Summary
Aqui são apresentados métodos para realizar testes biomecânicos in vivo em plexo braquial em um modelo de leitão neonatal.
Abstract
A paralisia neonatal do plexo braquial (NBPP) é uma lesão por alongamento que ocorre durante o processo de parto em complexos nervosos localizados nas regiões do pescoço e ombro, coletivamente referido como plexo braquial (BP). Apesar dos recentes avanços no atendimento obstétrico, o problema da NBPP continua a ser um fardo de saúde global com uma incidência de 1,5 casos por 1.000 nascidos vivos. Tipos mais graves desta lesão podem causar paralisia permanente do braço do ombro para baixo. Prevenção e tratamento do NBPP garante uma compreensão das respostas biomecânicas e fisiológicas dos nervos recém-nascidos bp quando submetidos a alongamento. O conhecimento atual da BP recém-nascida é extrapolado a partir de animais adultos ou tecido soráveis da BP em vez de tecido in vivo da BP neonatal. Este estudo descreve um dispositivo de teste mecânico in vivo e procedimento para realizar testes biomecânicos in vivo em leitões neonatais. O dispositivo consiste em um grampo, atuador, célula de carga e sistema de câmera que se aplicam e monitoram cepas e cargas in vivo até a falha. O sistema da câmera igualmente permite a monitoração da posição da falha durante a ruptura. No geral, o método apresentado permite uma caracterização biomecânica detalhada da BP neonatal quando submetido ao alongamento.
Introduction
Apesar dos recentes avanços na obstetrícia, o problema da NBPP causado por lesões no esticão do complexo de BP continua a ser um fardo de saúde global, com uma incidência de 1,5 casos por 1.000 nascidos vivos1,2. Os fatores de risco associados podem ser maternos (ou seja, peso excessivo, diabetes materno, anormalidades uterinas, história de paralisia da BP), fetal (ou seja, macrosomia fetal) ou macrosomia fetal (ou seja, distocia de ombro, trabalho prolongado, parto assistido com fórceps ou extratores de vácuo, apresentação de culatra3). Embora essas complicações sejam inevitáveis em determinadas circunstâncias, a prevenção e o tratamento do NBPP justificam uma compreensão das respostas biomecânicas e fisiológicas da BP neonatal quando submetidas a alongamento.
Estudos biomecânicos relatados sobre a BP utilizaram animais adultos e tecido sumérico humano e mostram discrepâncias significativas4,5,6,7,8,9,10,12,13,14,15. A relevância clínica das propriedades biomecânicas do complexo tecido BP justifica um modelo animal neonatal, bem como uma abordagem de teste biomecânico in vivo. Além disso, as limitações com o estudo da lesão no trecho da BP em cenários complicados de entrega no mundo real aumentam a dependência de modelos computacionais que fornecem métodos que permitem a investigação dos efeitos de várias complicações e técnicas de entrega. A chave para a relevância clínica desses modelos é sua biofidelidade (resposta humana). Modelos computacionais disponíveis por Gonik et al.16 e Grimm et al.17 dependem de tecido nervoso de coelho e rato, mas não tecido neonatal da BP. Realizar testes biomecânicos in vivo em um modelo animal neonatal clinicamente relevante pode preencher a lacuna crítica de dados de BP neonatais indisponíveis.
O estudo atual descreve um dispositivo e um procedimento in vivo do teste mecânico para conduzir o teste biomecânico em leitão neonatal masculinos de Yorkshire 3-5 day-old. O dispositivo consiste em um grampo, atuador, célula de carga e sistema de câmera que aplicam e monitoram cepas e cargas in vivo durante a falha. O sistema da câmera igualmente permite a monitoração da posição da falha durante a ruptura. Em geral, o sistema permite a caracterização biomecânica detalhada da BP neonatal quando submetido ao alongamento, proporcionando assim as tensões limiares da BP e tensões para falha mecânica in vivo. Os dados obtidos podem melhorar ainda mais o comportamento humano (biofidelidade) dos modelos computacionais existentes que são projetados para investigar os efeitos de forças exógenas e endógenas no estiramento da BP em cenários de entrega associados à NBPP.
