Summary
Il metodo di localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo (IVIL) può essere utilizzato per esaminare la biodistribuzione in vivo di anticorpi e jujuganti anticorpi per scopi oncologici negli organismi viventi utilizzando una combinazione di targeting per tumori in vivo ed immunostaining ex vivo Metodi.
Abstract
Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono strumenti importanti per il rilevamento, la diagnosi e il trattamento del cancro. Essi sono utilizzati per svelare il ruolo delle proteine nella tumorigenesi, possono essere diretti a biomarcatori tumorali che consentono il rilevamento e la caratterizzazione del tumore, e possono essere utilizzati per la terapia del cancro come mAbs o coniugati anticorpale-farmaco per attivare le cellule eftuali immunitarie, per inibire le cellule eftori immunitarie, per inibire le cellule eftuali immunitarie, per inibire le cellule efiloriche immunitarie, per inibire le cellule echeologiche immunitarie, per inibire le cellule ebrasive immunitarie vie di segnalazione, o uccidere direttamente le cellule che trasportano l'antigene specifico. Nonostante i progressi clinici nello sviluppo e nella produzione di nuovi e altamente specifici mAb, le applicazioni diagnostiche e terapeutiche possono essere compromesse dalla complessità e dall'eterogeneità del microambiente tumorale. Pertanto, per lo sviluppo di terapie e diagnostica efficienti basate su anticorpi, è fondamentale valutare la biodistribuzione e l'interazione del coniugato basato sugli anticorpi con il microambiente tumorale vivente. Qui, descriviamo in Vivo immunofluorescenza localizzazione (IVIL) come un nuovo approccio per studiare le interazioni di terapie e diagnostica basate su anticorpi nelle condizioni fisiologiche e patologiche in vivo. In questa tecnica, un anticorpo terapeutico o diagnostico specifico dell'antigene viene iniettato per via endovenosa in vivo e localizzato ex vivo con un anticorpo secondario in tumori isolati. IVIL, quindi, riflette la biodistribuzione in vivo di farmaci anticorpi e agenti di targeting. Due applicazioni IVIL sono descritte valutando la biodistribuzione e l'accessibilità degli agenti di contrasto basati su anticorpi per l'imaging molecolare del cancro al seno. Questo protocollo permetterà agli utenti futuri di adattare il metodo IVIL per le proprie applicazioni di ricerca basate su anticorpi.
Introduction
Gli anticorpi monoclonali (mAb) sono grandi legocoproteine (circa 150 kDa) della superfamiglia immunoglobulina che sono secreti dalle cellule B e hanno una funzione primaria nel sistema immunitario per identificare e inibire la funzione biologica di, o segnare per distruzione, patogeni batterici o virali, e può riconoscere l'espressione anomala delle proteine sulle cellule tumorali1. Gli anticorpi possono avere un'affinità estremamente elevata con i loro epitopi specifici fino alle concentrazioni di femtomolare, rendendoli strumenti molto promettenti in biomedicina2. Con lo sviluppo della tecnologia dell'ibrido da parte di Milstein e del Kohler (premiato con il Premio Nobel nel 1984), la produzione di mAbs divenne possibile3 . Più tardi, mAbs umani sono stati generati utilizzando la tecnologia di visualizzazione fago o ceppi di topi transgenici e ha rivoluzionato il loro uso come nuovi strumenti di ricerca e terapie4,5.
Il cancro è un problema di salute mondiale e una delle principali cause di morte, creando la necessità di nuovi approcci per la prevenzione, la scoperta e la terapia6. Ad oggi, gli mAb hanno permesso l'estricazione del ruolo dei geni e delle loro proteine nella tumorigenesi e quando sono diretti contro i biomarcatori del cancro, possono consentire la rilevazione e la caratterizzazione del tumore per la stratificazione del paziente. Per la terapia del cancro, vengono sviluppati i coniugati bispecifici, i coniugati anticorpo-farmaco e i frammenti di anticorpi più piccoli come terapie, e per la somministrazione mirata di farmaci per migliorare l'efficacia terapeutica7. Inoltre, gli anticorpi servono per il biomarcatore mirato di agenti di contrasto per le modalità di imaging molecolare come la chirurgia a fluorescenza, l'imaging fotoacustico (PA), l'imaging molecolare degli ultrasuoni (US) e l'emissione di positroni clinicamente utilizzati tomografia (PET) o tomografia computerizzata a emissione di singoli fotoni (SPECT)8. Infine, gli anticorpi possono essere utilizzati anche come agenti tenetici che consentono la stratificazione dei pazienti e il monitoraggio della risposta per le terapie mirate9. Pertanto, nuovi mAbs stanno cominciando a svolgere un ruolo fondamentale nella diagnosi, diagnosi, e trattamento del cancro.
Nonostante i progressi critici nello sviluppo e nella produzione di mAb nuovi e altamente specifici, le applicazioni diagnostiche e terapeutiche possono essere rese inefficaci a causa della complessità dell'ambiente tumorale. Le interazioni anticorpali dipendono dal tipo di epitopo, cioè,se è lineare o conformazionale10. Oltre al riconoscimento degli antigeni, gli anticorpi devono superare le barriere naturali come le pareti del vaso, le membrane basali e lo stroma tumorale per raggiungere le cellule bersaglio che esprimono l'antigene. Gli anticorpi interagiscono con il tessuto non solo attraverso il dominio di legame dell'antigene a frammento variabile (Fab), ma anche attraverso il costante frammento cristallino (Fc) che porta ulteriormente alle interazioni fuori sede11. Il targeting è complicato anche dall'espressione eterogenea dei marcatori tumorali in tutta la massa tumorale e l'eterogeneità nella vascolarizzazione tumorale e dal sistema linfatico12,13. Inoltre, il microambiente tumorale è composto da fibroblasti associati al cancro che supportano le cellule tumorali, le cellule immunitarie tumorali che sopprimono le reazioni immunitarie anti-tumorali e l'endotelio tumorale che supporta il trasporto di ossigeno e sostanze nutritive, tutti che interferiscono con la penetrazione, la distribuzione e la disponibilità di terapie o diagnostica basate su anticorpi. Nel complesso, queste considerazioni possono limitare l'efficacia terapeutica o diagnostica, ridurre la risposta al trattamento, e può provocare resistenza al tumore.
Pertanto, per lo sviluppo di terapie e diagnostica efficienti basate su anticorpi, è fondamentale valutare la biodistribuzione e l'interazione del coniugato basato sugli anticorpi all'interno del microambiente tumorale. Attualmente, negli studi preclinici, l'espressione dei marcatori nei modelli di ricerca sul tumore viene analizzata ex vivo per colorazione immunofluorescenza (IF) delle sezioni tumorali14. La colorazione SE standard viene eseguita con anticorpi specifici del marcatore primario che vengono poi evidenziati da anticorpi secondari fluorescenti etichettati su fette di tessuto tumorale ex vivo che sono stati isolati dall'animale. Questa tecnica evidenzia la posizione statica del marcatore al momento della fissazione dei tessuti e non fornisce informazioni su come le terapie o la diagnostica basati su anticorpi potrebbero distribuire o interagire in condizioni fisiologiche. L'imaging molecolare di PET, SPECT, US e PA può fornire informazioni sulla distribuzione dell'agente di contrasto coniugato con anticorpi nei modelli preclinici viventi8,15. Poiché queste modalità di imaging non sono invasive, è possibile eseguire studi longitudinali e raccogliere dati sensibili al tempo con un numero minimo di animali per gruppo. Tuttavia, questi approcci di imaging molecolare non invasivo non sono abbastanza sensibili e non hanno una risoluzione sufficiente per la localizzazione della distribuzione degli anticorpi a livello cellulare. Inoltre, le caratteristiche fisiche e biologiche dell'anticorpo primario possono essere drasticamente modificate dalla coniugazione di un agente di contrasto16.
Al fine di prendere in considerazione le condizioni fisiologiche e patologiche in vivo di come le terapie e la diagnostica basate su anticorpi interagiscono all'interno dell'ambiente tumorale e per ottenere una distribuzione cellulare e persino subcellulare ad alta risoluzione profili di anticorpi non coniugati, proponiamo un approccio IF, ritenuto In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL), in cui l'anticorpo specifico dell'antigene viene iniettato per via endovenosa in vivo. La terapia o diagnostica basata su anticorpi, agendo come anticorpo primario, circola nei vasi sanguigni funzionali e si lega alla proteina bersaglio nell'ambiente tumorale vivo e altamente accurato. Dopo l'isolamento dei tumori in vivo con l'anticorpo primario, viene utilizzato un anticorpo secondario per localizzare i coniugati degli anticorpi accumulati e conservati. Questo approccio è simile a un approccio di istologia IF descritto in precedenza iniettando anticorpi fluorescenti17. Anche se qui, l'uso di anticorpi non coniugati evita un potenziale cambiamento nelle caratteristiche di biodistribuzione indotte dalla modifica dell'anticorpo. Inoltre, l'applicazione ex vivo dell'anticorpo secondario fluorescente evita una possibile perdita di segnale di fluorescenza durante la raccolta e l'elaborazione dei tessuti e fornisce amplificazione dell'intensità del segnale di fluorescenza. Il nostro approccio di etichettatura riflette la biodistribuzione in vivo di farmaci basati su anticorpi e agenti mirati e può fornire importanti informazioni per lo sviluppo di nuovi agenti diagnostici e terapeutici.
In questo articolo, descriviamo due applicazioni del metodo IVIL applicate in studi precedenti che studiano la biodistribuzione e l'accessibilità degli agenti di contrasto basati su anticorpi per gli approcci di imaging molecolare per il rilevamento del cancro al seno. In primo luogo, la biodistribuzione di un controcorpo a raggi infrarossi vicino a un anticorpo (anticorpo anti-B7-H3 legato al colorante a fluorescenza infrarossa vicino, al verde indocianina, B7-H3-ICG) e all'agente di controllo isotipo (Iso-ICG) per la fluorescenza e la fotoacustica molecolare l'imaging è esplorato18. Il metodo di questa applicazione è descritto nel protocollo. Successivamente, i risultati della biodistribuzione di un anticorpo conformazionalmente sensibile al netrin-1, in genere non rilevabili con l'imaging TRADIZIONALE IF, utilizzato con imaging molecolare ad ultrasuoni, vengono quantificati e presentati nei risultati rappresentativi19. Al termine di questo documento di protocollo, i lettori dovrebbero sentirsi a proprio agio nell'adottare il metodo IVIL per le proprie applicazioni di ricerca basate su anticorpi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Institutional Administrative Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) della Stanford University.
1. Modello murino transgenico dello sviluppo del cancro al seno
- Osservare i topi dal modello di cancro desiderato per la crescita tumorale appropriata tramite la palpazione o la misurazione della pinza prima di procedere.
