Summary

Séquençage et analyse de l'ARN unicellulaire des îlots pancréatiques humains

Published: July 18, 2019
doi:

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour produire des données de transcriptome de haute qualité et à grande échelle des cellules simples des îlots pancréatiques humains isolés utilisant une technologie microfluidique de séquençage d’ARN à base de gouttelettes.

Abstract

Les îlots pancréatiques se composent de cellules endocriniennes avec des modèles distinctifs d’expression d’hormone. Les cellules endocriniennes montrent des différences fonctionnelles en réponse à des conditions normales et pathologiques. L’objectif de ce protocole est de générer des données de transcriptome de haute qualité à grande échelle de chaque type de cellules endocriniennes à l’utilisation d’une technologie de séquençage microfluidique à base de gouttelettes à une seule cellule. Ces données peuvent être utilisées pour établir le profil d’expression génique de chaque type de cellule endocrinienne dans des conditions normales ou spécifiques. Le processus nécessite une manipulation minutieuse, une mesure précise et un contrôle rigoureux de la qualité. Dans ce protocole, nous décrivons des étapes détaillées pour la dissociation, le séquençage, et l’analyse de données des îlots pancréatiques humains. Les résultats représentatifs d’environ 20 000 cellules d’îlet sinispeules humaines démontrent l’application réussie du protocole.

Introduction

Les îlots pancréatiques libèrent des hormones endocriniennes pour réguler les niveaux de glucose dans le sang. Cinq types de cellules endocriniennes, qui diffèrent fonctionnellement et morphologiquement, sont impliqués dans ce rôle essentiel : les cellules de l’apo, produisent du glucagon, de l’insuline des cellules, de la somatostatine des cellules PP, du polypeptide pancréatique et de la ghrélinedescellules de l’apo 1. Le profilage de l’expression génique est une approche utile pour caractériser les cellules endocriniennes dans des conditions normales ou spécifiques. Historiquement, l’ensemble du profilage de l’expression génique des îaux a été généré à l’aide du microréseau et du séquençage de l’ARN de nouvelle génération2,3,4,5,6,7 , 8. Bien que le transcriptome entier d’îtte soit instructif pour identifier les transcriptions d’organe-spécifiques et les gènes candidats de maladie, il ne découvre pas l’hétérogénéité moléculaire de chaque type de cellule d’îtal. La technique de microdissection de capture de laser (LCM) a été appliquée pour obtenir directement des types de cellules spécifiques des îlots9,10,11,12 mais manque la pureté de la cellule visée population. Pour surmonter ces limitations, le tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS) a été utilisé pour sélectionner des populations de cellules endocriniennes spécifiques, telles que les cellules de l’aétée et des cellules13,14,15,16 , 17 Annonces , 18. De plus, Dorrell et coll. ont utilisé une approche de tri FACS à base d’anticorps pour classer les cellules de l’A en quatre sous-populations19. Les cellules d’échafaudaise fac-triées de FACS peuvent également être plaquées pour le séquençage d’ARN des cellules simples ; cependant, les méthodes à base de plaques font face à des défis dans l’évolutivité20,21,22.

Pour générer des données de transcriptome de haute qualité et à grande échelle de chaque type de cellule endocrinienne, nous avons appliqué la technologie microfluidique aux cellules humaines d’isfle. La plate-forme microfluidique génère des données de transcriptome à partir d’un grand nombre de cellules individuelles dans un haut débit, de haute qualité, et de manière évolutive23,24,25,26,27. En plus de révéler les caractéristiques moléculaires d’un type de cellule capturée en grande quantité, plate-forme microfluidique hautement évolutive permet d’identifier les types de cellules rares lorsque suffisamment de cellules sont fournies. Par conséquent, l’application de la plate-forme aux îlots pancréatiques humains a permis le profilage des cellules de la ghréline-sécrétion, un type de cellules endocriniennes rares avec la fonction peu connue due à sa rareté28. Ces dernières années, plusieurs études ont été publiées par nous et d’autres rapportant des données de transcriptome à grande échelle des îlots humains utilisant la technologie29,30,31,32, 33. Les données sont accessibles au public et des ressources utiles pour la communauté des îîaux pour étudier l’hétérogénéité des cellules endocriniennes et son implication dans les maladies.

