitlige fluorescens intensitet som beskrevet her24.
- Udfør alle behandlingstrin, der er identiske med hvert billede, i et sæt dias. Opret en makro til automatisk at gøre dette for store billeder batches23.
- For billedvisning kun efter kvantitative målinger skal du anvende kvalitative billedjusteringer for at optimere visualisering af biofordelings mønstre ved at justere minimum, maksimum, lysstyrke og kontrast til de samme niveauer på alle slides (billede ≫ justere > Lysstyrke/kontrast).
- Konverter billedtypen (billed ≫ type > RGB-farve), og Gem filer i en billedtype med tabsfri billeder, f. eks. TIFF (fil > Gem som > TIFF...) til brug i præsentationer og publikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den IVIL metode blev brugt her til at undersøge in vivo Biodistribution og væv interaktion af B7-H3-ICG og ISO-ICG, ved at tillade agenter, efter intravenøs injektion i et levende dyr, at interagere med målvævet for 96 h, og derefter når vævene er som de primære antistoffer under ex vivo-immun farvning. IVIL-metoden blev også sammenlignet med standarden ex vivo ved farvning af vævene til B7-H3-mærket. Normale murine brystkirtler udtrykker ikke B7-H3 markør, bekræftet i ex vivo, standard, hvis farvning, og ikke ophobes antistoffer gennem andre passive mekanismer, og derfor ingen akkumulering af B7-H3-ICG eller ISO-ICG blev påvist, repræsentative negativt resultat (figur 1, øverste række). Men murine brysttumorer gør Express B7-H3 både i Vaskulaturen og epitel (som bekræftet af standard, hvis farvning), og ivil var i stand til at fremhæve den B7-H3-ICG agent, der havde akkumuleret kraftigt på Vaskulaturen og var i stand til delvist ekstravasate fra Vaskulaturen til at binde til kræftcellerne selv selv på en uensartet måde i forhold til den ensartede fordeling af B7-H3 markør i hele tumorer, også vist i figur 1, nederste række. Desuden, selv om ISO-ICG-agenten ikke har nogen Molekylær specificitet, det var stadig påvist at ophobes på en uspecifik måde, på grund af FC interaktioner, dårlig interstitiel dræning, og den forbedrede permeabilitet og retention effekt inden murine bryst tumorer (figur 1). Denne forskel er fremhævet i de biodistributions mønstre, der er vist mellem de to agenter, og forbedrer yderligere de specifikke bindende resultater af det specifikke antistof-middel og repræsenterer to mulige udfald af et positivt resultat.
De repræsentative resultater for B7-H3-ICG viser, hvordan IVIL-metoden kan anvendes som en kvalitativ metode til at beskrive generel antistof-/antistofkonjugat-Biodistribution. Der kan dog til tider være behov for en mere kvantitativ fortolkning, eller et antistof kan have meget følsom, konformations specifik bindingsevne. I disse situationer kan IVIL også give de ønskede oplysninger. I et andet eksempel, hvor ekspression af netrin-1 protein i tumor væv og dets Co-lokalisering med CD31-positiv tumor endotelet skulle undersøges, den ivil teknik blev også anvendt med succes19.
Netrin-1 er et udskilt 65 kDa protein, som er over-udtrykt i visse typer af kræft, såsom metastatisk brystkræft25,26. For at udvikle en molekylær billedbehandlings metode for netrin-1, måtte in vivo tilgængeligheden af proteinet bestemmes19. Også, da anti-netrin-1-antistoffet ikke har tilstrækkelig affinitet til dets antigen efter vævs fiksering, en alternativ farvnings protokol til klassisk immunhistokemi, eller hvis farvning var påkrævet, og IVIL blev implementeret. Humaniseret anti-netrin-1 antistof og et humant IgG isotype Control antistof blev intravenøst injiceret 24 timer før hjerte perfusion og tumor samling. Kardiel perfusion blev anvendt til at reducere uspecifik baggrunds farvning i Vaskulaturen og til at forbedre påvisning af signifikant anti-netrin-1-antistof akkumulering i sammenligning med isotype Control-antistof signalet, når målekspressionen er begrænset. Tumor sektioner blev mærket ex vivo med Vaskulaturen fremhævning anti-CD31 antistof (rotte anti-mus CD31 antistof (tabel over materialer) og fluorescerende sekundære antistoffer, Alexa 488-koblede ged anti-rotte IgG, 1:500 fortynding og Alexa fluor 594- den koblede ged anti-humane IgG, 1:500 fortynding henholdsvis) blev brugt til at afsløre anti-netrin-1/isotype og anti-CD31 mAbs. Fluorescens signalet intensiteter af anti-netrin-1 og isotype Control antistof blev kvantificeret for at bestemme forskelle i farvning Co-lokaliseret med CD31. Figur 2 viser, at anti-netrin-1 antistof specifikt akkumuleret i epitelial tumor rum af MMTV-pymt brysttumorer (et positivt resultat), mens der ikke var noget signal i normal brystkirtler (et negativt resultat). Antistoffet blev yderligere lokaliseret sammen med endotel markør CD31. Sammenligning med isotype antistof-injicerede tumorer og normale kirtler viste, at epitelial ophobning var specifik for tumorvævet. Der var signal ophobning i endotelcellerne af både tumorer og normale kirtler på grund af netrin-1 binding (tumorer) og ikke-specifikke FC interaktioner (tumorer og normale brystkirtler)11. Således var fluorescens signal kvantificering ved hjælp af en CD31-baseret binær maske påkrævet og påvist, at anti-netrin-1-antistof signalet var signifikant højere end isotype Control-antistof signalet i tumorvævet, hvilket tyder på netrin-1 specifikt akkumuleret i tumorendothelium.
