Her presenterer vi en protokoll for å generere høykvalitets, store transcriptome data av enkeltceller fra isolerte menneskelige bukspyttkjertel holmer ved hjelp av en dråpe BAS ert mikrovæskebasert med én celle RNA-sekvensering.
Bukspyttkjertelen holmer består av endokrine celler med karakteristiske hormon uttrykk mønstre. De endokrine cellene viser funksjonelle forskjeller som svar på normale og patologiske tilstander. Målet med denne protokollen er å generere høy kvalitet, stor skala transcriptome data for hver endokrine celle type med bruk av en dråpe-basert mikrovæskebasert enkelt celle RNA sekvensering teknologi. Slike data kan utnyttes til å bygge genet uttrykk profil av hver endokrine celle type i normale eller spesifikke forhold. Prosessen krever nøye håndtering, nøyaktig måling og streng kvalitetskontroll. I denne protokollen beskriver vi detaljerte trinn for dissosiasjon av menneskelige bukspyttkjertel, sekvensering og dataanalyse. Representative resultatene av ca 20 000 menneskelige enkelt Holme celler demonstrere vellykket anvendelse av protokollen.
Bukspyttkjertelen holmer frigjør endokrine hormoner for å regulere blodsukkernivået. Fem endokrine celletyper, som skiller funksjonelt og morfologisk, er involvert i denne viktige rollen: α-celler produserer glukagon, β-celler insulin, δ-celler somatostatin, PP celler bukspyttkjertelen polypeptid, og ε-celler ghrelin1. Gene Expression profilering er en nyttig tilnærming for å karakterisere endokrine celler i normale eller spesifikke forhold. Historisk sett ble hele Holmen genuttrykket profilering generert ved hjelp av Microarray og neste generasjons RNA-sekvensering2,3,4,5,6,7 , 8. selv om hele Holmen transcriptome er informativ å identifisere organ-spesifikke transkripsjoner og sykdom kandidat gener, unnlater den å avdekke den molekylære heterogenitet av hver Holme celle type. Laser Capture microdissection (LCM) teknikken har blitt brukt til å direkte hente bestemte celletyper fra holmer9,10,11,12 men faller kort av renhet av målrettede celle Befolkningen. For å overkomme disse begrensningene, har fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) blitt brukt til å velge bestemte endokrine celle populasjoner, slik som α-og β-celler13,14,15,16 , 17 i , 18. dess, Dorrell et al. brukte en antistoff BAS ert FACS sorterings tilnærming for å klassifisere β-celler i fire subpopulasjoner19. FACS-sorterte Holme celler kan også være belagt for RNA sekvensering av enkeltceller; de plate-baserte metodene står imidlertid overfor utfordringer i skalerbarhet20,21,22.
For å generere høy kvalitet, stor skala transcriptome data for hver endokrine celle type, brukte vi mikrovæskebasert teknologi til menneskelige Holme celler. Mikrovæskebasert-plattformen genererer transcriptome data fra et stort antall enkeltceller i en høy gjennomstrømming, høy kvalitet og skalerbar måte23,24,25,26,27. I tillegg til å avsløre molekylær karakteristikker av en celle type fanget i en stor mengde, gjør svært skalerbar mikrovæskebasert plattform identifisering av sjeldne celletyper når nok celler er gitt. Derfor, anvendelse av plattformen til menneskelige bukspyttkjertelen holmer tillot profilering av ghrelin-sekresjon ε-celler, en sjelden endokrine celle type med lite kjent funksjon på grunn av sin knapphet28. I de senere årene har flere studier blitt offentliggjort av oss og andre som rapporterer store transcriptome data om menneskelige holmer ved hjelp av teknologien29,30,31,32, i 33. Dataene er allment tilgjengelige og nyttige ressurser for Holmen samfunnet å studere endokrine celle heterogenitet og dens konsekvens i sykdommer.
Her beskriver vi en dråpe-basert mikrovæskebasert enkelt celle RNA sekvensering protokoll, som har blitt brukt til å produsere transcriptome data på ca 20 000 menneskelige Holme celler inkludert α-, β-, δ-, PP, ε-celler, og en mindre andel av ikke-endokrine celler 32. arbeidsflyten starter med isolerte menneskelige holmer og viser trinn på Holme Cell dissosiasjon, enkelt celle fangst og dataanalyse. Protokollen krever bruk av fersk isolerte holmer og kan påføres holmer fra mennesker og andre arter, slik som gnagere. Ved hjelp av denne arbeidsflyten, upartisk og omfattende Holme celle Atlas under Baseline og andre forhold kan bygges.
Single-Cell teknologier utviklet i de senere år gir en ny plattform for å karakterisere celletyper og studere molekylær heterogenitet i menneskelige bukspyttkjertelen holmer. Vi vedtok en protokoll av dråpe-basert mikrovæskebasert enkelt celle isolasjon og dataanalyse for å studere menneskelige holmer. Vår protokoll vellykket produsert RNA sekvensering data fra over 20 000 enkelt menneske Holme celler med relativt små variasjoner i sekvens kvalitet og batch-effekter.
Spesielt er to tri…
The authors have nothing to disclose.
Ingen
30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |