Single-Cell RNA sekvensering og analyse av Human bukspyttkjertelen holmer
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å generere høykvalitets, store transcriptome data av enkeltceller fra isolerte menneskelige bukspyttkjertel holmer ved hjelp av en dråpe BAS ert mikrovæskebasert med én celle RNA-sekvensering.
Abstract
Bukspyttkjertelen holmer består av endokrine celler med karakteristiske hormon uttrykk mønstre. De endokrine cellene viser funksjonelle forskjeller som svar på normale og patologiske tilstander. Målet med denne protokollen er å generere høy kvalitet, stor skala transcriptome data for hver endokrine celle type med bruk av en dråpe-basert mikrovæskebasert enkelt celle RNA sekvensering teknologi. Slike data kan utnyttes til å bygge genet uttrykk profil av hver endokrine celle type i normale eller spesifikke forhold. Prosessen krever nøye håndtering, nøyaktig måling og streng kvalitetskontroll. I denne protokollen beskriver vi detaljerte trinn for dissosiasjon av menneskelige bukspyttkjertel, sekvensering og dataanalyse. Representative resultatene av ca 20 000 menneskelige enkelt Holme celler demonstrere vellykket anvendelse av protokollen.
Introduction
Bukspyttkjertelen holmer frigjør endokrine hormoner for å regulere blodsukkernivået. Fem endokrine celletyper, som skiller funksjonelt og morfologisk, er involvert i denne viktige rollen: α-celler produserer glukagon, β-celler insulin, δ-celler somatostatin, PP celler bukspyttkjertelen polypeptid, og ε-celler ghrelin1. Gene Expression profilering er en nyttig tilnærming for å karakterisere endokrine celler i normale eller spesifikke forhold. Historisk sett ble hele Holmen genuttrykket profilering generert ved hjelp av Microarray og neste generasjons RNA-sekvensering2,3,4,5,6,7 , 8. selv om hele Holmen transcriptome er informativ å identifisere organ-spesifikke transkripsjoner og sykdom kandidat gener, unnlater den å avdekke den molekylære heterogenitet av hver Holme celle type. Laser Capture microdissection (LCM) teknikken har blitt brukt til å direkte hente bestemte celletyper fra holmer9,10,11,12 men faller kort av renhet av målrettede celle Befolkningen. For å overkomme disse begrensningene, har fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) blitt brukt til å velge bestemte endokrine celle populasjoner, slik som α-og β-celler13,14,15,16 , 17 i , 18. dess, Dorrell et al. brukte en antistoff BAS ert FACS sorterings tilnærming for å klassifisere β-celler i fire subpopulasjoner19. FACS-sorterte Holme celler kan også være belagt for RNA sekvensering av enkeltceller; de plate-baserte metodene står imidlertid overfor utfordringer i skalerbarhet20,21,22.
For å generere høy kvalitet, stor skala transcriptome data for hver endokrine celle type, brukte vi mikrovæskebasert teknologi til menneskelige Holme celler. Mikrovæskebasert-plattformen genererer transcriptome data fra et stort antall enkeltceller i en høy gjennomstrømming, høy kvalitet og skalerbar måte23,24,25,26,27. I tillegg til å avsløre molekylær karakteristikker av en celle type fanget i en stor mengde, gjør svært skalerbar mikrovæskebasert plattform identifisering av sjeldne celletyper når nok celler er gitt. Derfor, anvendelse av plattformen til menneskelige bukspyttkjertelen holmer tillot profilering av ghrelin-sekresjon ε-celler, en sjelden endokrine celle type med lite kjent funksjon på grunn av sin knapphet28. I de senere årene har flere studier blitt offentliggjort av oss og andre som rapporterer store transcriptome data om menneskelige holmer ved hjelp av teknologien29,30,31,32, i 33. Dataene er allment tilgjengelige og nyttige ressurser for Holmen samfunnet å studere endokrine celle heterogenitet og dens konsekvens i sykdommer.
Her beskriver vi en dråpe-basert mikrovæskebasert enkelt celle RNA sekvensering protokoll, som har blitt brukt til å produsere transcriptome data på ca 20 000 menneskelige Holme celler inkludert α-, β-, δ-, PP, ε-celler, og en mindre andel av ikke-endokrine celler 32. arbeidsflyten starter med isolerte menneskelige holmer og viser trinn på Holme Cell dissosiasjon, enkelt celle fangst og dataanalyse. Protokollen krever bruk av fersk isolerte holmer og kan påføres holmer fra mennesker og andre arter, slik som gnagere. Ved hjelp av denne arbeidsflyten, upartisk og omfattende Holme celle Atlas under Baseline og andre forhold kan bygges.
Protocol
Representative Results
Discussion
Single-Cell teknologier utviklet i de senere år gir en ny plattform for å karakterisere celletyper og studere molekylær heterogenitet i menneskelige bukspyttkjertelen holmer. Vi vedtok en protokoll av dråpe-basert mikrovæskebasert enkelt celle isolasjon og dataanalyse for å studere menneskelige holmer. Vår protokoll vellykket produsert RNA sekvensering data fra over 20 000 enkelt menneske Holme celler med relativt små variasjoner i sekvens kvalitet og batch-effekter.
Spesielt er to tri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen
Materials
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
References
- Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
- Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
- Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
- Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
- Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
- Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
- Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
- van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
- Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
- Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
- Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
- Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
- Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
- Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
- Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
- Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
- Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
- Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
- Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
- Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
- Chemometec. . Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
- 10X Genomics. . 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , (2017).
- Agilent Technologies. . Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , (2013).
- Thermo Fischer Scientific. . Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , (2015).
- Illumina. . Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , (2016).
- Illumina. . llumina NextSeq 500 System Guide. , (2018).
- Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
- DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
- McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
- Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
- Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
