Summary
Qui sono presentati metodi per eseguire test biomeccanici in vivo su plexus brachiale in un modello di maialino neooatale.
Abstract
La paralisi del plesso brachiale neonatale (NBPP) è una lesione elastica che si verifica durante il processo di nascita nei complessi nervosi situati nelle regioni del collo e della spalla, collettivamente indicata come plesso brachiale (BP). Nonostante i recenti progressi nell'assistenza ostetrica, il problema di NBPP continua ad essere un onere sanitario globale con un'incidenza di 1,5 casi per 1.000 nati vivi. Tipi più gravi di questa lesione possono causare paralisi permanente del braccio dalla spalla in giù. La prevenzione e il trattamento di NBPP garantisce una comprensione delle risposte biomeccaniche e fisiologiche dei nervi BP appena nati quando sottoposti a stiramento. L'attuale conoscenza della BP appena nata viene estrapolata dal tessuto animale adulto o cadaverico BP invece del tessuto BP neonatale in vivo. Questo studio descrive un dispositivo di test meccanico in vivo e una procedura per condurre test biomeccanici in vivo in suinetti neotomotori. Il dispositivo è costituito da un morsetto, un attuatore, una cella di carico e un sistema di telecamere che applicano e monitorano ceppi e carichi in vivo fino al guasto. Il sistema di telecamere consente inoltre il monitoraggio della posizione di guasto durante la rottura. Nel complesso, il metodo presentato consente una caratterizzazione biomeccanica dettagliata della BP neoonale quando sottoposto a allungamento.
Introduction
Nonostante i recenti progressi nell'ostetricia, il problema della NBPP causato da lesioni stretch al complesso BP continua ad essere un onere sanitario globale, con un'incidenza di 1,5 casi per 1.000 nati vivi1,2. I fattori di rischio associati possono essere materni (ad esempio, peso eccessivo, diabete materno, anomalie uterine, storia della paralisi della BP), fetali (cioè macrosomia fetale) o legati alla nascita (cioè distocia della spalla, lavoro prolungato, erogazione assistita con pinze o estrattori di aspirazione del vuoto, Mentre queste complicazioni sono inevitabili in determinate circostanze, la prevenzione e il trattamento di NBPP garantisce una comprensione delle risposte biomeccaniche e fisiologiche della BP neoordinata quando sottoposta a stretching.
Studi biomeccanici riportati sul BP hanno utilizzato animali adulti e tessuto cadaverico umano e mostrano discrepanze significative4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. La rilevanza clinica delle proprietà biomeccaniche del complesso tessuto BP garantisce un modello animale neooo-acqua e un approccio di test biomeccanici in vivo. Inoltre, le limitazioni con lo studio delle lesioni stretch BP in complicati scenari di consegna nel mondo reale aumentano la dipendenza da modelli computerizzati che forniscono metodi che consentono di studiare gli effetti di varie complicazioni e tecniche di consegna. La chiave per la rilevanza clinica di questi modelli è la loro biofedeltà (risposta umana). I modelli computazionali disponibili di Gonik et al.16 e Grimm et al.17 si basano sul tessuto nervoso di coniglio e ratto, ma non sul tessuto BP neooatale. L'esecuzione di test biomeccanici in vivo in un modello animale neoooonale clinicamente rilevante può colmare il divario critico di dati BP neoatali non disponibili.
Lo studio attuale descrive un dispositivo di test meccanico in vivo e una procedura per condurre test biomeccanici in maialini neonatale dello Yorkshire di 3-5 giorni. Il dispositivo è costituito da un morsetto, un attuatore, una cella di carico e un sistema di telecamere che applicano e monitorano i ceppi e i carichi in vivo durante il guasto. Il sistema di telecamere consente inoltre il monitoraggio della posizione di guasto durante la rottura. Nel complesso, il sistema consente una caratterizzazione biomeccanica dettagliata della BP neoalatale quando sottoposto a stiramento, fornendo così le sollecitazioni di soglia della BP e le sollecitazioni per guasti meccanici in vivo. I dati ottenuti possono migliorare ulteriormente il comportamento umano (biofedeltà) dei modelli computazionali esistenti che sono progettati per studiare gli effetti delle forze esogene ed endogene sull'estensione BP in scenari di consegna associati a NBPP.
