Summary

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

Published: July 19, 2019
doi:

Summary

Das aktuelle Protokoll beschreibt Methoden zur Etablierung von vom Patienten abgeleiteten Xenograft-Modellen (PDX) und primären Krebszelllinien aus chirurgischen Magenkrebsproben. Die Methoden sind ein nützliches Instrument für die Arzneimittelentwicklung und die Krebsbiologieforschung.

Abstract

Die Verwendung präklinischer Modelle, um unser Verständnis der Tumorbiologie zu verbessern und die Wirksamkeit von therapeutischen Wirkstoffen zu untersuchen, ist der Schlüssel zur Krebsforschung. Obwohl es viele etablierte Magenkrebszelllinien und viele konventionelle transgene Mausmodelle für die präklinische Forschung gibt, schränken die Nachteile dieser In-vitro- und In-vivo-Modelle ihre Anwendungen ein. Da sich die Merkmale dieser Modelle in der Kultur verändert haben, modellieren sie keine Tumorheterogenität mehr, und ihre Reaktionen waren nicht in der Lage, Reaktionen beim Menschen vorherzusagen. So werden alternative Modelle entwickelt, die die Tumorheterogenität besser repräsentieren. Patientenabgeleitete Xenograft-Modelle (PDX) bewahren das histologische Erscheinungsbild von Krebszellen, behalten die intratumorale Heterogenität bei und spiegeln besser die relevanten menschlichen Komponenten der Tumormikroumgebung wider. Allerdings dauert es in der Regel 4-8 Monate, um ein PDX-Modell zu entwickeln, das länger ist als das erwartete Überleben vieler Magenpatienten. Aus diesem Grund kann die Etablierung primärer Krebszelllinien eine wirksame ergänzende Methode für Studien zur Wirkstoffreaktion sein. Das aktuelle Protokoll beschreibt Methoden zur Erstellung von PDX-Modellen und primären Krebszelllinien aus chirurgischen Magenkrebsproben. Diese Methoden sind ein nützliches Instrument für die Arzneimittelentwicklung und die Krebsbiologieforschung.

Introduction

Magenkrebs ist die fünfthäufigste Krebsart weltweit und die dritthäufigste Krebstodesursache. Im Jahr 2018 wurden weltweit über 1.000.000 neue Fälle von Magenkrebs diagnostiziert, und schätzungsweise 783.000 Menschen wurden durch diese Krankheit getötet1. Die Inzidenz und Sterblichkeit von Magenkrebs ist in den nordöstlichen asiatischen Ländern nach wie vor sehr hoch2,3. Trotz signifikanter Fortschritte auf dem Gebiet der Krebstherapeutika bleibt die Prognose von Patienten mit fortgeschrittenem Magenkrebs schlecht, mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von ca. 25%4,5,6, 7,. Daher besteht ein dringender Bedarf für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für Magenkrebs

Die Behandlung von Magenkrebs ist aufgrund seiner hohen Heterogenität eine Herausforderung8,9. So ist die Frage, wie man die Herausforderungen der Tumorheterogenität angehen kann, um Präzisionsmedizin zu realisieren, von zentraler Bedeutung für die Krebsforschung. In-vitro- und In-vivo-Modelle spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufklärung der heterogenen Mechanismen und der Biologie von Magenkrebs. Obwohl es zahlreiche Magenkrebszelllinien und viele konventionelle transgene Mausmodelle für die präklinische Forschung gibt, schränken die Nachteile dieser Modelle ihre Anwendungenein 10. Da sich die Merkmale dieser Modelle in der Kultur verändert haben, modellieren sie keine Tumorheterogenität mehr, und ihre Reaktionen waren nicht in der Lage, Reaktionen beim Menschen vorherzusagen11. Diese Probleme schränken die Möglichkeit der Identifizierung von Untergruppen von Krebspatienten, die auf gezielte Medikamente ansprechen, stark ein. Die kurzfristige Kultur der Primärtumoren bietet eine relativ schnelle und personalisierte Möglichkeit, anticancer pharmakologische Eigenschaften zu untersuchen, die wahrscheinlich das Markenzeichen der personalisierten Krebsbehandlung sein wird.

