Summary

Enkelt celle-RNA-sekvensering og analyse af humane bugspytkirtel-øer

Published: July 18, 2019
doi:

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at generere høj kvalitet, storstilet transkriptomer data af enkeltceller fra isolerede menneskelige pancreas Holme ved hjælp af en dråbe baseret mikrofluidisk enkelt celle RNA sekventering teknologi.

Abstract

Pancreasøer består af endokrine celler med karakteristiske hormon udtryks mønstre. De endokrine celler viser funktionelle forskelle som reaktion på normale og patologiske tilstande. Målet med denne protokol er at generere høj kvalitet, storstilet transkriptomer data for hver endokrine celletype med brug af en dråbe baseret mikrofluidisk enkelt celle RNA sekventering teknologi. Sådanne data kan udnyttes til at opbygge genekspressions profilen for hver endokrine celletype under normale eller specifikke forhold. Processen kræver omhyggelig håndtering, nøjagtig måling og streng kvalitetskontrol. I denne protokol beskriver vi detaljerede trin for humane pancreasislets dissociation, sekvensering og dataanalyse. De repræsentative resultater af ca. 20.000 humane enkelt-ø-celler viser, at protokollen er blevet gennemført korrekt.

Introduction

Pancreasislets frigive endokrine hormoner til at regulere blodsukkerniveauet. Fem endokrine celletyper, der adskiller sig funktionelt og morfologisk, er involveret i denne væsentlige rolle: α-celler producerer Glucagon, β-celler insulin, δ-celler somatostatin, PP celler Pankreatisk polypeptid, og ε-celler Ghrelin1. Genekspression profilering er en nyttig metode til at karakterisere de endokrine celler under normale eller specifikke forhold. Historisk set blev hele øen gen Expression profilering genereret ved hjælp af microarray og næste generations RNA-sekvensering2,3,4,5,6,7 , 8. selv om hele øen transkriptomet er informativt at identificere de orgel-specifikke udskrifter og sygdoms kandidat gener, det undlader at afdække den molekylære heterogenitet af hver ø celletype. Laser opsamling microdissection (LCM) teknik er blevet anvendt til direkte at opnå specifikke celletyper fra Holme9,10,11,12 , men falder kort af renhed af den målrettede celle Befolkning. For at overvinde disse begrænsninger er der anvendt fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) til at udvælge specifikke endokrine cellepopulationer, såsom α-og β-celler13,14,15,16 , 17 , 18. Desuden anvendte dorrell et al. en antistof-baseret FACS sortering tilgang til at klassificere β-celler i fire delpopulationer19. FACS-sorteret ø-celler kan også være belagt til RNA-sekvensering af enkeltceller; men de plade baserede metoder står over for udfordringer i skalerbarhed20,21,22.

For at generere høj kvalitet, storstilet transkriptomer data for hver endokrine celletype, vi anvendt mikrofluidisk teknologi til menneskelige ø-celler. Den mikrofluidisk platform genererer transkriptomer data fra et stort antal enkeltceller i en høj gennemløb, høj kvalitet, og skalerbar måde23,24,25,26,27. Ud over at afsløre molekylære karakteristika for en celletype, der er fanget i en stor mængde, muliggør yderst skalerbar mikrofluidisk-platform identifikation af sjældne celletyper, når der er nok celler til rådighed. Derfor, anvendelse af platformen til menneskelige pancreas Holme tilladt profilering af Ghrelin-secernerende ε-celler, en sjælden endokrine celletype med lidt kendt funktion på grund af sin knaphed28. I de seneste år er flere undersøgelser blevet offentliggjort af os og andre rapporterer store transkriptomer data af menneskelige Holme ved hjælp af teknologien29,30,31,32, 33. Dataene er offentligt tilgængelige og nyttige ressourcer for den ø samfund til at studere endokrine celle heterogenitet og dens konsekvenser i sygdomme.