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Protocol
Institutional Animal Care and Use Committee da Universidade Drexel aprovou todos os procedimentos (#20704).
1. Chegada e Aclimatação animal
- Quarentena de 1 a 2 dias de idade leitões por pelo menos 24 h após a chegada.
- Leitão da casa em gaiolas limpas e higienizadas de aço inoxidável (36 em x 48 em x 36 polegadas) na cama de chip de álamo e alimentar ad libitum com substituídor de leite de porco.
- Mantenha a temperatura ambiente a 85 °F para garantir um ambiente termoneutro.
2. Dia da Experiência
- Retire a alimentação 2 h antes do experimento.
- Injete leitões com uma injeção intramuscular de cetamina (10-40 mg/kg)/xilazine (1,5-3,0 mg/kg IM) e transporte através de uma gaiola de transporte para o espaço cirúrgico.
3. Indução e Manutenção da Anestesia
- Administrar 4% de anestésico de inalação de isofluranos misturado em oxigênio por cone de nariz e confirme que o animal é profundamente anestesiado, avaliando a ausência de reflexos palpebrais e de retirada.
- Entubar o animal, colocando-o na posição supina e usar um laringoscópio (lâmina reta) para ajudar a guiar o tubo de intubação (diâmetro 2,5-2 mm) na traqueia.
- Coloque o animal no ventilador uma vez que o tubo de intubação esteja protegido.
- Certifique-se de que os leitões recebam uma mistura de isoflurano (0,25%-3% de manutenção), oxigênio e óxido nitroso.
- Forneça uma dose de fentanil (10 μg/kg) e continue dando uma dose a cada 1-2 h para garantir a profundidade adequada contínua de analgesia e sedação e para evitar artefatos de movimento que poderiam arriscar o descrédito do tubo endotraheal.
- Estabelecer acesso intravenoso (IV) na veia abdominal subcutânea ou qualquer outra veia periférica.
- Estabelecer a linha arterial através da artéria femoral. Isso pode ser feito de forma não invasiva ou realizando um corte.
4. Monitoramento e Cuidados
- Monitore a profundidade da anestesia, confirmando a ausência de reflexo de cantal e ausência de resposta à retirada para beliscar os dedos do dedo do dedo do lado.
- Realizar monitoramento contínuo de parâmetros fisiológicos durante a anestesia e durante todo o experimento, que inclui pressão arterial, eletrocardiografia (ECG), CO2das marés finais, oximetria do pulso e a temperatura corporal.
- Monitore gases no sangue e açúcares no sangue a cada 0,5-1 h e dê fluidos intravenosos (50% dextrose e 50% soro fisiológico normal) para animais anestesiados por mais de 1 h em ~100 cc/kg/dia, conforme necessário, para garantir a euglicemia.
- Monitore o plano anestésico do animal de perto e com freqüência. Fornecer analgesia e/ou aumentar a anestesia inalalant.
- Mantenha o animal na tensão normal do oxigênio controlando os parâmetros do ventilador e as doses da droga como necessário para assegurar normoxia, a seguir coloc o animal em um cobertor de água circulante temperatura-regulado de tal modo que a temperatura de corpo normal esteja mantida em 39 °C durante o período do experimento.
5. Cirurgia de Plexo Brachial
- Coloque o animal em uma posição supina na mesa de operação após anestesia adequada, como descrito na seção 3, com o membro superior em sequestro, expondo a região axillary.
- Use qualquer cortina cirúrgica para cobrir o animal. Use técnicas limpas, mas não estéreis.
- Exponha o complexo de plexo braquial em ambos os lados da coluna vertebral, fazendo uma incisão midline (usando uma lâmina #10) sobre a pele e fáscia sobrepondo a traqueia, até o terço superior do esterno, correspondendo aos níveis da coluna vertebral entre C3-T3.
