Summary
Представлены методы для выполнения in vivo биомеханического тестирования на брахиальное сплетение в неонатальной модели поросят.
Abstract
Неонатальный паралич брахиального сплетения (NBPP) представляет собой растяжку травмы, которая происходит во время родоввого процесса в нервных комплексах, расположенных в области шеи и плеча, коллективно называют брахиального сплетения (ВР). Несмотря на недавние достижения в области акушерской помощи, проблема НБПП по-прежнему является глобальным бременем для здоровья, где на 1000 живорождений случаев на 1000 случаев заболевания случаев заболевания. Более тяжелые типы этой травмы может привести к постоянному параличу руки от плеча вниз. Профилактика и лечение NBPP требует понимания биомеханических и физиологических реакций новорожденных нервов ВР при растяжении. Текущие знания новорожденного ВР экстраполируется из взрослых животных или трупных всп ткани вместо in vivo неонатальной ткани ВР. Это исследование описывает in vivo механическое устройство тестирования и процедуры для проведения in vivo биомеханического тестирования в неонатальных поросят. Устройство состоит из зажима, актуатора, нагрузок и камеры системы, которые применяют и контролируют in vivo штаммов и нагрузок до отказа. Система камеры также позволяет контролировать местоположение сбоя во время разрыва. В целом, представленный метод позволяет детально биомеханической характеристики неонатальной ВР при растяжении.
Introduction
Несмотря на последние достижения в акушерстве, проблема NBPP, вызванного растяжек травмы комплекса ВР по-прежнему является глобальным бременем для здоровья, с заболеваемостью 1,5 случаев на 1000 живорождений1,2. Связанные факторы риска могут быть материнскими (т.е. избыточный вес, материнский диабет, аномалии матки, история паралича ВР), фетальный (т.е. макросомия плода), или родородованные (т.е. дистоция плеча, длительная родосная работа, вспомогательные роды с щипками или вакуумными экстракторами, презентация затвора3). Хотя эти осложнения неизбежны в определенных обстоятельствах, профилактика и лечение NBPP требует понимания биомеханических и физиологических реакций неонатальной ВР при растяжении.
Сообщенные биомеханические исследования на ВР использовали взрослых животных и трупной ткани человека и показать значительные расхождения4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Клиническая релевантность биомеханических свойств сложной ткани BP требует неонатальной модели животных, а также биомеханического подхода к биомеханическому тестированию in vivo. Кроме того, ограничения с изучением BP стрейч травмы в сложных реальных сценариях доставки увеличивает зависимость от компьютерных моделей, которые обеспечивают методы, которые позволяют исследует последствия различных осложнений доставки и методов. Ключом к клинической значимости этих моделей является их биоверность (человекоподобный ответ). Доступные вычислительные модели Gonik et al.16 и Grimm et al.17 опираются на ткани кролика и крысиной нервной ткани, но не на неонатальную ткань ВР. Выполнение биомеханического тестирования in vivo в клинически релевантной модели неонатального животного происхождения может заполнить критический пробел в недоступных данных ВР новорожденных.
В настоящем исследовании описывается in vivo механическое устройство тестирования и процедуры для проведения биомеханических испытаний в 3-5-дневный мужчина йоркширских неонатальных поросят. Устройство состоит из зажима, актуатора, нагрузочных ячеек и системы камеры, которые применяют и контролируют штаммы и нагрузки in vivo во время сбоя. Система камеры также позволяет контролировать местоположение сбоя во время разрыва. В целом, система позволяет детально биомеханической характеристики неонатальной ВР при условии растяжения, тем самым обеспечивая порог штаммов ВР и стрессы для механической поломки in vivo. Полученные данные могут еще больше улучшить поведение человека, как (биоверность) существующих вычислительных моделей, которые предназначены для изучения влияния экзогенных и эндогенных сил на растяжку ВР в сценариях доставки, связанных с NBPP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Институциональный комитет по уходу за животными и использованию при Университете Дрекселя одобрил все процедуры (#20704).