NOTA: Qui è stato utilizzato il modello murino transgenico dello sviluppo del cancro al seno (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT). Questi animali sviluppano spontaneamente carcinomi mammari invasivi tra 6 e 12 settimane di età in ogni ghiandola mammaria20. Le normali ghiandole mammarie sono state usate come controlli dai compagni di cucciolata transgenici-negativi e abbinati all'età.
2. Iniezione endovenosa di agenti anticorpi specifici e non specifici
- Purificare gli anticorpi di controllo dell'isotipo antitomouse B7-H3 e coniglio IgG su una colonna di depurazione (ad esempio, PD-10) per rimuovere conservanti e buffer di stoccaggio seguendo le istruzioni del produttore.
NOTA: Alcuni anticorpi potrebbero aver bisogno di un'ulteriore purificazione con il protocollo21basato su perline di agarose proteiche-agarose. - Dosaggi di aliquota di 33 g di ogni anticorpo coniugati in singoli tubi di microcentrifuga.
NOTA: Il dosaggio dell'agente somministrato può variare a seconda dell'applicazione e corrisponde ai dosaggi in cui viene utilizzato regolarmente il coniugato anticorpo. La concentrazione delle soluzioni anticorpali è necessaria se il volume è superiore a 100 -L per la sicurezza degli animali. - Nel punto di tempo desiderato prima della raccolta dei tessuti, qui 96 h, anestesizzare l'animale che porta il tumore con 2% isoflurane che scorre in ossigeno a 2 L/min, e posto su uno stadio riscaldato 37 gradi centigradi. Fare un pizzico di dita dei dei impitori per assicurarsi che il livello corretto di anestesia è stato raggiunto prima della procedura.
- Per preparare l'inoculazione della vena della coda delle soluzioni anticorpali, disinfettare la coda dell'animale asciugandosi tre volte con una salvietta alcolica. Dilatare le vene della coda riscaldandosi con un pad termico per circa 30 s. Evitare di riscaldare l'intero animale. Pulire nuovamente la coda con una pulizia dell'alcool dopo aver rimosso il pad termico.
- Utilizzando un catetere della vena della coda 27G, inserire l'ago della farfalla in una delle due vene laterali della coda e fissare con attenzione la coda con l'ago inserito allo stage con un pezzo di nastro chirurgico.
NOTA: il riflusso visibile del sangue nel catetere indica la corretta posizione dell'ago all'interno della vena posteriore. - Sciacquare il catetere con 25 o più luna di salina tampinatato sterile di fosfato (PBS), quindi iniettare la soluzione anticorpale nel catetere utilizzando siringhe di insulina. Sciacquare ancora una volta il catetere con 25 gradi di PBS sterile.
- Rimuovere l'ago dalla coda e applicare la pressione per fermare qualsiasi sanguinamento.
- Spegnere l'anestesia e osservare l'animale fino a quando completamente sveglio per eventuali segni di angoscia.
3. Raccolta e preparazione dei tessuti tumorali bersaglio
- Nel momento desiderato, eutanasia umanamente l'animale secondo la procedura istituzionale accettabile, qui, per graduale inalazione di 100% CO2 da un serbatoio di gas compresso con una portata di spostamento camera del 10-30% volume / min.
NOTA: Alcune applicazioni della tecnica IVIL richiedono eutanasia per perfusione cardiaca con PBS per rimuovere liberamente circolante anticorpo19,22. - Dopo la conferma dell'eutanasia umana attraverso la cessazione del movimento respiratorio e cardiaco, la mancanza di risposta ai pizzicamenti dei dita dei formici e l'ingrigimento delle membrane mucose, le accise dei tessuti tumorali che utilizzano forbici chirurgiche e pinze come segue:
- Posare il topo in posizione supina e afferrando solo lo strato esterno della pelle tra l'insieme di ghiandole mammarie più vicine alla coda (5th) con pinze, fare una piccola incisione con un paio di forbici chirurgiche.
- Introdurre le forbici chiuse nel taglio e aprire lentamente la punta per separare con attenzione la pelle dalla membrana della parete addominale sottostante mantenendola intatta.
- Fare un'incisione verticale sull'addome, continuando a separare la pelle dalla membrana interna. Tra le ghiandole mammarie 3rd e 4th, fare un taglio orizzontale attraverso l'addome per consentire la retrazione della pelle e la visualizzazione delle ghiandole mammarie.
NOTA: Tumori mammari e ghiandole si trovano superficialmente sotto la pelle. - Afferrando ogni tumore o ghiandola normale con pinze, tagliare con cura la pelle attaccata utilizzando forbici chirurgiche.
- Posizionare i tessuti eccitati in stampi di base monouso dei tessuti, preetichettati e riempiti con una temperatura di taglio ottimale (OCT) incorporando il mezzo e congelare rapidamente gli stampi posizionandosi sul ghiaccio secco. Al fine di studiare la somministrazione off-target, accise altri tessuti o organi di interesse(adesempio, il fegato o i polmoni).
NOTA: Per sospendere il protocollo a questo punto, conservare i blocchi di tessuto congelato a -80 gradi fino a quando non è pronto per procedere. - Utilizzando un criostato, la sezione blocchi di tessuto congelato a 10 m di spessore e posizionare sezioni adiacenti su vetrini di vetro di adesione preetichettati.
NOTA: Per sospendere il protocollo a questo punto, conservare le diapositive a -80 gradi centigradi fino a quando non si è pronti per procedere.
4. Protocollo di colorazione ex vivo
NOTA: Per il confronto quantitativo tra immagini di microscopia a fluorescenza, tutte le diapositive sono macchiate contemporaneamente con le stesse soluzioni preparate.
- Sciacquare i vetrini con tissuma con temperatura ambiente PBS per 5 min per rimuovere lo OCT.