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Protocol
Institutional Animal Care and Use Committee presso Drexel University ha approvato tutte le procedure (#20704).
1. Arrivo e acclimazione degli animali
- Quarantena 1-2 maialini di giorno per almeno 24 ore dopo l'arrivo.
- Casa suinetti in gabbie pulite e igienizzate in acciaio inossidabile (36 in x 48 in x 36 in) su biancheria da letto di truciolo di pioppo e mangime ad libitum con sostituto del latte di maiale.
- Mantenere la temperatura ambiente a 85 gradi centigradi per garantire un ambiente termoneutro.
2. Giorno dell'Esperimento
- Rimuovere il feed 2 h prima dell'esperimento.
- Iniettare suinetti con un'iniezione intramuscolare di chetamina (10-40 mg/kg)/xylazina (1,5-3,0 mg/kg Di IM) e il trasporto tramite una gabbia di trasporto nello spazio chirurgico.
3. Induzione e manutenzione dell'anestesia
- Somministratura 4% aneslazione islurane anestetico mescolato in ossigeno per cono naso e verificare che l'animale è profondamente anestetizzato valutando l'assenza di riflessi palpebrali e di ritiro.
- Intubare l'animale posizionandolo in posizione supina e utilizzare una laringoscopio (lama dritta) per guidare il tubo di intubazione (diametro 2,5–2 mm) nella trachea.
- Posizionare l'animale sul ventilatore una volta fissato il tubo di intubazione.
- Assicurarsi che i suinetti ricevano una miscela di isoflurane (0,25%-3% di manutenzione), ossigeno e protossido di azoto.
- Fornire una dose di fentanil (10 g/kg) e continuare a somminiferire una dose ogni 1–2 h per garantire una profondità adeguata di analgesia e sedazione ed evitare artefatti di movimento che potrebbero rischiare lo slovacco del tubo endotracheale.
- Stabilire l'accesso endovenoso (IV) nella vena addominale sottocutanea o in qualsiasi altra vena periferica.
- Stabilire la linea arteriosa attraverso l'arteria femorale. Questo può essere fatto in modo non invasivo o eseguendo un cut-down.
4. Monitoraggio e cura
- Monitorare la profondità dell'anestesia confermando l'assenza di riflesso canthal e l'assenza di risposta di ritiro al pizzico dei diici.
- Eseguire un monitoraggio continuo dei parametri fisiologici durante l'anestesia e durante l'esperimento, che include la pressione sanguigna arteriosa, l'elettrocardiografia (ECG), la CO di mareafinale 2, l'ossimetria dell'impulso e la temperatura corporea.
- Monitora i gas sanguigni e gli zuccheri nel sangue ogni 0,5-1 h e dai fluidi endovenosi (50% di dextrose e 50% salina normale) agli animali anestesizzati più a lungo di 1 h a 100 cc/kg/giorno, se necessario, per garantire l'euglycemia.
- Monitorare il piano anestetico dell'animale da vicino e frequentemente. Fornire analgesia e/o aumentare l'anestesia inalata.
- Mantenere l'animale alla normale tensione di ossigeno controllando i parametri del ventilatore e i dosaggi di droga in base alle esigenze per garantire la normossia, quindi posizionare l'animale su una coperta d'acqua circolante regolata a temperatura in modo tale che la temperatura corporea normale sia mantenuta a 39 gradi centigradi per tutta la durata dell'esperimento.
5. Chirurgia del plesso brachiale
- Posizionare l'animale in posizione supina sul tavolo operatorio dopo un'adeguata anestesia come descritto nella sezione 3, con l'arto superiore nel rapimento, esponendo la regione ascellare.
- Utilizzare qualsiasi drappo chirurgico per coprire l'animale. Utilizzare tecniche pulite ma non sterili.
- Esporre il complesso del plesso brachiale su entrambi i lati della colonna vertebrale facendo un'incisione mediana (utilizzando una lama #10) sulla pelle e fascia sovrastante la trachea, fino al terzo superiore dello sterno, corrispondente ai livelli della colonna vertebrale tra C3–T3.
- Estrapolare l'incisione utilizzando le pinze e l'elocuma orizzontalmente su ciascun lato dalla tacca soprasternale lungo il bordo della clavicola fino al braccio superiore, risparmiando le vene cefaliche e basili.