1. Прибытие и акклиматизация животных
- Карантин 1-2 дневных поросят, по крайней мере 24 ч после прибытия.
- Дом поросят в чистых и дезинфицированных клетках из нержавеющей стали (36 в х 48 в х 36 дюйма) на осины чип постельных принадлежностей и кормить объявление libitum с заменителя молока свиньи.
- Поддерживайте комнатную температуру на уровне 85 градусов по Фаренгейту, чтобы обеспечить термонейтральную среду.
2. День эксперимента
- Удалите корм 2 ч до начала эксперимента.
- Вводят поросята с внутримышечной инъекцией кетамина (10-40 мг/кг)/ксилазин (1,5-3,0 мг/кг IM) и транспортировать через транспортную клетку в хирургическое пространство.
3. Индукция и поддержание анестезии
- Администрирование 4% изофлуранинга анестезии, смешанной в кислороде конусом носа и подтвердить, что животное глубоко обезглавлен, оценивая отсутствие пальпебральных и абстинентных рефлексов.
- Интубировать животное, поместив его в положение на спине и использовать ларингоскоп (прямое лезвие), чтобы помочь направлять интубуционную трубку (диаметр 2,5-2 мм) в трахею.
- Поместите животное на аппарат искусственной вентиляции легких после того, как интубация трубки защищена.
- Убедитесь, что поросята получают смесь изофларан (0,25%-3% обслуживания), кислорода и закиси азота.
- Обеспечить дозу фентанила (10 мкг/кг) и продолжать давать дозу каждые 1-2 ч, чтобы обеспечить дальнейшую адекватную глубину анальгезии и седативных и избежать движения артефактов, которые могут риск dislodgment эндотрахеальной трубки.
- Установить внутривенный (IV) доступ в подкожной брюшной вены или любой другой периферической вены.
- Установите артериальную линию через бедренную артерию. Это может быть сделано неинвазивно или путем выполнения сокращения.
4. Мониторинг и уход
- Мониторинг глубины анестезии, подтверждая отсутствие канального рефлекса и отсутствие реакции вывода на нос.
- Выполняйте непрерывный мониторинг физиологических параметров во время анестезии и на протяжении всего эксперимента, который включает артериальное кровяное давление, электрокардиографию (ЭКГ), конечную приливную CO2,оксиметрию пульса и температуру тела.
- Мониторинг газов крови и сахара в крови каждые 0,5-1 ч и дать внутривенных жидкостей (50% декстрозы и 50% нормальный солин) для животных под ней под невесомым дольше, чем 1 ч при 100 куб.см/ кг/день, по мере необходимости, для обеспечения эпигемии.
- Внимательно и часто следите за анестезией животного. Обеспечить анальгезию и/или увеличить ингаляционную анестезию.
- Поддерживайте животное при нормальном кислородном напряжении, контролируя параметры вентилятора и дозировки лекарств по мере необходимости для обеспечения нормоксии, а затем поместите животное на температурно-регулируемое циркуляторное водяное одеяло, чтобы нормальная температура тела сохранялась на уровне 39 градусов по Цельсию в течение всего эксперимента.
5. Брахиальная хирургия сплетения
- Поместите животное в положение на спине на операционном столе после надлежащей анестезии, как описано в разделе 3, с верхней конечности в похищении, подвергая подмышечной области.
- Используйте любую хирургическую драпировку, чтобы покрыть животное. Используйте чистые, но нестерильные методы.
- Разоблачить брахиального сплетения комплекса по обе стороны позвоночника, сделав разрез средней линии (с помощью #10 лезвия) над кожей и фасции над трахеей, вплоть до верхней трети грудины, что соответствует уровням позвоночника между C3-T3.
- Экстраполировать разрез с помощью щипцы и hemostat горизонтально с каждой стороны от надстернальной выемки вдоль края ключицы на верхнюю руку, щадя при этом цефалические и базилики вены.
- Освободите верхние и нижние закрылки тупым вскрытием с помощью ножниц и щипцы, что позволяет получить доступ к шейки матки и грудной области брахиального сплетения, соответственно.