- Delimitare le sezioni del tessuto con una penna a barriera idrofobica per ridurre il volume delle soluzioni necessarie durante la colorazione.
NOTA: Fare attenzione a non lasciare che la penna venga eseguita sui campioni di tessuto in quanto può rimuovere il tessuto dal vetrino o impedire una corretta colorazione sulla porzione di tessuto interessata. Non permettere alle sezioni del tessuto di disidratarsi in qualsiasi punto. - Fissare le sezioni di tessuto con soluzione di paraformaldeide del 4% per 5 min.
- Risciacquare i vetrini in PBS per 5 min.
- Permeabilizzare le sezioni di tessuto con 0.5% Triton-X 100 in PBS per 15 min.
- Risciacquare i vetrini in PBS per 5 min.
- Bloccare i tessuti con 3% w/v bovine serum albumin (BSA) e 5% v/v siero di capra, entrambi in PBS (soluzione di blocco) per 1 h a temperatura ambiente.
NOTA: Abbinare il siero della soluzione di blocco all'animale ospite dell'anticorpo secondario. - Risciacquare i vetrini in PBS per 5 min.
- Incubare sezioni con anticorpi primari di registrazione come desiderato, possibilmente un nucleare comune (ad esempio, DAPI), vascolare (ad esempio, CD31), o marcatore citoplasmico (ad esempio, actina). Qui, il ratto anti-topo CD31 (marcatore vascolare) a una diluizione 1:100 è stato utilizzato secondo le istruzioni del produttore nella soluzione di blocco durante la notte a 4 gradi centigradi protetta dalla disidratazione su un vassoio di scorrimento.
NOTA: Non aggiungere ulteriori anticorpi primari o coniugati di anticorpi. Il coniugato che è stato iniettato e permesso di accumularsi nei tessuti in vivo agiscono come anticorpo primario. - Risciacquare i vetrini in PBS per 5 min tre volte, cambiando ogni volta il PBS.
- Incubare i vetrini con anticorpi secondari per etichettare gli anticorpi primari. Per questa applicazione, visualizzare anticorpo anti-B7-H3 utilizzando AlexaFluor-546 vaccino anti-coniglio capra coniugato (1:200 diluizione, ottimizzato secondo le istruzioni del produttore) e CD31 con AlexaFluor-488 anti-ratto anti-ratto anti-ratto anticorpo (1:200 diluizione, ottimizzata secondo le istruzioni del produttore) nella soluzione di blocco, protetta dalla luce e dalla disidratazione su un vassoio di scorrimento, per 1 h a temperatura ambiente.
NOTA: gli anticorpi secondari provengono dallo stesso animale ospite, ma corrispondono all'affinità degli anticorpi secondari con le specie ospiti del rispettivo anticorpo primario. I vetrini sono protetti dalla luce da questo punto in poi. - Risciacquare i vetrini in PBS per 5 min tre volte, cambiando ogni volta il PBS.
- Applicare una goccia del supporto di montaggio al centro della fetta di tessuto e posizionare con attenzione un coverslip evitando l'intrappolamento di bolle d'aria.
- Sigillare i bordi della coverslip con smalto trasparente e lasciare asciugare.
NOTA: Per sospendere il protocollo fino a una settimana a questo punto, conservare le diapositive a -20 gradi centigradi fino a quando non si è pronti per procedere.
5. Imaging di microscopia confocale e analisi quantitativa delle immagini
NOTA: la preparazione del microscopio confocale e dei parametri di imaging dipenderà dal sistema confocale utilizzato. Il microscopio utilizzato qui è stato acquistato commercialmente (ad esempio, il sistema Meta LSM 510) e il software di acquisizione associato è stato utilizzato (ad esempio, zen 2009). Tuttavia, molti di questi passaggi si applicheranno a qualsiasi microscopio confocale e assumeranno conoscenze di microscopia confocale di base.
- Dopo che il sistema è stato acceso e riscaldato, selezionare l'obiettivo desiderato; qui è stato utilizzato un obiettivo 20x (apertura numerica - 0,8).
- Caricare una diapositiva di controllo positiva, coverslip verso il basso, per consentire l'impostazione dell'ottimizzazione per il segnale più luminoso. Imaging nel canale rosso, focalizzare il sistema sul campione in modalità Live imaging.
- Per ogni canale laser utilizzato, ottimizzare l'intensità del laser, il guadagno principale e la dimensione del foro stenopeico come segue:
- Passare alla modalità Continua per l'imaging.
- Ottimizzare l'intensità laser (che controlla la potenza laser) e guadagno (Master) (che controlla la tensione per tubo fotomoltiplicatore) barre di scorrimento durante il monitoraggio dell'istogramma look Up Table (LUT). Regolare queste due impostazioni fino a quando l'intervallo dinamico dell'istogramma non viene riempito senza saturare i pixel.
NOTA: Se l'intensità del laser è troppo alta, si verificherà il fotosbleaching. Se il guadagno (Maestro) è troppo alto, l'immagine diventerà rumorosa. Idealmente, il guadagno (Maestro) sarà al centro della sua gamma. - Impostare il foro stenopeico su 1 unità ariosa (AU), che dà la massima risoluzione e la più sottile z-slice.
- Far scorrere la barra Scostamento digitale per ridurre al minimo il rumore del rumore sull'istogramma LUT per un vero sfondo nero.
NOTA: una volta che le impostazioni di microscopia sono ottimizzate per ogni canale laser e obiettivo, mantenerle costanti per tutta la sessione di imaging e per l'imaging di tutti i vetrini, per consentire il confronto quantitativo tra le diapositive.
- Nella scheda Modalità acquisizione, in Media,selezionare il numero e la profondità di bitdesiderati. Fare clic sul pulsante Ottimale per impostare le dimensioni ottimali in pixel.
- Utilizzare il pulsante di acquisizione Snap per raccogliere un'immagine di alta qualità. Qui, campi di vista casuali sono stati selezionati dall'interno del tumore, ma altre aree di interesse possono applicarsi per diverse applicazioni (vasi, margini tumorali, profondità di penetrazione, ecc.)
- Salvare i file di immagine nel formato utilizzato dal software confocal (qui, ".lsm") per l'elaborazione offline e la quantificazione.
NOTA: se non tutte le diapositive vengono fotografate durante la stessa sessione, salvare le impostazioni e ricaricarle nelle visite successive, anche se non è consigliabile ricreare l'immagine della stessa diapositiva a causa del fotosbiancamento. - Eseguire le misurazioni dell'intensità quantitativa di fluorescenza. Aprire Fiji (Fiji Is Just ImageJ software)19,23 e caricare un file di immagine .lsm trascinando sulla barra di stato.
- Dividere i dati del canale a colori. Passare a Immagine > Pile > Dividi canali.
- Pre-elaborare le immagini a fluorescenza in base alle esigenze, ovvero sottrarre il segnale di sfondo (Processo > Sottrai sfondo) o ridurre il rumore tramite un metodo di filtraggio.
- Segmentare il canale di colore corrispondente alla proteina di riferimento (vascolare, nucleare, macchia cellulare) impostando una soglia sull'intensità del segnale (Immagine > Regola > Soglia).
NOTA: la soglia manuale introduce la soggettività nell'analisi dell'immagine, pertanto, l'utilizzo di un algoritmo di soglia automatico o il riferimento agli istogrammi dell'immagine rende i risultati dell'analisi dell'immagine meno di parte. - Utilizzare questa soglia per creare una maschera binaria (Processo > Binario > Converti in maschera).
- Misurare ed etichettare i ROI all'interno della maschera (Analizza > Analizza particelle > Controlla Aggiungi a gestore > OK).
- Applicare ROI al canale di colore corrispondente all'anticorpo di interesse (Clicca immagine canale, Analizza > Strumenti > Gestione ROI > Misura). Questo applicherà i ROI della maschera all'immagine dell'anticorpo e fornirà le misure dell'immagine per le sezioni delle etichette nella finestra Risultati. Finestra Salva risultati (File > Salva).
- Calcolare la statistica desiderata di interesse, come l'intensità media di fluorescenza come descritto qui24.
- Eseguire tutti i passaggi di elaborazione in modo identico a ogni immagine all'interno di un set di diapositive. Creare una macro per eseguire automaticamente questa operazione per i batch di immagini di grandi dimensioni23.
- Per la visualizzazione dell'immagine solo dopo misurazioni quantitative, applicare regolazioni qualitative dell'immagine per ottimizzare la visualizzazione dei modelli di biodistribuzione regolando il minimo, il massimo, la luminosità e il contrasto agli stessi livelli su tutte le diapositive(Immagine > Regola > Luminosità/Contrasto).
- Convertire il tipo di immagine (Immagine > Tipo > Colore RGB) e salvare i file in un tipo di immagine senza perdita di dati, ad esempio .tiff ( File> Salva con nome > Tiff...) da utilizzare nelle presentazioni e nelle pubblicazioni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il metodo IVIL è stato utilizzato qui per esaminare la biodistribuzione in vivo e l'interazione dei tessuti di B7-H3-ICG e Iso-ICG, consentendo agli agenti, dopo l'iniezione endovenosa in un animale vivente, di interagire con il tessuto bersaglio per 96 h, e poi una volta che i tessuti sono primario anticorpi durante l'immunostaining ex vivo. Il metodo IVIL è stato anche confrontato con la colorazione IF standard dei tessuti per il marcatore B7-H3. Le normali ghiandole mammarie murine non esprimono il marcatore B7-H3, confermato nella colorazione IF standard, e non accumulano anticorpi attraverso altri meccanismi passivi e, pertanto, non è stato rilevato alcun accumulo di B7-H3-ICG o Iso-ICG, di un risultato negativo (Figura 1, riga superiore). Tuttavia, i tumori mammari murini esprimono B7-H3 sia nella vascolatura che nell'epitelio (come confermato dalla colorazione IF standard), e IVIL è stato in grado di evidenziare l'agente B7-H3-ICG che si era accumulato fortemente sulla vascolatura ed era in grado di estravare parzialmente dalla vascolatura per legarsi alle cellule tumorali stesse anche se in modo eterogeneo rispetto alla distribuzione uniforme del marcatore B7-H3 in tutti i tumori, mostrata anche in Figura 1, riga inferiore. Inoltre, anche se l'agente Iso-ICG non ha specificità molecolare, è stato ancora dimostrato di accumularsi in modo non specifico, a causa delle interazioni Fc, del cattivo drenaggio interstiziale e della maggiore permeabilità e dell'effetto di ritenzione all'interno di una mamma murina tumori ( Figura1). Questa differenza è evidenziata nei modelli di biodistribuzione mostrati tra i due agenti e migliora ulteriormente i risultati specifici dell'associazione specifica dell'agente anticorpo e rappresenta due possibili esiti di un risultato positivo.