- Rilasciare i lembi superiori e inferiori per dissezione smussata utilizzando forbici e pinze, consentendo l'accesso alle regioni cervicali e toraciche del plesso brachiale, rispettivamente.
- Identificare l'asse (C2) e la prima nervatura in corrispondenza del T1. Utilizzando questi punti di riferimento, identificare i tre cervi inferiori (C6-C8) e il primo forame vertebrale spinale toracico (T1), quindi esaminare attentamente il plesso per individuare le biforcazioni delle divisioni (forma M) per ottenere l'esposizione.
- Etichettare (utilizzando anelli nervosi) le regioni del plesso brachiale sopra queste biforcazioni più vicine alla colonna vertebrale come radice / tronco ed etichettare quelli sotto queste biforcazioni come accordo seguito dal nervo, che si trovano più vicino al braccio.
6. Test biomeccanici
- Configurazione del dispositivo di test biomeccanico
NOT: Un dispositivo di test meccanico personalizzato è stato progettato e fabbricato per eseguire l'estensione in vivo della BP (Figura 1).- Fissare la base del set-up a un carrello.
- Attaccare l'attuatore elettromeccanico sulla base utilizzando grandi morsetti a C. L'attuatore è in grado di fornire 150 libbre di forza, 10" corsa e velocità di 15 mm / s. La velocità può essere ridotta a 0,2 mm/s e può comunque funzionare come desiderato.
- Collegare la cella di carico 200 N all'attuatore.
- Fissare (screw-in) un morsetto alla cella di carico che consiste in plexiglass imbottito, che impedisce la concentrazione di sollecitazione nel sito di serraggio.
- Collegare una fotocamera a un treppiede. Assicurarsi che la fotocamera abbia la capacità di registrare fino a 120 f/s con una risoluzione di 658 x 4926 pixel.
- Collegare i cavi USB dalla fotocamera, dall'attuatore e dalla cella di carico al computer per integrare e sincronizzare tutti i componenti della configurazione.
- Collegare il computer, l'attuatore e la cella di carico in una fonte di alimentazione.
- Calibrare la cella di carico prima di registrare i carichi applicati. A tale scopo, eseguire la procedura seguente:
- Impostare l'attuatore con un angolo di 90 gradi utilizzando la maniglia regolabile e controllando l'angolo con un goniometro.
- Aprire il software che funziona con la cella di caricamento (Tabella dei materiali). Premere il pulsante Start per visualizzare una lettura in tempo reale della tensione.
- Appendere i pesi dal morsetto che vanno da 0 a 1.000 g in incrementi di 100 g dalla configurazione e registrare le tensioni misurate.
- Calcolare l'equazione lineare delle tensioni e dei pesi trovando la pendenza (m) e l'intercetta (b). Questo viene fatto utilizzando un programma di foglio di calcolo e la funzione di pendenza inclusa per calcolare b dall'equazione 1 qui sotto. Inserire l'equazione 2 illustrata di seguito nel codice di impostazione meccanica.
Equazione 1: b - y - mx
Dove: y è il peso, x è la tensione, m è la pendenza e b è l'intercetta (costante).
Equazione 2: y , mx e b
Dove: y è il peso, x è la tensione, m è la pendenza e b è la costante.
- Test: il nervo BP viene tagliato e ancorato al set-up di prova con un morsetto personalizzato.
- Tagliare il nervo BP con le forbici sottili.
- Bloccare il lato tagliato del nervo BP nel morsetto personalizzato, come illustrato nella Figura 1.
- Posizionare manualmente vernice acrilica nera o inchiostro indiano sul segmento BP bloccato (Figura 2).
- Posizionare una griglia di calibrazione, che è un righello di 1 cm, piatta all'interno dell'animale per impostare la scala per l'analisi dei dati.
- Utilizzare il software della fotocamera per visualizzare la posizione della telecamera direttamente sui segmenti testati, consentendo in tal modo il monitoraggio del movimento/spostamento dei marcatori e determinando l'effettivo ceppo tissutale in qualsiasi momento.
- Registrare le misure iniziali come l'altezza alla quale il nervo si inserisce nel corpo dal tavolo e l'altezza del morsetto dal tavolo, l'angolo dell'attuatore e l'intera lunghezza del tessuto.