- Определите ось (C2) и первое ребро на T1. Используя эти ориентиры, определить нижние три шейки матки (C6-C8) и первый грудной (T1) спинного позвоночного предсердий, а затем внимательно изучить сплетение, чтобы найти бифуркации отделов (M формы) для достижения воздействия.
- Этикетка (с использованием нервных петель) брахиального сплетения регионов над этими бифуркации ближе к позвоночнику, как корень / ствол и этикетки тех, ниже этих бифуркций, как аккорд следуют нерв, которые расположены ближе к руке.
6. Биомеханическое тестирование
- Настройка биомеханического испытательного устройства
ПРИМЕЧАНИЕ: Специально построенное механическое испытательное устройство было разработано и изготовлено для выполнения виво-участок BP (Рисунок 1).- Прикрепите основание установки к тележке.
- Прикрепите электромеханический актуатор на основание с помощью больших C-зажимов. Актуатор способен обеспечить 150 фунтов силы, 10 "удар, и скорость 15 мм /с. Скорость может быть снижена до 0,2 мм/с и по-прежнему функционировать по желанию.
- Прикрепите ячейку нагрузки 200 N к актатору.
- Прикрепите (винт-в) зажим к ячейке нагрузки, которая состоит из мягкого плексигласа, который предотвращает концентрацию стресса в месте зажима.
- Прикрепите камеру к штативу. Убедитесь, что камера имеет возможность записи до 120 f/s при разрешении 658 х 4926 пикселей.
- Прикрепите USB-кабели от камеры, привода и загрузите ячейку на компьютер для интеграции и синхронизации всех компонентов настройки.
- Подключите компьютер, актуатор и загрузите ячейку в источник питания.
- Откалибровать ячейку нагрузки перед записью прикладных нагрузок. Для этого выполните приведенные ниже шаги:
- Установите упор под углом 90 градусов, используя регулируемую ручку и проверяя угол с помощью протрактора.
- Откройте программное обеспечение, которое работает с ячейкойнагрузки (Таблица материалов). Нажмите кнопку «Пуск», чтобы показать живое считывание напряжения.
- Повесить веса от зажима, начиная от 0-1000 г с шагом 100 г от установки и записывать измеренные напряжения.
- Рассчитайте линейное уравнение напряжения и веса, найдя наклон (м) и перехват (b). Это делается с помощью программы электронной таблицы и включенной функции наклона для расчета b из уравнения 1 ниже. Вставьте уравнение 2, показанное ниже, в код механической настройки.
Уравнение 1: b и y - mx
Где: y вес, x является напряжение, м склон, и b является перехват (постоянный).
Уравнение 2: у й мхбс и b
Где: y является вес, х является напряжение, м склон, и b является постоянным.
- Тестирование: нерв BP разрезается и крепится к тестированию настройки на заказ зажим.
- Вырезать нерв ВР с помощью тонких ножниц.
- Зажим вырезать сторону нерва ВР в специально построенный зажим, как показано на рисунке 1.
- Ручно поместите черную акриловую краску или индийские чернила на зажатый сегмент BP(рисунок 2).
- Поместите калибровование сетки, которая является 1 см линейки, плоский внутри животного, чтобы установить шкалу для анализа данных.
- Используйте программное обеспечение камеры для просмотра размещения камеры непосредственно над тестированными сегментами, тем самым позволяя контролировать движение/перемещение маркеров и определять фактическое напряжение ткани в любой момент времени.
- Запись первоначальных измерений, таких как высота, на которой нерв вставляется в тело со стола и высота зажима со стола, угол действия, и полная длина ткани.
- Откройте программное обеспечение для программирования (таблица, содержащая графический пользовательский интерфейс (GUI), как показано на рисунке 3).
- Запустите графический интерфейс, нажав кнопку Run.
- Инициализовать систему, нажав кнопку Инициализации.
- Раздавите систему, нажав кнопку Tare.
- Растянуть сегмент BP, нажав кнопку запуска теста. Это тянет ткани с заданной скоростью 500 мм/мин до полного отказа происходит в любом сегменте ВР. Эта растяжка выбрана на основе имеющейсялитературы4,8,18. Программа также сохраняет видеофайл, прикладную напряженную нагрузку, смещение ткани и продолжительность теста.
- Запись места отказа, который является точкой, в которой ткань разрывается.
- Эвтаназия: эвтаназия поросят в конце эксперимента со смертельной дозой пентобарбитала (120 мг/кг i.v.).
- Анализ данных: использование программного обеспечения для отслеживания движения для анализа видео, приобретенных во время тестирования.
- Откройте видеофайл из эксперимента в программном обеспечении для отслеживания движения, выбрав файл Открытый файл видео.
- Используйте калибровование сетки для установки шкалы в программном обеспечении отслеживания движения с помощью инструмента Line, правого нажатия на линии после того, как он обращается, выбрав калибровки мера, и ввод известного значения в сантиметрах (Рисунок 4).
- Отслеживайте маркеры на ткани в программном обеспечении отслеживания движения, нажав на видео и выбрав трек-путь и выравнивание центра маркера с маркером на ткани и лавируя его до разрыва.
- Экспорт x- и y-координат от маркеров, выбрав экспорт файлов в таблицу, чтобы его можно было использовать для расчета штаммов.
- Импортируйте данные в программное обеспечение для программирования для расчета расстояния между x- и y-координатами с течением времени для расчета штаммов.
- Рассчитайте значения напряжения в каждой временной точке, разделив изменение расстояния на исходное расстояние после учета изменений в наклоне во время стрейч. Фактические значения напряжения определяются между каждой парой смежных маркеров в каждую точку времени. Рассчитывается также среднее значение этих штаммов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Репрезентативный график нагрузки и штаммы из четырех сегментов сплетения BP (между четырьмя маркерами) показаны на рисунке 5 и рисунке 6,соответственно. Полученная нагрузка отказа 8.3 N на 35% среднем напряжении отказа сообщает биомеханические реакции neonatal BP подвергают к растяжению. Некоторые области нерва проходят более высокие штаммы, чем другие, что свидетельствует о неравномерной травмы по длине нерва. Данные камеры позволяют сообщать о местонахождении сбоя, являясь проксимальным и предприимным.
Рисунок 1: Детали устройства механического тестирования in vivo, включая актуатор, ячейку нагрузки и зажим. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Маркеры, размещенные над сегментами BP для записи штаммов, выдержавшихся в тканях во время растяжения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Шаги для получения данных с использованием графического пользовательского интерфейса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Отслеживание маркеров и детали анализа деформации. Тестовые видео, сохраненные в формате AVI, импортируются в программное обеспечение для отслеживания. Процедить между каждым маркером и первым и последним маркерами получаются как подробные. Среднее количество штаммов маркеров используется для сообщения о сбоях штаммов. Пример растяжения нервов с тремя маркерами и рассчитанного среднего участка времени напряжения показаны здесь, с сообщениями о неудаче штаммов 43%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Максимальная нагрузка, зарегистрированная во время сбоя. Нагрузка ячейки, прикрепленной к актатору, приобретает данные о нагрузке во время растяжения. Данные используются для получения графика времени нагрузки в показано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Штаммы сообщили в четырех различных сегментах растянутого сплетения. Штаммы рассчитываются между каждым маркером и сравниваются со средними штаммами, полученными из всех четырех сегментов (между каждым из двух смежных маркеров). Некоторые области нерва проходят более высокие штаммы, чем другие, и средние штаммы, свидетельствуют о неравномерной травмы по длине нерва. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Доступная литература по биомеханическим реакциям растяжения на ткани ВР демонстрирует широкий диапазон пороговых значений, а также методологические расхождения4,6,8,18,19,20,21,22,23. Различия в опубликованных результатах могут быть обусловлены различиями в обработке тканей (например, фиксированной и нефиксированной ткани), методологическими различиями в измерении удлинения и различиями в используемых видах. Кроме того, эти данные получены от взрослых животных или человеческих трупов, а не новорожденных. Этические причины затрудняют получение механических данных от живых человеческих новорожденных, поэтому вместо них могут использоваться крупные модели животных, имеющие анатомические сходства с людьми. Поросята служат в качестве модели животных, которая уже была использована в Исследованиях, связанных с ВР6,24.