- Extrapolar a incisão usando os fórceps e o hemostat horizontalmente em cada lado do entalhe suprasternal ao longo da borda da clavícula ao braço superior, ao poupar as veias cefálicas e basilic.
- Libere as abas superiores e inferiores por dissecção contundente usando tesoura e fórceps, permitindo o acesso às regiões cervical e torácica do plexo braquial, respectivamente.
- Identifique o eixo (C2) e a primeira costela no T1. Usando esses marcos, identifique os três inferiores cervicais (C6-C8) e o primeiro foramen espinhal vertebral (T1), em seguida, examine o plexo cuidadosamente para localizar bifurcações das divisões (forma M) para alcançar a exposição.
- Etiqueta (usando laços do nervo) as regiões brachial do plexo acima destas bifurcations mais perto da espinha como a raiz/tronco e etiquetam aquelas abaixo destas bifurcations como a corda seguida pelo nervo, que são ficados situados mais perto do braço.
6. Testes biomecânicos
- Configuração do dispositivo de teste biomecânico
Nota: Um dispositivo de teste mecânico personalizado foi projetado e fabricado para realizar trecho in vivo da BP (Figura 1).- Anexar a base da configuração para um carrinho.
- Anexe o atuador eletromecânico na base usando grandes grampos C. O atuador é capaz de fornecer 150 libras de força, 10 " acidente vascular cerebral, e velocidade de 15 mm / s. A velocidade pode ser reduzida para 0,2 mm/s e ainda funcionar como desejado.
- Anexe a célula de carga 200 N ao atuador.
- Anexar (parafuso-in) uma braçadeira para a célula de carga que consiste em plexiglass acolchoado, o que impede a concentração de estresse no local de fixação.
- Anexe uma câmera a um tripé. Certifique-se de que a câmera tem a capacidade de gravar até 120 f/s em uma resolução de 658 x 4926 pixels.
- Anexar cabos USB da câmera, atuador e célula de carga para o computador para integrar e sincronizar todos os componentes da configuração.
- Ligue o computador, atuador e carregue a célula em uma fonte de energia.
- Calibrar a célula de carga antes de gravar as cargas aplicadas. Para fazer isso, execute os passos abaixo:
- Defina o atuador em um ângulo de 90° usando a alça ajustável e verificando o ângulo com um trator.
- Abra o software que funciona com a célula de carga(Tabela de Materiais). Pressione o botão Iniciar para mostrar uma leitura ao vivo de tensão.
- Pendure pesos da braçadeira que variam de 0-1.000 g em incrementos de 100 g da configuração e gravar as tensões medidas.
- Calcule a equação linear das tensões e pesos encontrando a inclinação (m) e intercepte (b). Isso é feito usando um programa de planilha e a função de inclinação incluída para calcular b da Equação 1 abaixo. Insira equação 2 mostrada abaixo no código de configuração mecânica.
Equação 1: b = y - mx
Onde: y é o peso, x é a tensão, m é a inclinação, e b é a interceptação (constante).
Equação 2: y = mx + b
Onde: y é o peso, x é a tensão, m é a inclinação, e b é a constante.
- Teste: o nervo BP é cortado e ancorado à configuração de teste por grampo personalizado.
- Corte o nervo BP usando uma tesoura fina.
- Aperte o lado cortado do nervo BP na braçadeira personalizada, como mostrado na Figura 1.
- Coloque manualmente tinta acrílica preta ou tinta da Índia no segmento bp apertado(Figura 2).
- Coloque uma grade de calibração, que é uma régua de 1 cm, plana dentro do animal para definir a escala para análise de dados.
- Use o software da câmera para visualizar a colocação da câmera diretamente sobre os segmentos testados, permitindo assim o monitoramento do movimento/deslocamento dos marcadores e determinando a tensão do tecido real a qualquer momento.
- Registre as medidas iniciais, como a altura em que o nervo se insere no corpo a partir da mesa e a altura da braçadeira da mesa, o ângulo do atuador e o comprimento total do tecido.