- Aprire il software di programmazione (tabella contenente l'interfaccia utente grafica [GUI] come illustrato nella Figura 3).
- Eseguire la GUI premendo il pulsante Esegui.
- Inizializzare il sistema premendo il pulsante Initialize.
- Tare il sistema premendo il tasto Tare.
- Estendere il segmento BP premendo il pulsante di avvio del test. Questo tira il tessuto ad una velocità assegnata di 500 mm /min fino a quando non si verifica un guasto completo in qualsiasi segmento della BP. Questa velocità di estensione viene selezionata in base alla letteratura disponibile4,8,18. Il programma salva anche un file video, il carico di tensile applicato, lo spostamento del tessuto e la durata del test.
- Registrare il sito di guasto, che è il punto in cui il tessuto si rompe.
- Eutanasia: eutanasia suinetti alla fine dell'esperimento con una dose letale di pentobarbital (120 mg/kg i.v.).
- Analisi dei dati: utilizzare un software di tracciamento del movimento per l'analisi dei video acquisiti durante il test.
- Aprire il file video dall'esperimento all'interno del software di tracciamento del movimento selezionando File Apri file video.
- Utilizzare la griglia di calibrazione per impostare la scala nel software di rilevamento del movimento utilizzando lo strumento Linea, facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla linea dopo che è stata disegnata, selezionando Calibrate Measure (Misura calibrata)e immettendo un valore noto in centimetri(Figura 4).
- Traccia i marcatori sul tessuto all'interno del software di tracciamento del movimento facendo clic con il pulsante destro del mouse sul video e selezionando Traccia traccia e allineando il centro del marcatore con il marcatore sul tessuto e virando fino alla rottura.
- Esportare le coordinate x e y dai marcatori selezionando Esporta file in foglio di calcolo in modo che possa essere utilizzato per calcolare i ceppi.
- Importare i dati in un software di programmazione per calcolare la distanza tra le coordinate x e y nel tempo per calcolare le sollecitazioni.
- Calcolare i valori di deformazione in ogni punto temporale dividendo la variazione di distanza per la distanza originale dopo aver tenuto conto dei cambiamenti di inclinazione durante l'allungamento. I valori di deformazione effettivi vengono determinati tra ogni coppia di marcatori adiacenti in ogni punto temporale. Viene calcolata anche la media di questi ceppi.
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Representative Results
Un grafico rappresentativo del tempo di carico e i ceppi di quattro segmenti di plexp BP (tra quattro marcatori) sono mostrati rispettivamente nella Figura 5 e nella Figura 6. Il carico di guasto ottenuto di 8,3 N al 35% di deformazione media di guasto riporta le risposte biomeccaniche di BP neooatale quando sottoposto a allungamento. Alcune regioni del nervo subiscono ceppi più elevati rispetto ad altre, indicative di lesioni non uniformi lungo la lunghezza del nervo. I dati della telecamera consentono di segnalare la posizione del guasto dal punto di insaccati al forame.
Figura 1: Dettagli del dispositivo di test meccanico in vivo, tra cui l'attuatore, la cella di carico e il morsetto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Marcatori posizionati sopra i segmenti BP per registrare i ceppi sostenuti dal tessuto durante l'allungamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Passaggi per l'acquisizione dei dati tramite l'interfaccia utente grafica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Tracciamento dei marcatori e dettagli di analisidella deformazione . I video di prova salvati in formato AVI vengono importati nel software di monitoraggio. La deformazione tra ogni marcatore e il primo e l'ultimo marcatore viene ottenuta come dettagliata. Una media tra i ceppi di marcatori viene utilizzata per segnalare i ceppi di guasto. Un esempio di tratto nervoso con tre marcatori e il grafico del tempo medio di deformazione calcolato sono mostrati qui, con ceppi di guasto segnalati del 43%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: carico massimo segnalato durante l'errore. La cella di carico collegata all'attuatore acquisisce i dati di carico durante l'allungamento. I dati vengono utilizzati per ottenere un grafico del tempo di caricamento come illustrato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Ceppi riportati in quattro diversi segmenti del plesso allungato. I ceppi vengono calcolati tra ciascun marcatore e confrontati con i ceppi medi ottenuti da tutti e quattro i segmenti (tra ciascuno dei due marcatori adiacenti). Alcune regioni del nervo subiscono ceppi più elevati rispetto ad altre e le tensioni medie indicative di lesioni non uniformi lungo la lunghezza del nervo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La letteratura disponibile sulle risposte biomeccaniche di stretch sul tessuto BP presentano una vasta gamma di valori soglia così come discrepanze metodologiche4,6,8,18,19,20,21,22,23. Le variazioni nei risultati pubblicati potrebbero essere dovute a differenze nella lavorazione dei tessuti (ad esempio, tessuto fisso vs tessuto non fisso), differenze metodologiche nell'allungamento della misurazione e differenze nelle specie utilizzate. Inoltre, questi dati sono ottenuti da animali adulti o cadaveri umani e non da neonati. Le ragioni etiche rendono difficile ottenere dati meccanici da neonati umani vivi, possono essere utilizzati modelli animali così grandi che hanno somiglianze anatomiche con gli esseri umani. Piglets funge da modello animale già utilizzato negli studi relativi alla BP6,24.