Предлагаемые методы и настройки позволяют измерять биомеханическую реакцию in vivo неонатальной ВР в большой животной модели, предлагая понимание механизма травмы во время растяжения ВР. Хотя протокол тестирования и настройка является надежной, он предлагает некоторые ограничения (т.е. скользит, происходящих во время механического тестирования, потеря видимости маркера во время тестирования, движение всего тела при тестировании до сбоя происходит). В то время как скольжения происходят во время тестирования, обеспечение надлежащего зажима может свести к минимуму проскальзывание. Добавление обивка может еще больше обезопасить ткани и избежать скольжения. Зажимы также могут быть легко заменены другими различными типами зажимов по мере необходимости. Потеря видимости маркера происходит менее чем в 2% случаев и неизбежна. Защита туловища животных во время тестирования может потребовать обеспечения установки. Так как настройка позволяет отслеживать движение вставки через систему камеры, она учитывает любые движения животных во время тестирования. Дополнительным ограничением системы является ее способность обеспечивать просмотр камеры в прямом эфире через отдельную программу, тем самым ограничивая просмотр живой камеры во время тестирования. Это может быть улучшено в будущем путем интеграции живой камеры зрения в программу, которая в настоящее время используется для запуска теста.
Таким образом, NBPP является значительным травмы с пожизненной sequelae для многих людей. К сожалению, за последние три десятилетия, несмотря на расширение технологического развития и подготовки акушеров, темпы его возникновения не уменьшились. Такое отсутствие сокращения числа случаев может быть непосредственно связано с ограничениями в разработке превентивных стратегий, которые сводят к минимуму возникновение НБПП. Профилактические стратегии не могут быть изучены до тех пор, пока не станет доступно подробное понимание механизма травматизма на всех уровнях (т.е. механических, функциональных и гистологических). Ни один метод на сегодняшний день не было сообщено для измерения штаммов in vivo BP в неонатальной большой модели животных, и нынешнее исследование является первым предложить протокол, который далее исследует физиологические и функциональные изменения в ткани неонатального ВР после растяжения. Выполняя тесты на различных штаммах, пороговые значения травм для функциональных и структурных травм в неонатального брахиального сплетения могут быть зарегистрированы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследование, о которых сообщалось в этой публикации, было поддержано Национальным институтом здоровья детей и человеческого потенциала Национальных институтов здравоохранения имени Эунис Кеннеди Шрайвер под номером R15HD093024 и премией Национального научного фонда CAREER Award Номер 1752513.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omega Subminature Tension & Compression Load Cell | Omega | LCM201-200N | 200N load cell |
| Basler acA640-120uc camera | Basler | acA640-120uc | |
| Feedback Linear Actuator | Progressive Automations | PA-14P | 10" stroke, 150lb force, 15mm/s speed |
| Motion Tracking Software | Kinovea | N/A | Open Source |
| Proramming Software - MATLAB | Mathworks | N/A | version 2018A |
| Surgical instruments | |||
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 |
References
- Chauhan, S. P., Blackwell, S. B., Ananth, C. V. Neonatal brachial plexus palsy: Incidence, prevalence, and temporal trends. Seminars in Perinatology. 38 (4), 210-218 (2014).
- Foad, S. L., Mehlman, C. T., Ying, J. The epidemiology of neonatal brachial plexus palsy in the United States. Journal of Bone and Joint Surgery - Series A. 90 (60), 1258-1264 (2008).
- García Cena, C. E., et al. Skeletal modeling, analysis and simulation of upper limb of human shoulder under brachial plexus injury. Advances in Intelligent Systems and Computing. 252, 195-207 (2014).