Patienten-abgeleitete Xenografts (PDXs) werden als alternatives präklinisches Modell für die Wirkstoff-Profilierung12bevorzugt. Darüber hinaus bieten PDX-Modelle ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Initiierung und des Fortschreitens von Krebs13,14. PDX-Modelle bewahren das histologische Erscheinungsbild von Krebszellen, behalten intratumorale Heterogenität und spiegeln besser die relevanten menschlichen Komponenten der Tumormikroumgebung15,16wider. Die Einschränkung der weit verbreiteten PDX-Modelle ist jedoch die geringe Erfolgsrate bei der Etablierung und seriellen Verbreitung von soliden Tumoren beim Menschen. In dieser Studie werden anständig erfolgreiche Methoden zur Erstellung von PDX-Modellen und primären Zelllinien beschrieben.

Protocol

Diese Studie am Menschen wurde vom Institutional Ethics Review Board des Sun Yat-sen University Cancer Center (SYSUCC, Guangzhou, China) genehmigt. Die Tierstudie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Sun Yat-sen University genehmigt. Hinweis: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Gesetzen und institutionellen Richtlinien durchgeführt, einschließlich der Leitlinie für den Schutz der beruflichen Exposition gegen blutübertragene Krankheitserreger. <p class="jove_tit…

Representative Results

Hier wurden Tumorgewebe aus einer Operation bis zum nächsten Schritt in Stammlösung konserviert. Innerhalb von 4 Stunden wurden Tumorgewebe in kleine Stücke geschnitten und in die dorsalen Flanken von NSG-Mäusen implantiert, die mit isoflurangetränkter Baumwolle betäustt worden waren. Tumoren größer als 1 cm3 könnten zur Implantation in neue Mäuse resektiert werden (Abbildung 1) oder sorgfältig geschnitten und gemäß dem Protokoll in flüssigem Stickstoff konserviert w…

Discussion

Magenkrebs ist eine aggressive Erkrankung mit begrenzten therapeutischen Möglichkeiten; So sind Modelle von Magenkrebs zu einer kritischen Ressource geworden, um funktionelle Forschungsstudien mit direkter Übersetzung in die Klinik4,8,17zu ermöglichen. Hier haben wir die Methoden und das Protokoll zur Etablierung von Magenkrebs-PDX-Modellen und primären Zelllinien beschrieben. Wichtig ist, dass sowohl morphologische als auch…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81572392) unterstützt; das Nationale Schlüsselforschungs- und Entwicklungsprogramm Chinas (2016YFC1201704); Tip-top Wissenschaftliche und Technische innovative Jugendtalente des Guangdong Special Support Program (2016TQ03R614).

Wir danken Guangzhou Sagene Biotech Co., Ltd. ausdrücklich für die Unterstützung bei der Erstellung der Zahlen.

Materials

40 μm Cell Strainer Biologix, Shandong, China 15-1040
Biological Microscope OLYMPUS, Tokyo, Japan OLYMPUS CKX41
Centrifuge Eppendorf, Mittelsachsen, Germany. 5427R
CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA HERACELL 150i
DPBS Basalmedia Technology, Shanghai, China L40601
Electro-Thermostatic Water Cabinet Yiheng, Shanghai, China DK-8AXX
Fetal bovine serum Wisent Biotechnology, Vancouver, Canada 86150040
Isoflurane Baxter, China CN2L9100
Live Tissue Kit Cryo Kit Celliver Biotechnology, Shanghai, China LT2601
Live Tissue Thaw Kit Celliver Biotechnology, Shanghai, China LT2602
NSG Biocytogen, Beijing, China B-CM-002-4-5W
Penicilin&streptomycin Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA 15140122
Red blood cell lysis buffer Solarbio, Beijing, China R1010
RPMI-1640 medium Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA 8118367
Surgical Suture Needles with Thread LingQiao, Ningbo, China 3/8 arc 4×10
Tissue-processed molds and auxiliary blades Celliver Biotechnology, Shanghai, China LT2603
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA 2003779
Type 1 collagenase Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA 17100017

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Cite This Article
Lu, J., Wang, Y., Meng, Q., Zeng, Z. Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines. J. Vis. Exp. (149), e59871, doi:10.3791/59871 (2019).

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