I metodi e l'impostazione proposti consentono di misurare la risposta biomeccanica in vivo della BP neonale in un grande modello animale, offrendo una comprensione del meccanismo di lesioni durante l'estensione della BP. Mentre il protocollo di test e la configurazione sono affidabili, offrono alcune limitazioni (ad esempio, scivolature che si verificano durante i test meccanici, perdita di visibilità del marcatore durante i test, movimento dell'intero corpo durante i test fino a quando non si verifica un guasto). Mentre gli slittamenti si verificano durante il test, garantire un corretto bloccaggio può ridurre al minimo lo slittamento. L'aggiunta di imbottitura può ulteriormente fissare il tessuto ed evitare scivolamenti. I morsetti possono anche essere facilmente sostituiti con altri tipi diversi di morsetti in base alle esigenze. La perdita della visibilità del marcatore si verifica in meno del 2% dei casi e sono inevitabili. La messa in sicurezza del torso animale durante i test può richiedere un impianto di fissaggio. Poiché il set-up consente di tracciare il movimento di inserimento attraverso un sistema di telecamere, tiene conto di eventuali movimenti degli animali durante i test. Un'ulteriore limitazione del sistema è la sua capacità di fornire una vista della telecamera in diretta attraverso un programma separato, limitando così la vista della telecamera dal vivo durante i test. Questo può essere migliorato in futuro integrando una vista della telecamera dal vivo nel programma attualmente utilizzato per eseguire il test.
In sintesi, NBPP è un infortunio significativo con sequele per tutta la vita per molti individui. Purtroppo, negli ultimi tre decenni non c'è stata una diminuzione del tasso del suo verificarsi, nonostante l'aumento dello sviluppo tecnologico e della formazione degli ostetrici. Questa mancanza di una diminuzione del verificarsi può essere direttamente attribuita ai limiti nello sviluppo di strategie preventive che minimizzano il verificarsi di NBPP. Le strategie preventive non possono essere esplorate fino a quando non sarà disponibile una comprensione dettagliata del meccanismo di lesione a tutti i livelli (cioè meccanico, funzionale e istologico). Finora non è stato riportato alcun metodo per misurare i ceppi di BP in vivo in un modello animale di grandi dimensioni neonoici, e lo studio attuale è il primo ad offrire un protocollo che esplora ulteriormente i cambiamenti fisiologici e funzionali nel tessuto NEooonale BP post-allungamento. Eseguendo test su vari ceppi, possono essere riportati i valori di soglia delle lesioni per lesioni funzionali e strutturali nel plesso brachiale neoaatale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development dei National Institutes of Health con il premio numero R15HD093024 e dal National Science Foundation CAREER Award Numero 1752513.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omega Subminature Tension & Compression Load Cell | Omega | LCM201-200N | 200N load cell |
| Basler acA640-120uc camera | Basler | acA640-120uc | |
| Feedback Linear Actuator | Progressive Automations | PA-14P | 10" stroke, 150lb force, 15mm/s speed |
| Motion Tracking Software | Kinovea | N/A | Open Source |
| Proramming Software - MATLAB | Mathworks | N/A | version 2018A |
| Surgical instruments | |||
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 |
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