I risultati rappresentativi di B7-H3-ICG dimostrano come il metodo IVIL possa essere utilizzato come metodo qualitativo per descrivere la biodistribuzione coniugata anticorpo/anticorpo generale. Tuttavia, a volte, può essere necessaria un'interpretazione più quantitativa, o un anticorpo può avere una capacità vincolante altamente sensibile e specifica della conformazione. In queste situazioni, IVIL può anche fornire le informazioni desiderate. In un secondo esempio, in cui l'espressione della proteina netrin-1 nei tessuti tumorali e la sua co-localizzazione con l'endotelio tumorale positivo CD31 doveva essere studiata, la tecnica IVIL è stata applicata con successo19.
Netrin-1 è una proteina 65 kDa secreta che è sovra-espressa in alcuni tipi di cancro come il cancro al seno metastatico25,26. Per sviluppare un approccio di imaging molecolare per netrin-1, la disponibilità in vivo della proteina doveva essere determinata19. Inoltre, poiché l'anticorpo anti-netrin-1 non ha sufficiente affinità per il suo antigene dopo la fissazione del tessuto, è stato richiesto un protocollo di colorazione alternativo all'immunoistochimica classica o alla colorazione IF ed è stato implementato IVIL. L'anticorpo umanizzato anti-netrin-1 e un anticorpo di controllo dell'isotipo IgG umano sono stati iniettati per via endovenosa 24 h prima della perfusione cardiaca e della raccolta del tumore. La perfusione cardiaca è stata applicata per ridurre la colorazione dello sfondo non specifico nella vascolatura e per migliorare il rilevamento di un significativo accumulo di anticorpi anti-netrin-1 anti-netrin-1 rispetto al segnale anticorpale di controllo dell'isotipo quando l'espressione bersaglio è limitata. Le sezioni tumorali sono state etichettate come ex vivo con decostato che evidenzial'anticorpo anti-CD31 (anticorpo CD31 anti-topo) e anticorpi secondari fluorescenti, Alexa 488 capra anti-ratto IgG, 1:500 di lui e Alexa Fluor 594- capra accoppiato anti-umano IgG, 1:500 diluizione rispettivamente) sono stati utilizzati per rivelare anti-netrin-1/isotipo e anti-CD31 mAbs. Le intensità del segnale di fluorescenza dell'anticorpo anti-netrin-1 e del controllo isotipo sono state quantificate per determinare le differenze nella colorazione co-localizzata con CD31. La figura 2 mostra che l'anticorpo anti-netrin-1 si è specificamente accumulato nel compartimento tumorale epiteliale dei tumori mammari MMTV-PyMT (un risultato positivo), mentre non c'era alcun segnale nelle normali ghiandole mammarie (un risultato negativo). L'anticorpo ulteriormente co-localizzato con il marcatore endoteliale CD31. Il confronto con i tumori iniettati da anticorpi isotipi e le ghiandole normali ha mostrato che l'accumulo epiteliale era specifico per il tessuto tumorale. C'era accumulo di segnale nelle cellule endoteliali di tumori e ghiandole normali a causa di netrin-1 legame (tumori) e interazioni Fc non specifiche (tumori e ghiandole mammarie normali)11. Così, la quantificazione del segnale di fluorescenza utilizzando una maschera binaria basata su CD31 è stata richiesta e ha dimostrato che il segnale anticorpo anti-netrin-1 era significativamente superiore al segnale anticorpale del controllo isotipo nel tessuto tumorale, il che suggerisce netrin-1 specificatamente accumulato nell'endotelio tumorale.
Figura 1 : Le micrografie confocali rappresentative del confronto tra specifici caratteri B7-H3 anticorpo-ICG e anticorpi di controllo isotipo non specifici-ICG coniugano la localizzazione nelle ghiandole mammarie murine contenenti tessuti normali o carcinoma. (In alto) Le normali ghiandole mammarie murine di un animale iniettate per via endovenosa con 33 g di Iso-ICG o B7-H3-ICG (rosso) e contro macchiate con CD31 (verde) che non mostrano alcuna colorazione dei coniugi anticorpo. È stato dimostrato che i tessuti normali non hanno alcuna espressione di B7-H3 dalla colorazione IF standard ex vivo. (In basso) Tumori mammari invasivi provenienti da un animale per via endovenosa iniettati con 33 g di B7-H3-ICG o Iso-ICG (rosso) e il CD31 (verde) con contromacchiazione estensiva e eterogenea, anche se con diversi modelli di distribuzione, sia per il B7-H3-ICG che per Agenti Iso-ICG. B7-H3-ICG si lega fortemente alla vascolatura, il primo punto di contatto in vivo, e quindi è in grado di extravacare dalla vascolatura per macchiare eterogeneamente l'epitelio tumorale. Iso-ICG mostra un accumulo non specifico all'interno dei tessuti tumorali. La colorazione standard se ex vivo mostra un'espressione uniforme del marcatore B7-H3 sulle cellule epiteliali ed endoteliali. Il colore giallo indica il segnale del canale rosso e verde co-localizzato. La barra della scala è di 100 m e coerente tra i pannelli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : localizzazione immuno-localizzazione in vivo di netrin-1 nei tumori mammari MMTV-PyMT. (Sinistra) Rappresentative micrografie confocali del metodo IVIL per rilevare l'espressione netrin-1 (rosso) o l'espressione di controllo dell'isotipo (rosso) nel carcinoma murino e nelle normali ghiandole mammarie. IVIL conferma il segnale epiteliale per netrin-1 nei tumori MMTV-PyMT ma non nelle normali