Summary
Aquí se presentan métodos para realizar pruebas biomecánicas in vivo en el plexo braquial en un modelo de lechón neonatal.
Abstract
La parálisis del plexo braquial neonatal (NBPP) es una lesión elástica que ocurre durante el proceso de parto en complejos nerviosos ubicados en las regiones del cuello y el hombro, denominados colectivamente el plexo braquial (BP). A pesar de los recientes avances en la atención obstétrica, el problema del BPP sigue siendo una carga sanitaria mundial con una incidencia de 1,5 casos por cada 1.000 nacidos vivos. Los tipos más graves de esta lesión pueden causar parálisis permanente del brazo desde el hombro hacia abajo. La prevención y el tratamiento de la NBPP justifican una comprensión de las respuestas biomecánicas y fisiológicas de los nervios de la presión arterial del recién nacido cuando se someten a estiramiento. El conocimiento actual de la presión arterial neonatal se extrapola del tejido de la presión arterial animal o cadavérico adulto en lugar del tejido de la presión arterial neonatal in vivo. Este estudio describe un dispositivo de prueba mecánica in vivo y un procedimiento para realizar pruebas biomecánicas in vivo en lechones neonatales. El dispositivo consiste en una abrazadera, actuador, célula de carga y sistema de cámara que se aplican y monitorean las tensiones y cargas in vivo hasta que fallan. El sistema de cámara también permite monitorear la ubicación de la falla durante la ruptura. En general, el método presentado permite una caracterización biomecánica detallada de la presión arterial neonatal cuando se somete a estiramiento.
Introduction
A pesar de los recientes avances en obstetricia, el problema del PNB causado por lesiones estiradas en el complejo de bp sigue siendo una carga sanitaria mundial, con una incidencia de 1,5 casos por cada 1.000 nacidos vivos1,2. Los factores de riesgo asociados pueden ser maternos (es decir, peso excesivo, diabetes materna, anomalías uterinas, antecedentes de parálisis de la presión arterial), fetal (es decir, macrosomía fetal) o relacionado con el nacimiento (es decir, distocia del hombro, trabajo de parto prolongado, parto asistido con fórceps o extractores de vacío, presentación de recámara3). Si bien estas complicaciones son inevitables en ciertas circunstancias, la prevención y el tratamiento del BNB garantiza una comprensión de las respuestas biomecánicas y fisiológicas de la presión arterial neonatal cuando se somete a estiramiento.
Los estudios biomecánicos notificados sobre la presión arterial han utilizado animales adultos y tejido sávico humano y muestran discrepancias significativas4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. La relevancia clínica de las propiedades biomecánicas del tejido BP complejo garantiza un modelo animal neonatal, así como un enfoque de pruebas biomecánicas in vivo. Además, las limitaciones con el estudio de la lesión por estiramiento de BP en escenarios complicados de entrega en el mundo real aumentan la dependencia de modelos informáticos que proporcionan métodos que permiten la investigación de los efectos de diversas complicaciones y técnicas de entrega. La clave de la relevancia clínica de estos modelos es su biofidelidad (respuesta humana). 16 y Grimm et al.17 dependen del tejido nervioso de conejo y rata, pero no en el tejido de la presión arterial neonatal. Realizar pruebas biomecánicas in vivo en un modelo animal neonatal clínicamente relevante puede llenar la brecha crítica de datos de BP neonatal no disponibles.
El estudio actual describe un dispositivo de prueba mecánica in vivo y un procedimiento para llevar a cabo pruebas biomecánicas en lechones neonatales de Yorkshire de 3-5 días de edad. El dispositivo consiste en una abrazadera, actuador, célula de carga y sistema de cámara que aplican y monitorean las tensiones y cargas in vivo durante el fallo. El sistema de cámara también permite monitorear la ubicación de la falla durante la ruptura. En general, el sistema permite una caracterización biomecánica detallada de la presión arterial neonatal cuando se somete a estiramiento, proporcionando así las tensiones umbral de la presión arterial y las tensiones por falla mecánica in vivo. Los datos obtenidos pueden mejorar aún más el comportamiento humano (biofidelidad) de los modelos computacionales existentes que están diseñados para investigar los efectos de las fuerzas exógenas y endógenas en el estiramiento de la presión arterial en escenarios de entrega asociados con NBPP.