Figur 1 : Repræsentative konfokale mikrografer over sammenligningen af specifikke B7-H3 antistof-ICG konjugat og uspecifik isotype Control antistof-ICG konjugat lokalisering i murine brystkirtler indeholdende normal eller karcinom væv. (Top) Normal murine brystkirtler fra et dyr intravenøst injiceres med 33 μg ISO-ICG eller B7-H3-ICG (rød) og Counter-plettet med CD31 (grøn) viser ingen farvning af antistof konjugater. Normale væv viste sig ikke at have et udtryk for B7-H3 ved standard ex vivo ved farvning. (Nederst) Invasive brysttumorer fra et dyr intravenøst injiceres med 33 μg B7-H3-ICG eller ISO-ICG (rød) og vaskulære Counter-Stained CD31 (grøn), der viser omfattende, heterogene farvning, men med forskellige distributionsmønstre, for både B7-H3-ICG og ISO-ICG-agenter. B7-H3-ICG binder sig stærkt til Vaskulaturen, det første kontaktpunkt in vivo, og derefter er i stand til at ekstravasere fra Vaskulaturen til heterogene plettere tumor epitelet. ISO-ICG viser ikke-specifik akkumulering i tumorvævet. Standard ex vivo hvis farvning viser ensartet ekspression af B7-H3 markør på epitelial og endotelceller. Gul farve indikerer Co-lokaliseret rødt og grønt kanal signal. Scale bar er 100 μm og konsistent mellem paneler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : In vivo immuno-lokalisering af netrin-1 i MMTV-PyMT Brystkirtler tumorer. (Venstre) Repræsentative konfokale mikrografer af IVIL-metoden til påvisning af netrin-1-ekspression (rød) eller isotype-kontrol udtryk (rød) i murine karcinom og normale brystkirtler. IVIL bekræfter epitelial signal for netrin-1 i MMTV-PyMT tumorer, men ikke i normale brystkirtler, og stærkt netrin-1 signal på endotelceller (CD31 farvning, grøn) i brysttumorer og signifikant svagere signal af netrin-1 i normal brystkirtler. Gul farve indikerer Co-lokaliseret rødt og grønt kanal signal. Skala stænger indikerer 20 μm. Til påvisning af netrin-1 protein i tumor endotelet blev 100 μg primær humaniseret NET1-H-mAb eller 100 μg humant IgG isotype Control antistof intravenøst injiceret 24 timer før tumor opsamling. Frit cirkulerende antistof blev fjernet ved kardiel perfusion med PBS og tumor væv blev isoleret, flash frosset, og skåret ved 15 μm tykkelse på en kryostat. Endotelceller blev mærket med primære rotte anti-Mouse CD31 antistof efterfulgt af sekundær Alexa 488-koblede ged anti-rotte IgG. For at afsløre den primære antistof målretning netrin-1, sekundær Alexa fluor 594-koblede ged anti-humant IgG blev brugt. For at undgå uspecifik interaktion af ged sekundære antistoffer, vævsprøver blev blokeret med ged serum. (Højre) Søjlediagram, der fremhæver kvantificeringen af anti-netrin-1-eller isotype Control-antistof signal, som colocalizes med anti-CD31-antistof signal. N = 13 tumorer (af to mus) pr. gruppe af MMTV-PyMT og N = 7 brystkirtler (af en mus) pr. gruppe af normale kirtler; Fejllinjer nuværende SEM; To-gruppe sammenligninger blev udført med elevens t-test. Figur genoptrykt med tilladelse fra 19 under Creative Commons License CC af 4,0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode har flere kritiske trin og kræver potentielle ændringer for at sikre en vellykket implementering. For det første skal dosering og timing af antistof/antistof konjugat intravenøs injektion skræddersys til den specifikke applikation. Generelt, doser bør anvendes, der er i overensstemmelse med, hvordan antistof konjugat vil typisk blive brugt, dvs matchende doser af det terapeutiske antistof eller antistof-baserede kontrastmiddel. Desuden bør tidspunktet for indsamlingen af målvæv overvejes nøje. Antistoffer og antistofkonjugater har længere cirkulations tider end standard stoffer og kontrastmidler, men disse er meget variable og bør optimeres til den ønskede applikation, men det anbefales at tillade mindst 24 timers cirkulations tidspunkt27 . For det andet, under målvævs samlingen, kan det være nødvendigt at implementere en intrakardiel perfusions teknik for at fjerne frit cirkulerende