ghiandole mammarie, e forte segnale netrin-1 sulle cellule endoteliali (colorazione CD31, verde) nei tumori al seno e segnale significativamente più debole di netrin-1 nelle normali ghiandole mammarie. Il colore giallo indica il segnale del canale rosso e verde co-localizzato. Le barre della scala indicano 20 m. Per la rilevazione della proteina netrin-1 nell'endotelio tumorale, sono stati iniettati per via endovenosa 24 h prima della raccolta del tumore 100 g di ig umano. L'anticorpo circolante è stato rimosso per perfusione cardiaca con PBS e tessuto tumorale è stato isolato, flash congelato, e sezionato a 15 spessore m su un criostato. Le cellule endoteliali sono state etichettate con anticorpo CD31 antito-topo primario seguito da IgG antiratto di capra Alexa 488 accoppiati ad Alexa. Per rivelare l'anticorpo primario che punta alla netrina-1, è stato utilizzato l'IgG secondario di Alexa Fluor 594. Per evitare l'interazione non specifica degli anticorpi secondari della capra, i campioni di tessuto sono stati bloccati con il siero di capra. (A destra) Grafico a barre che evidenzia la quantificazione del segnale anticorpale anticorpo anticorpo anti-netrin-1 o isotipo che colocalizza con il segnale anticorpo anti-CD31. Tumori (di due topi) per gruppo di ghiandole mammarie MMTV-PyMT e N-7 (di un topo) per gruppo di ghiandole normali; Le barre di errore presentano SEM; Sono stati eseguiti confronti tra due gruppi con il test t di Student. Figura ristampata con il permesso di 19 sotto la licenza creative commons CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo metodo ha diversi passaggi critici e richiede potenziali modifiche per garantire una corretta implementazione. In primo luogo, il dosaggio e la tempistica dell'iniezione endovenosa anticorpo/anticorpo devono essere adattati all'applicazione specifica. Generalmente, dosaggi dovrebbero essere utilizzati che sono coerenti con come l'anticorpo coniugato sarà in genere utilizzato, cioè, dosaggi corrispondenti dell'anticorpo terapeutico o agente di contrasto basato su anticorpi. Inoltre, i tempi della raccolta dei tessuti bersaglio devono essere attentamente considerati. Anticorpi e jujugate anticorpi hanno tempi di circolazione più lunghi rispetto ai farmaci standard e agli agenti di contrasto, tuttavia, questi sono altamente variabili e dovrebbero essere ottimizzati per l'applicazione desiderata, ma si raccomanda di consentire almeno 24 h di tempo di circolazione27 . In secondo luogo, durante la raccolta del tessuto bersaglio, potrebbe essere necessario implementare una tecnica di perfusione intracardiaca per rimuovere liberamente l'anticorpo circolante dalla pozza sanguigna19. Mentre si guarda alla distribuzione del tumore di B7-H3-ICG, è stato trovato inutile a causa di tempi di circolazione sufficientemente lunghi (96 h) e la localizzazione extravascolare dell'agente. Tuttavia, per l'applicazione netrin-1 del metodo IVIL, la perfusione cardiaca è stata considerata pertinente a causa dell'espressione endoteliale di netrin-1 e del suo livello di espressione relativamente basso. In terzo luogo, durante la colorazione del tessuto ex vivo è imperativo macchiare eventuali vetrini che verranno confrontati quantitativamente durante la stessa sessione e con le stesse soluzioni per prevenire le normali variazioni inter-batch. Assicurarsi che i vetrini siano sciacquati correttamente tra i passaggi e che la soluzione della penna idrofobica non entri in contatto con il tessuto per evitare macchie non ottimali. Infine, durante la microscopia confocale, mantenere le stesse impostazioni di imaging tra i vetrini per consentire la quantificazione relativa e lavorare rapidamente per evitare il fotosblificamento delle diapositive. Questi punti chiave aumenteranno la probabilità di una corretta attuazione IVIL.
Il metodo IVIL presenta diversi vantaggi. In primo luogo, mentre il metodo è simile alle tecniche IF standard, i due forniscono informazioni significativamente diverse. La colorazione SE indica la posizione anatomica dei marcatori molecolari all'interno del tessuto in un determinato momento (quando il tessuto è stato raccolto e fissato). Tuttavia, IVIL fornisce informazioni su come un anticorpo o un anticorpo coniugato, come dimostrato dalla localizzazione di B7-H3-ICG, sta distribuendo e interagendo, sia che si tratti di accumulazione, internalizzazione o ritenzione specifici nel target fazzoletto. Questo è fondamentale per gli studi farmacocinetici/dinamici e di biodistribuzione. In secondo luogo, i metodi tradizionali IF sono, a volte, limitati dalla fissazione dei tessuti che possono causare la distorsione dell'antigene o mascherare la prevenzione del legame da parte dell'anticorpo primario28. Pertanto, IVIL può essere utile quando la colorazione SE standard o l'immunohistochimica falliscono. La tecnica IVIL può essere considerata un metodo complementare per verificare l'attività degli anticorpi in vivo che altrimenti sarebbe inosservabile. Infine, coloro che hanno familiarità con le tecniche tradizionali di colorazione IF troveranno il metodo semplice in esecuzione e avranno la maggior parte dei materiali necessari a portata di mano.