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Protocol
El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Drexel aprobó todos los procedimientos (#20704).
1. Llegada y aclimatación de animales
- Cuarentena de 1 a 2 lechones de un día de edad durante al menos 24 horas después de la llegada.
- Caincrustar lechones en jaulas limpias y desinfectadas de acero inoxidable (36 en x 48 en x 36 pulgadas) en la ropa de cama con virutas de ala ala y alimentar ad libitum con sustituto de leche de cerdo.
- Mantener la temperatura ambiente a 85 oF para garantizar un ambiente termoneutro.
2. Día del experimento
- Retire la alimentación 2 h antes del experimento.
- Inyectar lechones con una inyección intramuscular de ketamina (10–40 mg/kg)/xilazina (1,5–3,0 mg/kg IM) y transportarlos a través de una jaula de transporte al espacio quirúrgico.
3. Inducción y mantenimiento de la anestesia
- Administrar un anestésico por inhalación de isoflurano del 4% mezclado en oxígeno por cono nasal y confirmar que el animal está profundamente anestesiado mediante la evaluación de la ausencia de reflejos palpebrales y de abstinencia.
- Intubar al animal colocándolo en la posición supina y utilizar un laringoscopio (hoja recta) para ayudar a guiar el tubo de intubación (diámetro 2.5-2 mm) en la tráquea.
- Coloque el animal en el respirador una vez que el tubo de intubación esté asegurado.
- Asegúrese de que los lechones reciban una mezcla de isoflurano (0,25%-3% de mantenimiento), oxígeno y óxido nitroso.
- Proporcione una dosis de fentanilo (10 g/kg) y continúe dando una dosis cada 1-2 h para asegurar una profundidad adecuada continua de analgesia y sedación y para evitar artefactos de movimiento que podrían correr el riesgo de desconexión del tubo endotraqueal.
- Establecer acceso intravenoso (IV) en la vena abdominal subcutánea o en cualquier otra vena periférica.
- Establecer la línea arterial a través de la arteria femoral. Esto se puede hacer de forma no invasiva o mediante la realización de un recorte.
4. Monitoreo y cuidado
- Controle la profundidad de la anestesia confirmando la ausencia de reflejo canthal y la ausencia de respuesta de abstinencia al pellizco del dedo del dedo del dedo del día.
- Realizar un monitoreo continuo de los parámetros fisiológicos durante la anestesia y durante todo el experimento, que incluye presión arterial, electrocardiografía (ECG), CO2de marea final, oximetría de pulso y temperatura corporal.
- Controlar los gases sanguíneos y los azúcares en la sangre cada 0,5–1 h y dar líquidos intravenosos (50% dextrosa y 50% salino normal) a los animales anestesiados más de 1 h a 1 000 cc/kg/día, según sea necesario, para garantizar la feocemia.
- Monitoree el plano anestésico del animal de cerca y con frecuencia. Proporcionar analgesia y/o aumentar la anestesia por inhalantes.
- Mantener al animal a tensión normal de oxígeno mediante el control de los parámetros del ventilador y las dosis de fármacos según sea necesario para asegurar la normoxia, a continuación, colocar el animal en una manta de agua circulante regulada por la temperatura de tal forma que la temperatura corporal normal se mantenga a 39 oC durante el experimento.
5. Cirugía del Plexo Braquial
- Colocar al animal en posición supina en la mesa de operaciones después de la anestesia adecuada como se describe en la sección 3, con la extremidad superior en el secuestro, exponiendo la región axilar.
- Use cualquier cortina quirúrgica para cubrir al animal. Utilice técnicas limpias pero no estériles.
- Exponer el complejo del plexo braquial en ambos lados de la columna vertebral haciendo una incisión de línea media (usando una cuchilla #10) sobre la piel y la fascia sobre la tráquea, hasta el tercio superior del esternón, correspondiente a los niveles de la columna vertebral entre C3–T3.
- Extrapolar la incisión usando los fórceps y el hemostat horizontalmente a cada lado desde la muesca supraesternal a lo largo del borde de la clavícula hasta la parte superior del brazo, mientras se ahorran las venas cefálicas y basilicas.