- Abra o software de programação (tabela contendo a interface gráfica do usuário [GUI] como mostrado na Figura 3).
- Executar o GUI pressionando o botão Run.
- Ininicialize o sistema pressionando o botão Initialize.
- Tare o sistema, pressionando o botão Tare.
- Estique o segmento bp pressionando o botão de teste de início. Isso puxa o tecido a uma taxa atribuída de 500 mm/min até que a falha completa ocorra em qualquer segmento da BP. Essa taxa de alongamento é selecionada com base na literatura disponível4,8,18. O programa também salva um arquivo de vídeo, a carga de tração aplicada, deslocamento do tecido e duração do teste.
- Registre o local da falha, que é o ponto em que o tecido se rompe.
- Eutanásia: eutanásia leitões no final do experimento com uma dose letal de pentobarbital (120 mg/kg i.v.).
- Análise de dados: use o software de rastreamento de movimento para a análise dos vídeos adquiridos durante os testes.
- Abra o arquivo de vídeo do experimento dentro do software de rastreamento de movimento, selecionando Arquivo | Arquivo de vídeo aberto.
- Use a grade de calibração para configurar a escala no software de rastreamento de movimento usando a ferramenta linha, clicando direito na linha depois que ela é desenhada, selecionando calibrar medida,e digitando um valor conhecido em centímetros (Figura 4).
- Acompanhe os marcadores no tecido dentro do software de rastreamento de movimento clicando no vídeo e selecionando track path e alinhando o centro do marcador com o marcador no tecido e alinhando-o até a ruptura.
- Exportar as coordenadas x e y dos marcadores selecionando a exportação da lima à planilha de modo que possa ser usada para calcular as tensões.
- Importe os dados em um software de programação para calcular a distância entre as coordenadas x e y ao longo do tempo para calcular as cepas.
- Calcule os valores da tensão em cada ponto de tempo dividindo a mudança na distância pela distância original após a contabilidade para mudanças na inclinação durante o estiramento. Os valores reais da tensão são determinados entre cada par de marcadores adjacentes em cada ponto de tempo. A média dessas cepas também é calculada.
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Representative Results
Um gráfico de tempo de carregamento representativo e cepas de quatro segmentos de plexo BP (entre quatro marcadores) são mostrados na Figura 5 e Figura 6, respectivamente. A carga de falha obtida de 8,3 N em 35% de cepa de falha média relata as respostas biomecânicas da BP neonatal quando submetida ao alongamento. Algumas regiões do nervo submetem-se a umas tensões mais elevadas do que outro, indicando de ferimento non-uniform ao longo do comprimento do nervo. Os dados da câmera permitem relatar a localização da falha sendo proximal para o foramen.
Figura 1: Detalhes do dispositivo de teste mecânico in vivo, incluindo o atuador, célula de carga e braçadeira. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Marcadores colocados sobre os segmentos da BP para registrar cepas sustentadas pelo tecido durante o trecho. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Etapas para aquisição de dados usando interface gráfica do usuário. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Detalhesde rastreamento e análise de tensão de marcadores. Os vídeos de teste salvos em formato AVI são importados no software de rastreamento. A tensão entre cada marcador e o primeiro e último marcadores é obtida conforme detalhado. Uma média entre as cepas de marcadores é usada para relatar as cepas de falha. Um exemplo de alongamento nervoso com três marcadores e a trama média calculada de tempo de tensão são mostrados aqui, com cepas de falha relatadas de 43%. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: Carga máxima relatada durante a falha. A célula de carga anexada ao atuador adquire os dados de carga durante o trecho. Os dados são usados para obter um gráfico de tempo de carregamento, como mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 6: Cepas relatadas em quatro segmentos diferentes do plexo esticado. As cepas são calculadas entre cada marcador e em comparação com as cepas médias obtidas de todos os quatro segmentos (entre cada um dos dois marcadores adjacentes). Algumas regiões do nervo submetem-se a umas tensões mais elevadas do que outro e as tensões médias indicativas de ferimento non-uniform ao longo do comprimento do nervo. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
A literatura disponível sobre as respostas biomecânicas do trecho no tecido da BP exibe malargada gama de valores limiares, bem como discrepâncias metodológicas4,6,8,18,19,21,22,23. Variações nos resultados publicados podem ser devido a diferenças no processamento de tecidos (por exemplo, tecido fixo versus não fixado), diferenças metodológicas na medição do alongamento e diferenças no processamento de espécies utilizadas. Além disso, esses dados são obtidos de animais adultos ou cadáveres humanos e não neonatos. Razões éticas tornam difícil obter dados mecânicos de neonatos humanos vivos, de modo que grandes modelos animais que têm semelhanças anatômicas com os seres humanos podem ser usados em seu lugar. Os leitões servem como um modelo animal que já foi utilizado em estudos relacionados à BP6,24.