antistof fra blod puljen19. Mens man ser på tumor fordeling af B7-H3-ICG, det blev fundet unødvendig på grund af tilstrækkelig lang cirkulation gange (96 h) og den ekstravaskulære lokalisering af agenten. For netrin-1-anvendelsen af IVIL-metoden blev kardiel perfusion imidlertid anset for at være relevant på grund af det endoteliale udtryk af netrin-1 og dets relativt lave ekspressionsniveau. For det tredje er det i forbindelse med ex vivo-vævs farvning bydende nødvendigt at plette alle slides, der vil blive sammenlignet kvantitativt under samme session og med de samme opløsninger for at forhindre normale variationer mellem batch. Sørg for, at lysbilleder skylles korrekt mellem trinene, og at hydrofobe pennen ikke kommer i kontakt med vævet for at undgå suboptimal farvning. Endelig, under Konfokal mikroskopi, opretholde de samme billeddannelse indstillinger mellem slides at give mulighed for relativ kvantificering og arbejde hurtigt for at forhindre foto blegning af slides. Disse centrale punkter vil øge sandsynligheden for en vellykket IVIL-gennemførelse.
Der er flere fordele ved IVIL-metoden. For det første, mens metoden svarer til standarden, hvis teknikker, de to giver væsentligt forskellige oplysninger. Hvis farvning indikerer den anatomiske placering af molekylære markører i væv på et givet tidspunkt (når vævet blev indsamlet og fast). IVIL giver dog oplysninger om, hvordan et antistof eller antistof konjugat, som påvist ved lokalisering af B7-H3-ICG, distribuerer og interagerer, hvad enten det er specifik eller ikke-specifik akkumulering, internalisering eller fastholdelse i målet Væv. Dette er afgørende for farmakokinetiske/dynamiske og biodistributionerundersøgelser. For det andet traditionelle, hvis metoder til tider begrænses ved fiksering af vævet, som kan forårsage antigen forvrængning eller maskering, der forhindrer binding af det primære antistof28. Derfor kan IVIL være nyttig, når det er standard, hvis farvning eller Immunhistokemi mislykkes. IVIL-teknikken kan betragtes som en komplementær metode til at verificere in vivo-antistof aktivitet, som ellers ville være målbart. Endelig, dem bekendt med traditionelle, hvis farvning teknikker vil finde metoden ligetil i udførelsen og vil have de fleste af de nødvendige materialer på hånden.
IVIL-metoden har nogle få begrænsninger. For det første, på grund af nødvendigheden af at aflive dyret til at høste målvæv, ivil kun giver biologisk interaktion oplysninger på et enkelt tidspunkt. Injektion af det primære antistof eller antistof konjugat på varierende tidspunkter i forskellige dyr vil give mulighed for en bredere tidsvindue af oplysninger om Biodistribution og in vivo interaktion. For det andet, hvis brugerne ikke er bekendt med in vivo dyre teknikker, såsom intravenøs hale vene injektion eller potentiel intrakardiel perfusion, dette kan være en begrænsning til metoden. Disse metoder kræver faglært personale til at udføre pålideligt. Brug af et kateter under injektion af hale vene sikrer dog, at hele dosen administreres, da korrekt placering af nålen kan bekræftes inden injektionen. Derudover, et alternativ til hale vene injektion, der kan overvejes, er retro-orbital injektion, som typisk har en højere succesrate med mindre erfarne personale. Behovet for at plette og billede alle væv glider i samme parti for at muliggøre kvantitativ vurdering begrænser antallet af prøver og markører, der kan indgå i en enkelt undersøgelse. Undersøgelsen kan være nødvendigt at organiseres i seriel farvning på forskellige dage og på tilstødende væv skiver til at indsamle de ønskede oplysninger. Endelig rejser brugen af arter-matchede antistoffer, dvs murine anti-mus antistoffer i murine prækliniske modeller, et problem med ikke-specifik baggrunds farvning med sekundære antistoffer. Det er derfor nødvendigt at anvende arter-uoverensstemmende primære antistoffer som præsenteret i denne undersøgelse, eller fluorescently mærkede Arts matchede primære antistoffer skal anvendes.