- Liberar las aletas superiores e inferiores mediante disección contundente utilizando tijeras y fórceps, permitiendo el acceso a las regiones cervical y torácica del plexo braquial, respectivamente.
- Identifique el eje (C2) y el primer nervio en la T1. Usando estos puntos de referencia, identifique las tres inferiores cervicales (C6–C8) y el primer foramen vertebral espinal torácico (T1), luego examine el plexo cuidadosamente para localizar las bifurcaciones de las divisiones (forma M) para lograr la exposición.
- Etiquetar (usando bucles nerviosos) las regiones del plexo braquial por encima de estas bifurcaciones más cerca de la columna vertebral como raíz / tronco y etiquetar los que están por debajo de estas bifurcaciones como acorde seguido por el nervio, que se encuentran más cerca del brazo.
6. Pruebas biomecánicas
- Configuración del dispositivo de prueba biomecánico
NOTA: Se diseñó y fabricó un dispositivo de prueba mecánico personalizado para funcionar en el tramo in vivo de la BP(Figura 1).- Fije la base de la configuración a un carro.
- Fije el actuador electromecánico a la base utilizando abrazaderas C grandes. El actuador es capaz de proporcionar 150 libras de fuerza, 10" de carrera, y la velocidad de 15 mm / s. La velocidad se puede reducir a 0,2 mm/s y seguir funcionando como se desee.
- Conecte la célula de carga de 200 N al actuador.
- Fije (atornillar) una abrazadera a la célula de carga que consiste en plexiglás acolchado, que evita la concentración de tensión en el sitio de sujeción.
- Conecte una cámara a un trípode. Asegúrese de que la cámara tiene la capacidad de grabar hasta 120 f/s a una resolución de 658 x 4926 píxeles.
- Conecte los cables USB de la cámara, el actuador y la celda de carga al ordenador para integrar y sincronizar todos los componentes de la configuración.
- Conecte el ordenador, el actuador y la celda de carga a una fuente de alimentación.
- Calibre la celda de carga antes de registrar las cargas aplicadas. Para ello, siga estos pasos:
- Ajuste el actuador en un ángulo de 90o utilizando el mango ajustable y comprobando el ángulo con un transportador.
- Abra el software que funciona con la celda de carga (Tabla de materiales). Pulse el botón Inicio para mostrar una lectura en vivo de voltaje.
- Cuelgue los pesos de la abrazadera que van de 0 a 1.000 g en incrementos de 100 g desde la configuración y registre las tensiones medidas.
- Calcular la ecuación lineal de los voltajes y pesos mediante la búsqueda de la pendiente (m) y la interceptación (b). Esto se hace usando un programa de hoja de cálculo y la función de pendiente incluida para calcular b a partir de la Ecuación 1 a continuación. Inserte la Ecuación 2 que se muestra a continuación en el código de configuración mecánica.
Ecuación 1: b - y - mx
Donde: y es el peso, x es el voltaje, m es la pendiente, y b es la intercepción (constante).
Ecuación 2: y á mx + b
Donde: y es el peso, x es el voltaje, m es la pendiente, y b es la constante.
- Pruebas: el nervio BP se corta y se ancla a la configuración de prueba mediante una abrazadera hecha a medida.
- Corta el nervio BP usando tijeras finas.
- Sujete el lado cortado del nervio BP en la abrazadera a medida como se muestra en la Figura 1.
- Coloque manualmente la pintura acrílica negra o la tinta de la India en el segmento BP sujeto(Figura 2).
- Coloque una rejilla de calibración, que es una regla de 1 cm, plana dentro del animal para establecer la escala para el análisis de datos.
- Utilice el software de la cámara para ver la colocación de la cámara directamente sobre los segmentos probados, permitiendo así la monitorización del movimiento/desplazamiento de los marcadores y la determinación de la tensión tisular real en cualquier punto de tiempo.
- Registre las mediciones iniciales, como la altura a la que el nervio se inserta en el cuerpo desde la mesa y la altura de la abrazadera de la mesa, el ángulo del actuador y la longitud completa del tejido.
- Abra el software de programación (tabla que contiene la interfaz gráfica de usuario [GUI] como se muestra en la Figura 3).
