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Genetics

Einzellige RNA-Sequenzierung und Analyse menschlicher Pankreas-Inseln

Published: July 18, 2019
doi:
10.3791/59866
, , , , , , ,
1Regeneron Pharmaceuticals, Inc

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Generierung hochwertiger, großflächiger Transkriptomdaten einzelner Zellen aus isolierten menschlichen Pankreasinseln unter Verwendung einer tropfenbasierten mikrofluidischen einzelligen RNA-Sequenzierungstechnologie vor.

Abstract

Pankreasinseln bestehen aus endokrinen Zellen mit ausgeprägten Hormonexpressionsmustern. Die endokrinen Zellen zeigen funktionelle Unterschiede in der Reaktion auf normale und pathologische Bedingungen. Ziel dieses Protokolls ist es, hochwertige, groß angelegte Transkriptomdaten jedes endokrinen Zelltyps unter Verwendung einer tropfenbasierten mikrofluidischen einzelzelligen RNA-Sequenzierungstechnologie zu generieren. Solche Daten können verwendet werden, um das Genexpressionsprofil jedes endokrinen Zelltyps unter normalen oder spezifischen Bedingungen zu erstellen. Der Prozess erfordert eine sorgfältige Handhabung, genaue Messung und eine strenge Qualitätskontrolle. In diesem Protokoll beschreiben wir detaillierte Schritte für die Dissoziation, Sequenzierung und Datenanalyse menschlicher Pankreasinseln. Die repräsentativen Ergebnisse von rund 20.000 menschlichen Einzel-Isletzellen zeigen die erfolgreiche Anwendung des Protokolls.

Introduction

Pankreasinseln setzen endokrine Hormone frei, um den Blutzuckerspiegel zu regulieren. An dieser wesentlichen Rolle sind fünf endokrine Zelltypen beteiligt, die sich funktionell und morphologisch unterscheiden: Die Zellen produzieren Glucagon, Insulin, Somatostatin, PP-Zellen Pankreaspolypeptid und ghrelin1. Genexpressionsprofilierung ist ein nützlicher Ansatz, um die endokrinen Zellen unter normalen oder spezifischen Bedingungen zu charakterisieren. Historisch gesehen wurde die gesamte Islet-Genexpression Profilierung mit Microarray und RNA-Sequenzierung der nächsten Generationerstellt 2,3,4,5,6,7 , 8. Obwohl das gesamte Islet-Transkriptom informativ ist, um die organspezifischen Transkripte und Krankheitskandidatengene zu identifizieren, gelingt es ihm nicht, die molekulare Heterogenität jedes Ischenzelltyps aufzudecken. Lasercapture Microdissection (LCM) Technik wurde angewendet, um spezifische Zelltypen direkt von Inselchen9,10,11,12 zu erhalten, aber unter der Reinheit der Zielzelle bevölkerung. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) verwendet, um spezifische endokrine Zellpopulationen auszuwählen, wie z. B. die Zellen13,14,15,16 , 17 , 18. Darüber hinaus verwendeten Dorrell et al. einen antikörperbasierten FACS-Sortieransatz, um die Zellen in vier Subpopulationen zu klassifizieren19. FACS-sortierte Isletzellen können auch für die RNA-Sequenzierung einzelner Zellen plattiert werden; Die plattenbasierten Methoden stehen jedoch vor Herausforderungen in der Skalierbarkeit20,21,22.

Um hochwertige, groß angelegte Transkriptomdaten jedes endokrinen Zelltyps zu generieren, haben wir mikrofluidische Technologie auf menschliche Ischenzellen angewendet. Die mikrofluidische Plattform generiert Transkriptomdaten aus einer großen Anzahl von Einzelzellen in hoher Durchsatz- und Qualitäts- und Skalierbare Art und Weise23,24,25,26,27. Die hochskalierbare mikrofluidische Plattform zeigt nicht nur die molekularen Eigenschaften eines in großer Menge erfassten Zelltyps auf, sondern ermöglicht auch die Identifizierung seltener Zelltypen, wenn genügend Zellen zur Verfügung gestellt werden. Daher erlaubte die Anwendung der Plattform auf menschliche Pankreasinseln die Profilierung von Ghrelin-Sekretionszellen, einem seltenen endokrinen Zelltyp mit wenig bekannter Funktion aufgrund seiner Knappheit28. In den letzten Jahren wurden mehrere Studien von uns und anderen veröffentlicht, die umfangreiche Transkriptome-Daten menschlicher Inselchen mit der Technologie29,30,31,32, 33. Die Daten sind öffentlich zugänglich und nützliche Ressourcen für die Islet-Gemeinschaft, um die heterokrine Zellheterogenität und ihre Auswirkungen auf Krankheiten zu untersuchen.

