Summary
这里介绍了在新生儿小猪模型中对胸腺丛进行体内生物力学测试的方法。
Abstract
新生儿胸鼓性麻痹（NBPP）是一种在位于颈部和肩部区域的神经复合物（统称为胸痛（BP）的神经复合物的分娩过程中发生的拉伸损伤。尽管最近在产科护理方面取得了进展，但NBPP问题仍然是一个全球卫生负担，每1 000名活产婴儿的发病率为1.5例。更严重的这种损伤可能导致手臂从肩部向下永久瘫痪。NBPP 的预防和治疗有助于了解新生儿 BP 神经在拉伸时的生物力学和生理反应。目前对新生儿BP的了解是从成年动物或尸体BP组织而不是体内新生儿BP组织推断而成的。本研究描述了一种在体内的机械检测装置和在新生儿小猪中进行体内生物力学测试的程序。该器件由夹具、执行器、称重传感器和摄像机系统组成，用于应用和监控体内的应变和负载，直至故障。摄像机系统还允许监控破裂期间的故障位置。总体而言，提出的方法允许详细的生物力学表征新生儿BP时，遭受拉伸。
Introduction
尽管最近产科取得了进展，但英国石油公司（BP）综合体的拉伸损伤造成的NBPP问题仍然是一个全球性的健康负担，每1 000名活产1.5例，1、2。相关的风险因素可以是母体（即超重、产妇糖尿病、子宫异常、BP 麻痹史）、胎儿（即胎儿大体肌瘤）或与出生相关（即肩部难产、长时间劳动、用钳子或真空吸尘器辅助分娩、胸腔表达3）。虽然在某些情况下这些并发症是不可避免的，但 NBPP 的预防和治疗有助于了解新生儿 BP 在拉伸时的生物力学和生理反应。
据报道，英国石油公司的生物力学研究使用了成年动物和人类尸体组织，并显示出4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15之间的显著差异。复杂BP组织生物力学特性的临床相关性值得新生儿动物模型以及体内生物力学测试方法。此外，在复杂的真实分娩场景中研究 BP 拉伸损伤的局限性增加了对计算机模型的依赖，这些模型提供了能够调查各种交付并发症和技术影响的方法。这些模型的临床相关性的关键是它们的生物保真度（类似人类的反应）。Gonik等人16和格林等人17提供的计算模型依赖于兔子和大鼠神经组织，而不是新生儿BP组织。在临床相关的新生儿动物模型中进行体内生物力学测试，可以填补新生儿BP数据不可用的重要空白。
目前的研究描述了一种体内机械测试装置和程序，用于对3-5天大的约克郡雄性新生儿小猪进行生物力学测试。该器件由夹具、执行器、称重传感器和摄像机系统组成，在发生故障时应用和监控体内的应变和负载。摄像机系统还允许监控破裂期间的故障位置。总体而言，该系统允许在拉伸时对新生儿BP进行详细的生物力学表征，从而为体内机械故障提供BP的阈值应变和应力。获得的数据可以进一步改善现有计算模型的人类行为（生物保真度），这些模型旨在调查在与NBPP相关的交付场景中外源力和内源力对BP拉伸的影响。
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Protocol
德雷塞尔大学动物护理和使用机构委员会批准了所有程序（#20704）。
1. 动物到达和适应
- 在抵达后隔离1⁄2天大的小猪至少24小时。
- 在清洁和消毒的不锈钢笼子里（36 in x 48 x 36 in）的猪窝，用猪奶替代器喂养。
- 将室温保持在 85 °F，以确保热中性环境。
2. 实验日
- 在实验前 2 小时取出进给。
- 用肌内注射氯胺酮（10~40毫克/千克）/木氨酸（1.5~3.0毫克/千克IM）注射小猪，并通过运输笼运送到手术空间。
3. 麻醉的诱导与维护
- 通过鼻锥施用4%异脱胶吸入麻醉剂，通过鼻锥在氧气中混合，通过评估无肝和戒断反射，确认动物被深度麻醉。
- 将动物置于上摆位置，并使用喉镜（直刀片）帮助引导插管（直径为 2.5–2 mm）进入气管，从而插入动物。
- 固定插管后，将动物放在呼吸机上。
- 确保小猪接受配苯二氮（0.25%-3%维护）、氧气和一氧化二氮的混合物。
- 提供一剂芬太尼（10微克/千克），并继续每1⁄2小时给予剂量，以确保镇痛和镇定的持续足够深度，并避免有可能破坏内切管的运动伪影。
- 在皮下腹静脉或任何其他周围静脉建立静脉注射（IV）。
- 通过股动脉建立动脉。这可以非侵入性或通过执行切割。