- Ejecute la GUI pulsando el botón Ejecutar.
- Inicializar el sistema pulsando el botón Inicializar.
- Tare el sistema pulsando el botón Tare.
- Estire el segmento BP pulsando el botón de prueba de inicio. Esto tira del tejido a una velocidad asignada de 500 mm/min hasta que se produzca un fallo completo en cualquier segmento de la presión arterial. Esta tasa de estiramiento se selecciona en base a la literatura disponible4,8,18. El programa también guarda un archivo de vídeo, la carga de tracción aplicada, el desplazamiento del tejido y la duración de la prueba.
- Registre el sitio de falla, que es el punto en el que se rompe el tejido.
- Eutanasia: lechones eutanasia al final del experimento con una dosis letal de pentobarbital (120 mg/kg i.v.).
- Análisis de datos: utilice un software de seguimiento de movimiento para el análisis de los vídeos adquiridos durante las pruebas.
- Abra el archivo de vídeo desde el experimento dentro del software de seguimiento de movimiento seleccionando Archivo . Abra Archivo de vídeo.
- Utilice la cuadrícula de calibración para configurar la escala en el software de seguimiento de movimiento utilizando la herramienta Línea, haciendo clic con el botón derecho en la línea después de dibujarla, seleccionando Calibrar medidae introduciendo un valor conocido en centímetros (Figura 4).
- Realice un seguimiento de los marcadores en el tejido dentro del software de seguimiento de movimiento haciendo clic con el botón derecho en el vídeo y seleccionando Track Path y alineando el centro del marcador con el marcador en el tejido y tachándolo hasta que se rompa.
- Exporte las coordenadas x e y de los marcadores seleccionando Exportar archivo a hoja de cálculo para que se pueda utilizar para calcular las deformaciones unitarias.
- Importe los datos en un software de programación para calcular la distancia entre las coordenadas x e y a lo largo del tiempo para calcular las deformaciones unitarias.
- Calcule los valores de deformación unitaria en cada punto de tiempo dividiendo el cambio de distancia por la distancia original después de tener en cuenta los cambios de inclinación durante el estiramiento. Los valores de deformación unitaria reales se determinan entre cada par de marcadores adyacentes en cada punto de tiempo. También se calcula el promedio de estas cepas.
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Representative Results
En la Figura 5 y la Figura 6, respectivamente, se muestran una gráfica representativa de tiempo de carga y deformaciones unitarias de cuatro segmentos del plexo BP (entre cuatro marcadores). La carga de fallas obtenida de 8,3 N a una tensión de falla media del 35% informa de las respuestas biomecánicas de la presión arterial neonatal cuando se somete a estiramiento. Algunas regiones del nervio experimentan cepas más altas que otras, indicativas de lesiones no uniformes a lo largo de la longitud del nervio. Los datos de la cámara permiten informar de la ubicación del fallo que es proximal al foramen.
Figura 1: Detalles del dispositivo de prueba mecánico in vivo, incluyendo el actuador, la célula de carga y la abrazadera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Marcadores colocados sobre los segmentos de la PRESIÓN arterial para registrar las tensiones sostenidas por el tejido durante el estiramiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Pasos para la adquisición de datos mediante la interfaz gráfica de usuario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Detallesde seguimiento de marcadores y análisis de deformación unitaria . Los vídeos de prueba guardados en formato AVI se importan en el software de seguimiento. La tensión entre cada marcador y el primer y último marcador se obtiene como se detalla. Un promedio de entre las cepas de marcadores se utiliza para informar de las cepas de error. Un ejemplo de estiramiento nervioso con tres marcadores y la gráfica de tiempo de deformación unitaria promedio calculada se muestran aquí, con cepas de falla reportadas del 43%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Carga máxima notificada durante el error. La célula de carga conectada al actuador adquiere los datos de carga durante el estiramiento. Los datos se utilizan para obtener una gráfica de tiempo de carga como se muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Tensiones notificadas en cuatro segmentos diferentes del plexo estirado. Las deformaciones unitarias se calculan entre cada marcador y se comparan con las deformaciones unitarias medias obtenidas de los cuatro segmentos (entre cada uno de los dos marcadores adyacentes). Algunas regiones del nervio experimentan cepas más altas que otras y las cepas medias indicativas de lesiones no uniformes a lo largo de la longitud del nervio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La literatura disponible sobre las respuestas biomecánicas del estiramiento en el tejido BP exhibe una amplia gama de valores umbral, así como discrepancias metodológicas4,6,8,18,19,20,21,22,23. Las variaciones en los resultados publicados podrían deberse a diferencias en el procesamiento de tejidos (por ejemplo, tejido fijo frente a tejido no fijo), diferencias metodológicas en la medición del alargamiento y diferencias en las especies utilizadas. Además, estos datos se obtienen de animales adultos o cadáveres humanos y no de neonatos. Las razones éticas dificultan la obtención de datos mecánicos de neonatos humanos vivos, por lo que en su lugar se pueden utilizar modelos animales grandes que tienen similitudes anatómicas con los seres humanos. Los lechones sirven como modelo animal que ya se ha utilizado en estudios relacionados con la presión arterial6,24.