Os métodos e a configuração propostos permitem medir a resposta biomecânica in vivo da BP neonatal em um grande modelo animal, oferecendo uma compreensão do mecanismo de lesões durante o trecho da BP. Embora o protocolo de teste e a configuração seja robusto, ele oferece algumas limitações (ou seja, deslizamentos ocorrendo durante testes mecânicos, perda de visibilidade do marcador durante os testes, movimento de todo o corpo ao testar até que a falha ocorra). Embora os deslizamentos ocorram durante os testes, garantir que o aperto adequado possa minimizar a derrapagem. Adicionar estofamento pode proteger ainda mais o tecido e evitar deslizamentos. Grampos também podem ser facilmente substituídos por outros tipos diferentes de grampos, conforme necessário. A perda de visibilidade do marcador ocorre em menos de 2% dos casos e é inevitável. Proteger o torso animal ao testar pode exigir um equipamento de fixação. Uma vez que a configuração permite o rastreamento do movimento de inserção através de um sistema de câmera, ele é responsável por quaisquer movimentos animais durante os testes. Uma limitação adicional do sistema é a sua capacidade de fornecer uma visão da câmera ao vivo através de um programa separado, limitando assim a visualização de câmera ao vivo durante o teste. Isso pode ser melhorado no futuro, integrando uma visão de câmera ao vivo no programa que atualmente é usado para executar o teste.
Em resumo, nbpp é uma lesão significativa com sequelas ao longo da vida para muitos indivíduos. Infelizmente, nas últimas três décadas não houve diminuição na taxa de sua ocorrência, apesar do aumento do desenvolvimento tecnológico e da formação de obstetras. Essa falta de diminuição na ocorrência pode ser diretamente atribuída às limitações no desenvolvimento de estratégias preventivas que minimizem a ocorrência de NBPP. Estratégias preventivas não podem ser exploradas até que uma compreensão detalhada do mecanismo de lesões em todos os níveis (ou seja, mecânica, funcional e histológica) esteja disponível. Nenhum método até o momento foi relatado para medir cepas in vivo BP em um modelo animal neonatal grande, eo estudo atual é o primeiro a oferecer um protocolo que explora ainda mais as mudanças fisiológicas e funcionais no tecido neonatal BP pós-trecho. Ao realizar testes em várias cepas, os valores do limiar de lesões para lesões funcionais e estruturais no plexo braquial neonatal podem ser relatados.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development dos Institutos Nacionais de Saúde o Prêmio Número R15HD093024 e pelo National Science Foundation CAREER Award Número 1752513.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omega Subminature Tension & Compression Load Cell | Omega | LCM201-200N | 200N load cell |
| Basler acA640-120uc camera | Basler | acA640-120uc | |
| Feedback Linear Actuator | Progressive Automations | PA-14P | 10" stroke, 150lb force, 15mm/s speed |
| Motion Tracking Software | Kinovea | N/A | Open Source |
| Proramming Software - MATLAB | Mathworks | N/A | version 2018A |
| Surgical instruments | |||
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 |
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