- Marani, E., van Leeuwen, J. L., Spoor, C. W. The tensile testing machine applied in the study of human nerve rupture: a preliminary study. Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, S33-S35 (1993).
- Zapałowicz, K., Radek, A. Mechanical properties of the human brachial plexus. Neurologia i Neurochirurgia Polska. 34 (6), 89-93 (2000).
- Singh, A., Shaji, S., Delivoria-Papadopoulos, M., Balasubramanian, S. Biomechanical Responses of Neonatal Brachial Plexus to Mechanical Stretch. Journal of Brachial Plexus and Peripheral Nerve Injury. 13 (1), e8-e14 (2018).
- Driscoll, P. J., et al. An in vivo study of peripheral nerves in continuity: biomechanical and physiological responses to elongation. Journal of Orthopaedic Research. 20 (2), 370-375 (2002).
- Zapalowicz, K., Radek, A. Experimental investigations of traction injury of the brachial plexus. Model and results. Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 11-14 (2005).
- Ma, Z., et al. In vitro and in vivo mechanical properties of human ulnar and median nerves. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 101 (9), 2718-2725 (2013).
- Rydevik, B. L., et al. An in vitro mechanical and histological study of acute stretching on rabbit tibial nerve. Journal of Orthopaedic Research. 8 (5), 694-701 (1990).
- Kwan, M. K., Wall, E. J., Massie, J., Garfin, S. R. Strain, stress and stretch of peripheral nerve rabbit experiments in vitro and in vivo. Acta Orthopaedica. 63 (3), 267-272 (1992).
- Takai, S., et al. In situ strain and stress of nerve conduction blocking in the brachial plexus. Journal of Orthopaedic Research. 20 (6), 1311-1314 (2002).
- Zhe, S., Feng, T., Sun, C., Ma, H. Tensile mechanical properties of the brachial plexus of experimental animals. Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research. 14 (20), 3730-3733 (2010).
- Alexander, M. J., Barkmeier-Kraemer, J. M., Geest, J. P. Vande Biomechanical properties of recurrent laryngeal nerve in the piglet. Annals of Biomedical Engineering. 38 (8), 2553-2562 (2010).
- Zilic, L., et al. An anatomical study of porcine peripheral nerve and its potential use in nerve tissue engineering. Journal of Anatomy. 227 (3), 302-314 (2015).
- Gonik, B., Zhang, N., Grimm, M. J. Prediction of brachial plexus stretching during shoulder dystocia using a computer simulation model. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 189 (4), 1168-1172 (2003).
- Grimm, M. J., Costello, R. E., Gonik, B. Effect of clinician-applied maneuvers on brachial plexus stretch during a shoulder dystocia event: Investigation using a computer simulation model. Obstetrical and Gynecological Survey. 203 (4), (2011).
- Kawai, H., et al. Stretching of the brachial plexus in rabbits. Acta Orthopaedica. 60 (6), 635-638 (1989).
- Narakas, A. O. Lesions found when operating traction injuries of the brachial plexus. Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, S56-S64 (1993).
- Kleinrensink, G. J., et al. Upper limb tension tests as tools in the diagnosis of nerve and plexus lesions - Anatomical and biomechanical aspects. Clinical Biomechanics. 15 (1), 9-14 (2000).
- Zapałowicz, K., Radek, A. Mechanical properties of the human brachial plexus. Neurologia, i Neurochirurgia Polska. 34 (6), 89-93 (2000).
- Singh, A., Lu, Y., Chen, C., Cavanaugh, J. Mechanical properties of spinal nerve roots subjected to tension at different strain rates. Journal of Biomechanics. 39 (9), 1669-1676 (2006).
- Singh, A., Lu, Y., Chen, C., Kallakuri, S., Cavanaugh, J. M. A new model of traumatic axonal injury to determine the effects of strain and displacement rates. Stapp Car Crash Journal. 50, 601-623 (2006).
- Gonik, B., et al. The timing of congenital brachial plexus injury: A study of electromyography findings in the newborn piglet. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 178 (4), 688-695 (1998).