Los métodos y la configuración propuestos permiten medir la respuesta biomecánica in vivo de la presión arterial neonatal en un modelo animal grande, ofreciendo una comprensión del mecanismo de lesión durante el estiramiento de la presión arterial. Si bien el protocolo de prueba y la configuración son robustos, ofrece algunas limitaciones (es decir, resbalones que ocurren durante las pruebas mecánicas, pérdida de visibilidad del marcador durante las pruebas, movimiento de todo el cuerpo cuando se produce la prueba). Mientras que los resbalones se producen durante las pruebas, asegurar una sujeción adecuada puede minimizar el deslizamiento. Agregar acolchado puede asegurar aún más el tejido y evitar resbalones. Las abrazaderas también se pueden sustituir fácilmente con otros tipos diferentes de abrazaderas según sea necesario. La pérdida de visibilidad del marcador se produce en menos del 2% de los casos y son inevitables. Asegurar el torso animal durante las pruebas puede requerir una plataforma de fijación. Dado que la configuración permite el seguimiento del movimiento de inserción a través de un sistema de cámara, da cuenta de cualquier movimiento animal durante las pruebas. Una limitación adicional del sistema es su capacidad para proporcionar una vista de cámara en vivo a través de un programa separado, limitando así la vista de la cámara en vivo durante las pruebas. Esto se puede mejorar en el futuro mediante la integración de una vista de cámara en vivo en el programa que se utiliza actualmente para ejecutar la prueba.
En resumen, NBPP es una lesión significativa con secuencias de por vida para muchas personas. Desafortunadamente, en las últimas tres décadas no ha habido una disminución en la tasa de ocurrencia, a pesar del mayor desarrollo tecnológico y la formación de obstetras. Esta falta de una disminución de la ocurrencia puede atribuirse directamente a las limitaciones en el desarrollo de estrategias preventivas que minimicen la aparición de NBPP. Las estrategias preventivas no se pueden explorar hasta que se disponga de una comprensión detallada del mecanismo de lesiones en todos los niveles (es decir, mecánico, funcional e histológico). Hasta la fecha no se ha divulgado ningún método para medir las cepas de BP in vivo en un modelo neonatal de animales grandes, y el estudio actual es el primero en ofrecer un protocolo que explora aún más los cambios fisiológicos y funcionales en el tejido de la presión arterial neonatal después del estiramiento. Mediante la realización de pruebas en diversas cepas, se pueden notificar valores umbrales de lesiones para lesiones funcionales y estructurales en el plexo braquial neonatal.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional Eunice Kennedy Shriver de Salud Infantil y Desarrollo Humano de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número R15HD093024 y por el Premio CAREER de la Fundación Nacional de Ciencias Número 1752513.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Omega Subminature Tension & Compression Load Cell | Omega | LCM201-200N | 200N load cell |
| Basler acA640-120uc camera | Basler | acA640-120uc | |
| Feedback Linear Actuator | Progressive Automations | PA-14P | 10" stroke, 150lb force, 15mm/s speed |
| Motion Tracking Software | Kinovea | N/A | Open Source |
| Proramming Software - MATLAB | Mathworks | N/A | version 2018A |
| Surgical instruments | |||
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 |
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