एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण और मानव अग्नाशय Islets का विश्लेषण
Summary
यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए उच्च गुणवत्ता उत्पन्न, अलग मानव अग्नाशय islets से एकल कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर transcriptome डेटा एक छोटी बूंद आधारित microfluidic एकल सेल आरएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकी का उपयोग कर.
Abstract
अग्नाशयी आइलेट्स विशिष्ट हार्मोन अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ अंत: स्रावी कोशिकाओं के शामिल. अंत: स्रावी कोशिकाओं सामान्य और रोग की स्थिति के जवाब में कार्यात्मक मतभेद दिखा. इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक छोटी बूंद आधारित microfluidic एकल सेल आरएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के उपयोग के साथ प्रत्येक अंत: स्रावी सेल प्रकार के उच्च गुणवत्ता, बड़े पैमाने पर ट्रांसक्रिप्टम डेटा उत्पन्न करने के लिए है। इस तरह के डेटा सामान्य या विशिष्ट स्थितियों में प्रत्येक अंत: स्रावी सेल प्रकार के जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का निर्माण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. प्रक्रिया सावधान से निपटने, सटीक माप, और कठोर गुणवत्ता नियंत्रण की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम मानव अग्नाशय islets dissociation, अनुक्रमण, और डेटा विश्लेषण के लिए विस्तृत कदम का वर्णन. के बारे में 20,000 मानव एकल islet कोशिकाओं के प्रतिनिधि परिणाम प्रोटोकॉल के सफल आवेदन प्रदर्शित करते हैं.
Introduction
अग्नाशयी आइलेट्स रक्त शर्करा के स्तर को विनियमित करने के लिए अंत: स्रावी हार्मोन जारी करते हैं। पांच अंत: स्रावी सेल प्रकार, जो कार्यात्मक और आकृति विज्ञान के रूप में भिन्न होते हैं, इस आवश्यक भूमिका में शामिल होते हैं: जेड-कोशिकाएं ग्लूकागन काउत्पादन करती हैं, जेड-कोशिकाएं इंसुलिन, जेड-सेल सोमेटोस्टेटिन, पीपी कोशिकाओं अग्नाशयी पॉलीपेप्टाइड, और जेड-सेल ghrelin 1. जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा सामान्य या विशिष्ट स्थितियों में अंत: स्रावी कोशिकाओं की विशेषता के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण है। ऐतिहासिक रूप से, पूरे islet जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा microarray और अगली पीढ़ी के आरएनए अनुक्रमण2,3,4,5,6,7 का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था , 8.हालांकि पूरे आइलेट ट्रांसक्रिप्टम अंग-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्ट्स और रोग उम्मीदवार जीन की पहचान करने के लिए जानकारीपूर्ण है, यह प्रत्येक आइलेट सेल प्रकार की आणविक विषमता को उजागर करने में विफल रहता है। लेजर कब्जा microdissection (LCM) तकनीक islets से सीधे विशिष्ट सेल प्रकार प्राप्त करने के लिए लागू किया गया है9,10,11,12 लेकिन लक्षित सेल की शुद्धता की कमी हो जाती है जनसंख्या. इन सीमाओं को दूर करने के लिए, फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग विशिष्ट अंत: स्रावी कोशिका आबादियों का चयन करने के लिए किया गया है, जैसे कि $- और जेड-कोशिकाओं13,14,15,16 , 17 , 18इसके अलावा, Dorrell एट अल एक एंटीबॉडी आधारित FACS छँटाई दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया चार subpopulations19में $ कोशिकाओं को वर्गीकृत करने के लिए 19 . FACS-sorted islet कोशिकाओं को भी एकल कोशिकाओं के आरएनए अनुक्रमण के लिए चढ़ाया जा सकता है; तथापि, प्लेट आधारित विधियों में मापनीयता20,21,22में चुनौतियों का सामना करना पड़ता है।
उच्च गुणवत्ता उत्पन्न करने के लिए, प्रत्येक अंत: स्रावी सेल प्रकार के बड़े पैमाने पर transcriptome डेटा, हम मानव आइलेट कोशिकाओं के लिए microfluidic प्रौद्योगिकी लागू किया. माइक्रोफ्लूइडिक मंच एक उच्च-थ्रूपुट, उच्च गुणवत्ता वाले, और स्केलेबल तरीके से23,24,25,26,27में बड़ी संख्या में एकल कोशिकाओं से ट्रांसक्रिडम डेटा उत्पन्न करता है। एक बड़ी मात्रा में कब्जा कर लिया एक सेल प्रकार की आणविक विशेषताओं का खुलासा करने के अलावा, उच्च स्केलेबल microfluidic मंच दुर्लभ सेल प्रकार की पहचान जब पर्याप्त कोशिकाओं प्रदान कर रहे हैं सक्षम बनाता है. इसलिए, मानव अग्नाशय islets के लिए मंच के आवेदन ghrelin-secreting -कोशिकाओं की रूपरेखा की अनुमति दी, इसकी कमी28के कारण थोड़ा ज्ञात समारोह के साथ एक दुर्लभ अंत: स्रावी सेल प्रकार. हाल के वर्षों में, कई अध्ययन हमारे द्वारा प्रकाशित किया गया है और दूसरों को प्रौद्योगिकी का उपयोग कर मानव islets के बड़े पैमाने पर ट्रांसक्रिम डेटा रिपोर्टिंग29,30,31,32, 33. डेटा सार्वजनिक रूप से उपलब्ध है और इस्लेट समुदाय के लिए उपयोगी संसाधनों endocrine सेल विषमता और रोगों में इसके निहितार्थ का अध्ययन कर रहे हैं.
यहाँ, हम एक छोटी बूंद-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग लगभग 20,000 मानव आइलेट कोशिकाओं के ट्रांसक्रिम डेटा का उत्पादन करने के लिए किया गया है, जिसमें जेड-, जेड-, पीपी, जेड-सेल, और गैर-एंडोक्रिन कोशिकाओं का एक छोटा अनुपात शामिल है। 32.कार्यप्रवाह पृथक मानव आइलेट्स से प्रारंभ होता है और आइलेट सेल वियोजन, एकल-कक्ष कैप्चर, और डेटा विश्लेषण के चरणों को दर्शाया जाता है. प्रोटोकॉल ताजा अलग islets के उपयोग की आवश्यकता है और इस तरह के कृन्तकों के रूप में मनुष्य और अन्य प्रजातियों से islets के लिए लागू किया जा सकता है। इस कार्यप्रवाह का उपयोग करते हुए, आधारभूत और अन्य स्थितियों के अंतर्गत निष्पक्ष और व्यापक islet सेल एटलस बनाया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हाल के वर्षों में विकसित एकल सेल प्रौद्योगिकियों सेल प्रकार की विशेषता और मानव अग्नाशय islets में आणविक विषमता का अध्ययन करने के लिए एक नया मंच प्रदान करते हैं। हमने मानव आइलेट्स का अध्ययन करने के लिए छोट?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कोई नहीं
Materials
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
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