Den IVIL teknik er nyttig til Biodistribution analyse af diagnostiske og terapeutiske antistoffer for mange anvendelser. Forskellige anvendelser for intravenøs antistof eller ligand injektion og ex vivo vævsanalyse er tidligere blevet rapporteret og bekræfter interessen for at introducere denne farvnings procedure bredt. Robertson og kolleger mærkede vaskulære elementer såsom endotel kapillærer og større fartøjer med intravenøse injektioner af Lycopersicon esculentum kold (tomat Lectin)29. Teknikken var kompatibel med histochemistry og immuncytokemi og afslørede vaskulære mønstre og funktionelle parentchymal egenskaber. Men brugen af fluorescerende ligander var begrænset af den hurtige nedbrydning af fluorescens ved injektion30. Som påvist i IVIL-protokollen kan injektion af et primært antistof in vivo efterfulgt af ex vivo-mærkning med et sekundært fluorescerende antistof være en mere robust tilgang. En anden interessant anvendelse af denne type in vivo, hvis farvning er mærkningen af intravaskulære lymfocytter som påvist af Anderson og kolleger31. Intravenøst injiceret antistof blev anvendt til at mærke lymfocytter lokaliseret i blodkar, som efterfølgende blev indsamlet og yderligere forarbejdet til flow cytometri analyse af immunologiske markører. Endelig blev der foretaget en første undersøgelse af antistof fordelingen ved hjælp af systemisk behandling for at vurdere leveringen og den histologiske lokalisering af antistof terapeutisk behandling, som blev leveret til patienter med planocellulært karcinom i hoved-og hals celler (HNSCC). administreret nær-infrarød fluorescently mærket terapeutisk antistof cetuximab-IRDye800CW32. Dataene blev sammenlignet med histologiske analyser og viste, at det fluorescerende signal faldt med afstanden fra tumoren, der bekræfter specificiteten. Selv om det terapeutiske antistof ikke nåede alle regioner af antigen udtryk, især de veldifferentierede tumor regioner med høje niveauer af epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) antigen. I den nuværende sammenhæng med kræftforskning med fokus på udvikling af målrettede terapier og immunoterapi, som støder på stærk modstand og manglende effektivitet, ville ivil metode være et glimrende værktøj til at studere fordelingen af terapeutiske antistoffer PD-1/PD-L-1 eller HER233,34. Disse resultater er yderst værdifulde for at forstå, hvorfor målrettede terapier er effektive i visse tilfælde fremme udviklingen af nye tilgange. Tilsammen fremhæver disse eksempler den potentielle betydning af IVIL-tilgangen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy service) for diskussioner og udstyr brug. Vi takker Dr. Juergen K. Willmann for hans mentorordning. Denne undersøgelse blev støttet af NIH R21EB022214 Grant (KEW), NIH R25CA118681 uddannelse Grant (Kew) og NIH K99EB023279 (KEW). Den Stanford Neuroscience Microscopy service blev støttet af NIH NS069375.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
| Indocyanine Green - NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
| Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
References
- Forthal, D. N.
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Lonberg, N., et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).
- McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).
- Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
- Kircher, M. F., Willmann, J. K. Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles. Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).
- Fleuren, E. D. G., et al.
- Forsström, B., Bisławska Axnäs, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).
- Brooks, J. D. Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers. Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).
- Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease. The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M.
- Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
- Freise, A. C., Wu, A. M. In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments. Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).
- Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival. Cancer Research. 78 (3), 758-768 (2018).
- Wilson, K. E., et al. Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent. Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).
- Wischhusen, J., et al. Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer. Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bachawal, S. V., et al. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Research. 73, 1689-1698 (2013).
- Fitamant, J., et al. Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Ryman, J. T., Meibohm, B.
- Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Chen, C. Y., et al. Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels. The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- de Boer, E., et al. In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 5, (2015).
- Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors. British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).
- Rexer, B. N., Arteaga, C. L. Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications. Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).