Il metodo IVIL presenta alcune limitazioni. In primo luogo, a causa della necessità di eutanasia l'animale per raccogliere i tessuti bersaglio, IVIL fornisce solo informazioni sull'interazione biologica in un singolo momento. L'iniezione dell'anticorpo primario o del anticorpo coniugato in diversi punti temporali in diversi animali consentirà una più ampia finestra temporale di informazioni sulla biodistribuzione e l'interazione in vivo. In secondo luogo, se gli utenti non hanno familiarità con le tecniche animali in vivo, come l'iniezione di vena della coda per via endovenosa o la potenziale perfusione intracardiaca, questo può essere una limitazione al metodo. Questi metodi richiedono personale qualificato per funzionare in modo affidabile. Tuttavia, l'uso di un catetere durante l'iniezione di vena della coda garantisce la somministrazione dell'intera dose in quanto il corretto posizionamento dell'ago può essere confermato prima dell'iniezione. Inoltre, un'alternativa all'iniezione di vena della coda che potrebbe essere considerata è l'iniezione retroorbitale, che in genere ha un più alto tasso di successo con personale meno esperto. La necessità di colorare e immaginare tutti i vetrini di tessuto nello stesso lotto per consentire una valutazione quantitativa limita il numero di campioni e marcatori che possono essere inclusi in un singolo studio. Potrebbe essere necessario organizzare lo studio in colorazione seriale in giorni diversi e su fette di tessuto adiacenti per raccogliere le informazioni desiderate. Infine, l'uso di anticorpi abbinati a specie, cioè anticorpi murini anti-topo nei modelli preclinici murini, solleva un problema di colorazione di fondo non specifica con anticorpi secondari. Pertanto, è necessario l'uso di anticorpi primari non corrispondenti alle specie, come presentato in questo studio, o dovrebbe essere utilizzato anticorpi primari con corrispondenza di specie fluorescenti.
La tecnica IVIL è utile per l'analisi biodistribuzione di anticorpi diagnostici e terapeutici per molte applicazioni. In precedenza sono state segnalate diverse applicazioni per l'anticorpo endovenoso o l'iniezione di ligando e l'analisi dei tessuti ex vivo e confermano l'interesse a introdurre ampiamente questa procedura di colorazione. Robertson e colleghi hanno etichettato elementi vascolari come capillari e vasi più grandi con iniezioni endovenose di agglutinina Lycopersicon esculentum (tomato lectin)29. La tecnica era compatibile con la istochimica e l'immunocitochimica e ha rivelato modelli vascolari e caratteristiche parenchiche funzionali. Tuttavia, l'uso di ligandi fluorescenti è stato limitato dalla rapida degradazione della fluorescenza dopo l'iniezione30. Come dimostrato nel protocollo IVIL, l'iniezione di un anticorpo primario in vivo seguito da etichettatura ex vivo con un anticorpo fluorescente secondario potrebbe essere un approccio più robusto. Un'altra interessante applicazione di questo tipo di colorazione IF in vivo è l'etichettatura dei linfociti intravascolari come dimostrato da Anderson e colleghi31 . L'anticorpo iniettato per via endovenosa iniettata indubbiamente è stato utilizzato per etichettare i linfociti localizzati nei vasi sanguigni, che sono stati successivamente raccolti e ulteriormente elaborati per l'analisi della citometria di flusso dei marcatori immunologici. Infine, per valutare il parto e la localizzazione istologica delle terapie anticorpali che sono state consegnate a pazienti con carcinoma a cellule squamose per la testa e sul collo (HNSCC), è stato effettuato un primo studio in-umano sulla distribuzione degli anticorpi somministrato nel vicino infrarosso fluorescente anticorpo terapeutico cetuximab-IRDye800CW32. I dati sono stati confrontati con le analisi istologiche e hanno mostrato che il segnale fluorescente è diminuito con la distanza dal tumore che conferma la specificità. Tuttavia, l'anticorpo terapeutico non ha raggiunto tutte le regioni di espressione dell'antigene, in particolare le regioni tumorali ben differenziate con alti livelli dell'antigene del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR). Nell'attuale contesto della ricerca sul cancro incentrata sullo sviluppo di terapie mirate e immunoterapie che incontrano una forte resistenza e mancanza di efficacia, il metodo IVIL sarebbe un ottimo strumento per studiare la distribuzione di anticorpi terapeutici come PD-1/PD-L-1 o HER233,34. Questi risultati sono estremamente preziosi per capire perché le terapie mirate sono efficaci in alcuni casi promuovendo lo sviluppo di nuovi approcci. Nel loro insieme, questi esempi evidenziano la potenziale importanza dell'approccio IVIL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) per le discussioni e l'uso delle attrezzature. Ringraziamo il dottor Juergen K. Willmann per il suo mentore. Questo studio è stato sostenuto da NIH R21EB022214 grant (KEW), NIH R25CA118681 training grant (KEW) e NIH K99EB023279 (KEW). Lo Stanford Neuroscience Microscopy Service è stato supportato da NIH NS069375.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
| Indocyanine Green - NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
| Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
References
- Forthal, D. N.
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Lonberg, N., et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).
- McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).
- Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
- Kircher, M. F., Willmann, J. K. Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles. Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).
- Fleuren, E. D. G., et al.
- Forsström, B., Bisławska Axnäs, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).
- Brooks, J. D. Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers. Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).
- Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease. The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M.
- Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
- Freise, A. C., Wu, A. M. In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments. Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).
- Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival. Cancer Research. 78 (3), 758-768 (2018).
- Wilson, K. E., et al. Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent. Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).
- Wischhusen, J., et al. Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer. Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bachawal, S. V., et al. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Research. 73, 1689-1698 (2013).
- Fitamant, J., et al. Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Ryman, J. T., Meibohm, B.
- Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Chen, C. Y., et al. Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels. The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- de Boer, E., et al. In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 5, (2015).
- Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors. British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).
- Rexer, B. N., Arteaga, C. L. Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications. Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).