4. 监测和护理
- 通过确认没有罐反射和对脚趾捏的戒断反应，监测麻醉的深度。
- 在麻醉期间和整个实验过程中对生理参数进行持续监测，包括动脉血压、心电图（ECG）、末期潮汐CO2、脉搏血氧仪和体温。
- 监测每0.5~1小时一次的血气和血糖，并根据需要以±100 cc/kg/天的速度给动物静脉注射液（50%德克斯和50%正常盐水），以确保尿糖血症。
- 密切和频繁地监测动物的麻醉平面。提供麻醉和/或增加吸入麻醉。
- 通过控制呼吸机参数和药物剂量，根据需要控制动物保持正常的氧气张力，以确保不气感，然后将动物置于温度调节的循环水毯上，使正常体温保持在39°C在实验期间。
5. 胸管丛手术
- 按照第3节所述，在适当的麻醉后，将动物置于手术台上，上肢处于诱拐状态，露出剖腹产区域。
- 使用任何手术窗帘覆盖动物。使用清洁但非无菌技术。
- 通过在皮肤上做中线切口（使用#10刀片）在皮肤和筋膜上覆盖气管，向下至胸骨的上三分之一，与C3-T3之间的脊柱水平相对应，暴露脊柱两侧的胸肌丛复杂。
- 从锁骨边缘沿锁骨边缘到上臂，在两侧水平推算切口和附着力，同时保留头孢子和罗勒静脉。
- 用剪刀和钳子钝切除，释放优等和劣质皮瓣，分别进入胸腺丛的宫颈和胸腔区域。
- 识别 T1 处的轴 （C2） 和第一个肋骨。使用这些地标，识别下三宫颈 （C6+C8） 和第一胸椎 （T1） 脊柱前腹，然后仔细检查丛，以找到分裂 （M 形状） 的分叉，以实现暴露。
- 标记（使用神经回路）这些分叉上方靠近脊柱的胸痛丛区域作为根/树干，并将这些分叉下方的那些标记为和弦，然后是靠近手臂的神经。
6. 生物力学测试
- 生物力学检测装置的设置
注：设计并制造了一种定制的机械测试装置，用于在BP的体内运行（图1）。- 将设置的底座连接到购物车。
- 使用大型 C 形夹将机电执行器连接到底座上。执行器能够提供 150 磅的力、10" 冲程和 15 mm/s 的速度。速度可降至 0.2 mm/s，但仍可根据需要运行。
- 将 200 N 称重传感器连接到执行器。
- 将（拧入）夹子连接到由填充有机玻璃组成的称重传感器，防止夹紧部位的应力浓度。
- 将相机连接到三脚架。确保摄像机能够以 658 x 4926 像素的分辨率录制高达 120 f/s。
- 将相机、执行器和称重传感器的 USB 电缆连接到计算机，以集成和同步设置的所有组件。
- 将计算机、执行器和称重传感器插入电源。
- 在记录施加的负载之前，校准称重传感器。为此，执行以下步骤：
- 使用可调节手柄将执行器设置为 90° 角，并使用量角器检查角度。
- 打开与称重传感器（材料表）一起使用的软件。按"开始"按钮可显示电压的实时读出。
- 悬挂从夹具上的重量范围为 0~1，000 g，增量为 100 g，并记录测量的电压。
- 通过查找斜率 （m） 和截距 （b） 来计算电压和权重的线性方程。这是使用电子表格程序和包含的斜率函数从下面的公式1 中计算 b 来完成的。将下面的公式 2插入机械设置代码中。
公式 1： b = y - mx
其中：y 是重量，x 是电压，m 是斜率，b 是截距（常数）。
公式2：y = mx = b
其中：y 是权重，x 是电压，m 是斜率，b 是常数。
- 测试：BP神经被定制夹具切割并固定在测试设置上。
- 用细剪刀切割BP神经。
- 在定制的夹具中夹紧 BP 神经的切割侧，如图1所示。
- 手动将黑色丙烯酸漆或印度墨水放在夹紧的 BP 段上（图 2）。
- 在动物体内放置一个校准网格，这是一个 1 厘米的标尺，以设置用于数据分析的比例。
- 使用相机的软件直接查看摄像机在测试段上的位置，从而可以监控标记的运动/位移，并确定任何时间点的实际组织应变。
- 记录初始测量值，例如神经从表插入身体的高度和表的夹子高度、执行器的角度以及组织的全长。
- 打开编程软件（包含图形用户界面 [GUI] 的表，如图3所示）。
- 按"运行"按钮运行 GUI。
- 按"初始化"按钮初始化系统。
- 按下"Tare"按钮来熨压系统。
- 按下启动测试按钮拉伸 BP 段。这将以 500 mm/min 的分配速率拉动组织，直到 BP 的任何部分发生完全故障。这个拉伸率是根据现有的文献4，8，18选择。该程序还保存了视频文件、应用的拉伸载荷、组织位移和测试持续时间。
