Sequenciamento de RNA de célula única e análise de ilhotas pancreáticas humanas
Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para gerar de alta qualidade, dados do transcriptoma em grande escala das únicas pilhas das ilhotas pancreatic humanas isoladas usando uma tecnologia de sequenciamento microfluídico do RNA da único-pilha da gota-baseada.
Abstract
As ilhotas pancreáticas compreendem células endócrinas com padrões distintivos de expressão hormonal. As células endócrinas mostram diferenças funcionais em resposta às condições normais e patológicas. O objetivo deste protocolo é gerar dados de transcriptomas de alta qualidade e em grande escala de cada tipo de célula endócrina com o uso de uma tecnologia de sequenciamento de RNA de célula única microfluídico baseada em gotas. Tais dados podem ser utilizados para construir o perfil de expressão gênica de cada tipo de célula endócrina em condições normais ou específicas. O processo exige a manipulação cuidadosa, a medida exata, e o controle rigoroso da qualidade. Neste protocolo, nós descrevemos etapas detalhadas para a dissociação, o sequenciamento, e a análise dos dados dos ilhotas pancreatic humanos. Os resultados representativos de aproximadamente 20.000 pilhas humanas da ilífica única demonstram a aplicação bem sucedida do protocolo.
Introduction
Ilhotas pancreáticas liberar hormônios endócrinos para regular os níveis de glicose no sangue. Cinco tipos de células endócrinas, que diferem funcionalmente e morfologicamente, estão envolvidos neste papel essencial: α-células produzem glucagon, β-células de insulina, δ-células somatostatina, células PP polipeptídeo pancreático, e ε-células grelina1. O perfil da expressão gênica é uma abordagem útil para caracterizar as células endócrinas em condições normais ou específicas. Historicamente, todo o perfil de expressão gênica de Islet foi gerado usando Microarray e sequenciamento de RNA de próxima geração2,3,4,5,6,7 , 8. embora o transcriptoma do Islet inteiro seja informativo para identificar os transcritos órgão-específicos e os genes do candidato da doença, não descobre a heterogeneidade molecular de cada tipo da pilha do Islet. A técnica da microdissecção da captação do laser (LCM) foi aplicada para obter diretamente tipos específicos da pilha dos ilhotas9,10,11,12 mas cai a falta da pureza da pilha alvejada População. Para superar essas limitações, a triagem celular ativada por fluorescência (FACS) tem sido usada para selecionar populações específicas de células endócrinas, como as células α e β-13,14,15,16 , 17 anos de , 18. Além disso, Dorrell et al. utilizaram uma abordagem de triagem de FACS baseada em anticorpos para classificar as células β em quatro subpopulações19. As pilhas da ilhada FACS-classificadas podem igualmente ser chapeadas para arranjar em seqüência do RNA de únicas pilhas; no entanto, os métodos baseados em placa enfrentam desafios na escalabilidade20,21,22.
Para gerar alta qualidade, dados de transcriptoma em grande escala de cada tipo de célula endócrina, aplicamos a tecnologia microfluídico a células de Illet humanas. A plataforma microfluídico gera dados de transcriptoma a partir de um grande número de células individuais em uma maneira de alta taxa de transferência, alta qualidade e escalável23,24,25,26,27. Além de revelar características moleculares de um tipo de célula capturado em uma grande quantidade, a plataforma microfluídico altamente escalável permite a identificação de tipos de células raras quando são fornecidas pilhas suficientes. Assim, a aplicação da plataforma às ilhotas pancreáticas humanas permitiu o perfilamento das ε-células secretores de grelina, um tipo raro de células endócrinas com pouca função conhecida devido à sua escassez28. Nos últimos anos, vários estudos foram publicados por nós e outros relatando dados de transcriptoma em larga escala de ilhotas humanas usando a tecnologia29,30,31,32, 33. Os dados estão disponíveis publicamente e os recursos úteis para a Comunidade do Islet para estudar a heterogeneidade da pilha de glândula endócrina e sua implicação nas doenças.
Aqui, nós descrevemos um protocolo de sequenciamento microfluídico com base em gotas de RNA de célula única, que tem sido usado para produzir dados de transcriptomas de aproximadamente 20.000 células de ilhas humanas, incluindo α-, β-, δ-, PP, ε-Cells, e uma menor proporção de células não-endócrinas 32. o fluxo de trabalho começa com ilhotas humanas isoladas e retrata etapas de dissociação de células de ilhotas, captura de célula única e análise de dados. O protocolo requer o uso de ilhotas recém-isoladas e pode ser aplicado a ilhotas de seres humanos e outras espécies, como roedores. Usando este fluxo de trabalho, untendenciosa e abrangente Islet célula Atlas em linha de base e outras condições podem ser construídas.
Protocol
Representative Results
Discussion
As tecnologias de célula única desenvolvidas nos últimos anos fornecem uma nova plataforma para caracterizar os tipos de células e estudar a heterogeneidade molecular em ilhotas pancreáticas humanas. Nós adotamos um protocolo do isolamento microfluídico da único-pilha da gota-baseado e da análise dos dados para estudar ilhotas humanas. Nosso protocolo produziu com sucesso dados de sequenciamento de RNA de mais de 20.000 células de Ilíadas humanas únicas com variações relativamente pequenas na qualidade da s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nenhum
Materials
| 30 µm Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | Cell strainer |
| 8-chamber slides | Chemometec | 102673-680 | Dell counting assay slides |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | for QC |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Single cell media |
| Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns | 10X Genomics | 120237 | Single cell reagents |
| Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips) | 10X Genomics | 120236 | Microfluidic chips |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | Complete islet media |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
| Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirted | VWR | 47744-112 | Emulsion plate |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000-036 | Complete islet media |
| Human islets | Prodo Labs | HIR | Isolated human islets |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher | 25030-081 | Complete islet media |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-121-1031 | Library preparation reagents |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles) | Illumina | FC-404-2005 | Sequencing |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140-122 | Complete islet media |
| Qubit High Sensitivity dsDNA Kit | Life Technologies | Q32854 | for QC |
| Solution 18 | Chemometec | 103011-420 | Cell counting assay reagent |
| SPRISelect Reagent | Fisher Scientific | B23318 | Purification beads |
| Tissue Culture Dishes (10 cm) | VWR | 10861-594 | for islet culture |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | Cell dissociation solution |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactions | VWR | 77001-152 | Library clean up columns |
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