Hier beschreiben wir ein tropfenbasiertes mikrofluidisches, einzelliges RNA-Sequenzierungsprotokoll, das zur Erstellung von Transkriptomdaten von ca. 20.000 menschlichen Ischenzellen verwendet wurde, einschließlich der zellen- und nichtendokrinen Zellen, einschließlich der Zellen von , , , , , , PP, 32. Der Workflow beginnt mit isolierten menschlichen Inselchen und zeigt Schritte der Inselzelldissoziation, Einzelzellerfassung und Datenanalyse. Das Protokoll erfordert die Verwendung von frisch isolierten Inselchen und kann auf Inselchen von Menschen und anderen Arten, wie Nagetieren, angewendet werden. Mit diesem Workflow können unvoreingenommene und umfassende Isletzellatlas unter Baseline und anderen Bedingungen erstellt werden.

Protocol

1. Menschliche Islet-Dissoziation Erhalten Sie menschliche Inselchen isoliert von Kadaver Organspendern beiderlei Geschlechts, im Alter zwischen 15-80 Jahren, ohne bereits bestehende Krankheiten, es sei denn Inselchen von Spendern mit spezifischen demographischen sind für den Studienzweck erforderlich. Nach der Isolierung die isolierten Inselchen 2-3 Tage beim Lieferanten in der Gewebekulturanlage aufbewahren lassen. Es dauert oft mehr als 1 Tag, bis Diebesschäden sichtbar werden. Legen Sie…

Representative Results

Der einzellige RNA-Sequenzierungsworkflow besteht aus drei Schritten: Dissoziierung intakter menschlicher Inselchen in einzelzellige Suspension, Erfassung einzelner Zellen mit einer Tröpfchen-basierten Technologie und Analyse von RNA-Seq-Daten (Abbildung 1). Erstens wurden die erworbenen menschlichen Inseln über Nacht inkubiert. Die intakten Inseln wurden unter dem Mikroskop untersucht (Abbildung 2A). Die Integrität dissoziier…

Discussion

Einzellige Technologien, die in den letzten Jahren entwickelt wurden, bieten eine neue Plattform, um Zelltypen zu charakterisieren und molekulare Heterogenität in menschlichen Pankreasinseln zu untersuchen. Wir haben ein Protokoll der tropfenbasierten mikrofluidischen Einzelzellisolierung und Datenanalyse zur Untersuchung menschlicher Inselchen angenommen. Unser Protokoll produzierte erfolgreich RNA-Sequenzierungsdaten aus über 20.000 einzelnen menschlichen Ischenzellen mit relativ geringen Variationen in Sequenzqualit…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

nichts

Materials

30 µm Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec 130-041-407 Cell strainer
8-chamber slides Chemometec 102673-680 Dell counting assay slides
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 for QC
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647 Single cell media
Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns 10X Genomics 120237 Single cell reagents
Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) 10X Genomics 120236 Microfluidic chips
CMRL-1066 ThermoFisher 11530-037 Complete islet media
EB Buffer Qiagen 19086 Elution buffer
Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted VWR 47744-112 Emulsion plate
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 16000-036 Complete islet media
Human islets Prodo Labs HIR Isolated human islets
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher 25030-081 Complete islet media
Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) Illumina FC-121-1031 Library preparation reagents
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) Illumina FC-404-2005 Sequencing
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher 15140-122 Complete islet media
Qubit High Sensitivity dsDNA Kit Life Technologies Q32854 for QC
Solution 18 Chemometec 103011-420 Cell counting assay reagent
SPRISelect Reagent Fisher Scientific B23318 Purification beads
Tissue Culture Dishes (10 cm) VWR 10861-594 for islet culture
TrypLE Express Life Technologies 12604-013 Cell dissociation solution
Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions VWR 77001-152 Library clean up columns
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Xin, Y., Adler, C., Kim, J., Ding, Y., Ni, M., Wei, Y., Macdonald, L., Okamoto, H. Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets. J. Vis. Exp. (149), e59866, doi:10.3791/59866 (2019).
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