- 记录故障部位，即组织破裂的点。
- 安乐死：在实验结束时用致命剂量的五巴比妥（120毫克/千克i.v.）对小猪实施安乐死。
- 数据分析：使用运动跟踪软件分析测试期间获取的视频。
- 通过选择"文件|打开视频文件。
- 使用校准网格使用"线"工具在运动跟踪软件中设置刻度，在绘制线后右键单击线，选择"校准测量"，然后输入以厘米为单位的已知值（图4）。
- 通过右键单击视频并选择"轨迹路径"，并将标记的中心与组织上的标记对齐，并将其粘接直至破裂，跟踪运动跟踪软件中组织的标记。
- 通过选择"文件导出到电子表格"从标记导出 x 和 y 坐标，以便可用于计算应变。
- 将数据导入编程软件，以计算 x 坐标和 y 坐标之间的时间距离，以计算应变。
- 计算每个时间点的应变值，方法是在考虑拉伸期间倾斜度变化后，将距离变化除以原始距离。实际应变值在每个时间点的每对相邻标记之间确定。也计算了这些菌株的平均值。
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Representative Results
图5和图6分别显示了来自BP丛的四个片段（四个标记之间）的代表性加载时间图和应变。在35%的平均失效应变下，获得8.3 N的故障负荷报告新生儿BP在拉伸时的生物力学反应。神经的某些区域经历比其他人更高的菌株，表明神经长度上不均匀损伤。摄像机数据允许报告故障位置与前场接近。
图1：体内机械测试装置的详细信息，包括执行器、称重传感器和夹具。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：放置在BP段上的标记，以记录组织在拉伸过程中维持的菌株。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3：使用图形用户界面进行数据采集的步骤。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：标记跟踪和应变分析细节。以 AVI 格式保存的测试视频在跟踪软件中导入。每个标记和第一个和最后一个标记之间的应变是详细获得的。标记菌株之间的平均值用于报告故障菌株。此处显示了一个带有三个标记的神经拉伸和计算的平均应变时间图示例，报告的失败应变为 43%。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5：故障期间报告的最大负载。连接到执行器的负载单元在拉伸期间获取负载数据。数据用于获取加载时间图，如图所示。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：拉伸丛的四个不同部分报告菌株。菌株在每个标记之间计算，并与所有四个段（两个相邻标记之间的平均应变）进行比较。神经的某些区域经历的菌株比其他区域高，平均菌株表明神经长度上不均匀损伤。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
关于BP组织拉伸的生物力学反应的现有文献显示广泛的阈值以及方法差异4，6，8，18，19，20，21，22，23。公布结果的变化可能是由于组织处理的差异（例如固定组织与非固定组织）、测量伸长度的方法论差异以及所用物种的差异。此外，这些数据是从成年动物或人类尸体中获得的，而不是新生儿。伦理原因使得很难从活的人类新生儿那里获得机械数据，因此可能会使用与人类有解剖学相似性的大型动物模型。小猪作为动物模型，已经用于BP相关研究6，24。
建议的方法和设置允许在大型动物模型中测量新生儿BP的体内生物力学反应，有助于了解BP拉伸过程中的损伤机制。虽然测试协议和设置是可靠的，但它提供了一些限制（例如，机械测试期间发生的滑移、测试期间标记可见性的丢失、测试时整个身体的移动直到发生故障）。在测试过程中发生滑移时，确保适当的夹紧可以最大限度地减少滑移。添加填充可以进一步固定组织并避免滑倒。如果需要，也可以根据需要轻松更换其他不同类型的夹具。标记可见性损失发生在小于 2% 的情况下，并且是不可避免的。在测试时保护动物躯干可能需要固定钻机。由于设置允许通过相机系统跟踪插入运动，因此在测试过程中可以记录任何动物运动。该系统的另一个限制是它能够通过单独的程序实时提供摄像机视图，从而在测试期间限制实时摄像机视图。将来可以通过将实时摄像机视图集成到当前用于运行测试的程序中来改进这一点。