Ici, nous décrivons un protocole de séquençage microfluidique à base de gouttelettes d’ARN unicellulaire, qui a été utilisé pour produire des données de transcriptome d’environ 20 000 cellules d’isfle-d’œil humain, y compris des cellules d’isflement, y compris des cellules non endocriniens, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non endocriniens, y compris des cellules non endocriniennes, y compris des cellules non en 32. Le flux de travail commence par des îlots humains isolés et représente des étapes de dissociation des cellules des îlots, de capture d’une seule cellule et d’analyse des données. Le protocole exige l’utilisation d’îlots fraîchement isolés et peut être appliqué aux îlots de l’homme et d’autres espèces, comme les rongeurs. À l’aide de ce flux de travail, un atlas de cellules d’islet impartial et complet dans des conditions de référence et d’autres conditions peut être construit.

Protocol

1. Dissociation des islets humains Obtenir des îlots humains isolés chez les donneurs d’organes de cadavre de l’un ou l’autre sexe, âgés entre 15 et 80 ans, sans maladies préexistantes, à moins que des îlots de donneurs ayant des données démographiques spécifiques ne soient nécessaires aux fins de l’étude. Après l’isolement, faire garder les îlots isolés dans l’installation de culture tissulaire pendant 2-3 jours chez le fournisseur. Il faut souvent plus d’un jour pour que les dommages ca…

Representative Results

Le flux de travail de séquençage de l’ARN à cellule unique se compose de trois étapes : dissocier les îlots humains intacts en suspension à cellule unique, capturer les cellules individuelles à l’aide d’une technologie à base de gouttelettes et analyser les données DE l’ARN-seq (figure 1). Tout d’abord, les îlots humains acquis ont été incubés pendant la nuit. Les îlots intacts ont été examinés au microscope (Figure 2A</s…

Discussion

Les technologies unicellulaires développées ces dernières années fournissent une nouvelle plate-forme pour caractériser les types de cellules et étudier l’hétérogénéité moléculaire dans les îlots pancréatiques humains. Nous avons adopté un protocole d’isolement microfluidique à base de gouttelettes unicellulaire et d’analyse de données pour étudier les îlots humains. Notre protocole a produit avec succès des données de séquençage de l’ARN à partir de plus de 20 000 cellules d’ists humains uniques …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

aucun

Materials

30 µm Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec 130-041-407 Cell strainer
8-chamber slides Chemometec 102673-680 Dell counting assay slides
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 for QC
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647 Single cell media
Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns 10X Genomics 120237 Single cell reagents
Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) 10X Genomics 120236 Microfluidic chips
CMRL-1066 ThermoFisher 11530-037 Complete islet media
EB Buffer Qiagen 19086 Elution buffer
Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted VWR 47744-112 Emulsion plate
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 16000-036 Complete islet media
Human islets Prodo Labs HIR Isolated human islets
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher 25030-081 Complete islet media
Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) Illumina FC-121-1031 Library preparation reagents
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) Illumina FC-404-2005 Sequencing
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher 15140-122 Complete islet media
Qubit High Sensitivity dsDNA Kit Life Technologies Q32854 for QC
Solution 18 Chemometec 103011-420 Cell counting assay reagent
SPRISelect Reagent Fisher Scientific B23318 Purification beads
Tissue Culture Dishes (10 cm) VWR 10861-594 for islet culture
TrypLE Express Life Technologies 12604-013 Cell dissociation solution
Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions VWR 77001-152 Library clean up columns

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Cite This Article
Xin, Y., Adler, C., Kim, J., Ding, Y., Ni, M., Wei, Y., Macdonald, L., Okamoto, H. Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets. J. Vis. Exp. (149), e59866, doi:10.3791/59866 (2019).

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