Her beskriver vi en dråbe baseret mikrofluidic enkelt celle-RNA-sekvente Rings protokol, som er blevet brugt til at fremstille transkriptomdata på ca. 20.000 humane ø-celler, herunder α-, β-, δ-, PP-, ε-celler og en mindre del af ikke-endokrine celler 32. arbejdsprocessen starter med isolerede menneskelige Holme og skildrer trin af ø-celle dissociation, enkelt celle opsamling og dataanalyse. Protokollen kræver brug af frisk isolerede Holme og kan anvendes til Holme fra mennesker og andre arter, såsom gnavere. Ved hjælp af denne arbejdsgang, upartisk og omfattende ø-celle Atlas under baseline og andre betingelser kan bygges.

Protocol

1. den menneskelige ø dissociation Opnå menneskelige øer isoleret fra Kadaver organdonorer af enten køn, aldre mellem 15-80 år, uden præ-eksisterende sygdomme, medmindre Holme fra donorer med specifik demografi er nødvendige for undersøgelsens formål. Efter isolation, har de isolerede Holme holdes i vævskultur facilitet for 2-3 dage hos leverandøren. Det tager ofte mere end 1 dag for Islet skader at blive synlige. Placer Holme i en flaske og nedsænk den helt i den ø-medium. Få d…

Representative Results

Enkelt cellens RNA-sekvensering består af tre trin: dissociering af intakte humane Holme i enkelt cellesuspension, opsamling af enkeltceller ved hjælp af en dråbe baseret teknologi og analyse af RNA-SEQ-data (figur 1). For det første blev de erhvervede menneskelige Holme inkuberet natten over. De intakte Holme blev undersøgt under mikroskop (figur 2a). Integriteten af dissocierede ø-celler er blevet valideret ved anvendelse…

Discussion

Single-celle teknologier udviklet i de seneste år giver en ny platform til at karakterisere celletyper og studere Molekylær heterogenitet i humane bugspytkirtel Holme. Vi vedtog en protokol af droplet-baseret mikrofluidisk enkelt celle isolation og dataanalyse for at studere menneskelige Holme. Vores protokol har med succes produceret RNA-sekvensering af data fra over 20.000 enkelt menneskelige ø-celler med relativt små variationer i sekvens kvalitet og batch effekter.

Især er to trin afg…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ingen

Materials

30 µm Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec 130-041-407 Cell strainer
8-chamber slides Chemometec 102673-680 Dell counting assay slides
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 for QC
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647 Single cell media
Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns 10X Genomics 120237 Single cell reagents
Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) 10X Genomics 120236 Microfluidic chips
CMRL-1066 ThermoFisher 11530-037 Complete islet media
EB Buffer Qiagen 19086 Elution buffer
Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted VWR 47744-112 Emulsion plate
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 16000-036 Complete islet media
Human islets Prodo Labs HIR Isolated human islets
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher 25030-081 Complete islet media
Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) Illumina FC-121-1031 Library preparation reagents
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) Illumina FC-404-2005 Sequencing
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher 15140-122 Complete islet media
Qubit High Sensitivity dsDNA Kit Life Technologies Q32854 for QC
Solution 18 Chemometec 103011-420 Cell counting assay reagent
SPRISelect Reagent Fisher Scientific B23318 Purification beads
Tissue Culture Dishes (10 cm) VWR 10861-594 for islet culture
TrypLE Express Life Technologies 12604-013 Cell dissociation solution
Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions VWR 77001-152 Library clean up columns

References

  1. Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
  2. Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
  3. Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
  4. Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
  5. Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
  6. Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
  7. Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
  8. van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
  9. Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
  10. Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  11. Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
  12. Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  13. Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
  14. Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
  15. Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
  16. Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
  17. Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
  18. Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
  19. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
  20. Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
  21. Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
  22. Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
  23. Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
  24. Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
  25. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  26. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  27. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
  28. Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
  29. Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  30. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
  31. Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
  32. Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
  33. Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
  34. Chemometec. . Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
  35. 10X Genomics. . 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , (2017).
  36. Agilent Technologies. . Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , (2013).
  37. Thermo Fischer Scientific. . Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , (2015).
  38. Illumina. . Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , (2016).
  39. Illumina. . llumina NextSeq 500 System Guide. , (2018).
  40. Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
  41. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
  42. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
  43. DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
  44. McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
  45. Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
  46. Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
  47. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  48. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
  49. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).

Play Video

Cite This Article
Xin, Y., Adler, C., Kim, J., Ding, Y., Ni, M., Wei, Y., Macdonald, L., Okamoto, H. Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets. J. Vis. Exp. (149), e59866, doi:10.3791/59866 (2019).

View Video