总之，NBPP是一个重大的伤害与终身后遗症，许多个人。不幸的是，在过去30年中，尽管技术发展和培训产科医生的增多，但发病率并没有下降。发病率下降的主要原因是在制定尽量减少 NBPP 发生的预防性战略方面的局限性。在全面了解各级（即机械、功能和组织学）的损伤机制之前，无法探索预防策略。迄今没有报告在新生儿大型动物模型中测量体内BP菌株的方法，目前的研究是第一个提供方案，进一步探索新生儿BP组织拉伸后生理和功能变化的协议。通过在各种菌株上执行测试，可以报告新生儿胸椎丛中功能和结构损伤的损伤阈值。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本出版物中报道的研究得到了国家卫生研究院尤尼斯·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康和人类发展研究所的支持，该奖编号为R15HD093024，并得到了国家科学基金会CAREER奖编号 1752513。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omega Subminature Tension & Compression Load Cell | Omega | LCM201-200N | 200N load cell |
| Basler acA640-120uc camera | Basler | acA640-120uc | |
| Feedback Linear Actuator | Progressive Automations | PA-14P | 10" stroke, 150lb force, 15mm/s speed |
| Motion Tracking Software | Kinovea | N/A | Open Source |
| Proramming Software - MATLAB | Mathworks | N/A | version 2018A |
| Surgical instruments | |||
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 |
References
- Chauhan, S. P., Blackwell, S. B., Ananth, C. V. Neonatal brachial plexus palsy: Incidence, prevalence, and temporal trends. Seminars in Perinatology. 38 (4), 210-218 (2014).
- Foad, S. L., Mehlman, C. T., Ying, J. The epidemiology of neonatal brachial plexus palsy in the United States. Journal of Bone and Joint Surgery - Series A. 90 (60), 1258-1264 (2008).
- García Cena, C. E., et al. Skeletal modeling, analysis and simulation of upper limb of human shoulder under brachial plexus injury. Advances in Intelligent Systems and Computing. 252, 195-207 (2014).
- Marani, E., van Leeuwen, J. L., Spoor, C. W. The tensile testing machine applied in the study of human nerve rupture: a preliminary study. Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, S33-S35 (1993).
- Zapałowicz, K., Radek, A. Mechanical properties of the human brachial plexus. Neurologia i Neurochirurgia Polska. 34 (6), 89-93 (2000).
- Singh, A., Shaji, S., Delivoria-Papadopoulos, M., Balasubramanian, S. Biomechanical Responses of Neonatal Brachial Plexus to Mechanical Stretch. Journal of Brachial Plexus and Peripheral Nerve Injury. 13 (1), e8-e14 (2018).
- Driscoll, P. J., et al. An in vivo study of peripheral nerves in continuity: biomechanical and physiological responses to elongation. Journal of Orthopaedic Research. 20 (2), 370-375 (2002).
- Zapalowicz, K., Radek, A. Experimental investigations of traction injury of the brachial plexus. Model and results. Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 11-14 (2005).
- Ma, Z., et al. In vitro and in vivo mechanical properties of human ulnar and median nerves. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 101 (9), 2718-2725 (2013).
- Rydevik, B. L., et al. An in vitro mechanical and histological study of acute stretching on rabbit tibial nerve. Journal of Orthopaedic Research. 8 (5), 694-701 (1990).
- Kwan, M. K., Wall, E. J., Massie, J., Garfin, S. R. Strain, stress and stretch of peripheral nerve rabbit experiments in vitro and in vivo. Acta Orthopaedica. 63 (3), 267-272 (1992).
- Takai, S., et al. In situ strain and stress of nerve conduction blocking in the brachial plexus. Journal of Orthopaedic Research. 20 (6), 1311-1314 (2002).
- Zhe, S., Feng, T., Sun, C., Ma, H. Tensile mechanical properties of the brachial plexus of experimental animals. Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research. 14 (20), 3730-3733 (2010).
- Alexander, M. J., Barkmeier-Kraemer, J. M., Geest, J. P. Vande Biomechanical properties of recurrent laryngeal nerve in the piglet. Annals of Biomedical Engineering. 38 (8), 2553-2562 (2010).
- Zilic, L., et al. An anatomical study of porcine peripheral nerve and its potential use in nerve tissue engineering. Journal of Anatomy. 227 (3), 302-314 (2015).
- Gonik, B., Zhang, N., Grimm, M. J. Prediction of brachial plexus stretching during shoulder dystocia using a computer simulation model. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 189 (4), 1168-1172 (2003).
- Grimm, M. J., Costello, R. E., Gonik, B. Effect of clinician-applied maneuvers on brachial plexus stretch during a shoulder dystocia event: Investigation using a computer simulation model. Obstetrical and Gynecological Survey. 203 (4), (2011).
- Kawai, H., et al. Stretching of the brachial plexus in rabbits. Acta Orthopaedica. 60 (6), 635-638 (1989).
- Narakas, A. O. Lesions found when operating traction injuries of the brachial plexus. Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, S56-S64 (1993).
- Kleinrensink, G. J., et al. Upper limb tension tests as tools in the diagnosis of nerve and plexus lesions - Anatomical and biomechanical aspects. Clinical Biomechanics. 15 (1), 9-14 (2000).
- Zapałowicz, K., Radek, A. Mechanical properties of the human brachial plexus. Neurologia, i Neurochirurgia Polska. 34 (6), 89-93 (2000).
- Singh, A., Lu, Y., Chen, C., Cavanaugh, J. Mechanical properties of spinal nerve roots subjected to tension at different strain rates. Journal of Biomechanics. 39 (9), 1669-1676 (2006).
- Singh, A., Lu, Y., Chen, C., Kallakuri, S., Cavanaugh, J. M. A new model of traumatic axonal injury to determine the effects of strain and displacement rates. Stapp Car Crash Journal. 50, 601-623 (2006).
- Gonik, B., et al. The timing of congenital brachial plexus injury: A study of electromyography findings in the newborn piglet. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 178 (4), 688-695 (1998).
