Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تنقية عالية الغلة الاستعدادات الحويصلة خارج الخلية بعيدا عن الفيروس

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/59876
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2, 3, 4, 5, 1
1Laboratory of Molecular Virology, School of Systems Biology, George Mason University, 2American Type Culture Collection (ATCC), 3ATCC Cell Systems, 4Ceres Nanosciences, Inc, 5Department of Immunology and Nano-medicine, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University
* These authors contributed equally

Summary

يعزل هذا البروتوكول الحويصلات خارج الخلية (EVs) بعيدا ً عن virions ذات الكفاءة العالية والغلة من خلال دمج هطول الأمطار EV، وكثافة تدرج ultracentrifugation، والتقاط الجسيمات للسماح لسير عمل مبسط والحد من بدء متطلبات الحجم، مما أدى إلى الاستعدادات القابلة للاستنساخ لاستخدامها في جميع البحوث EV.

Abstract

واحدة من العقبات الرئيسية في مجال أبحاث الحويصلة خارج الخلية (EV) اليوم هو القدرة على تحقيق الاستعدادات EV تنقية في إعداد العدوى الفيروسية. والمقصود من الطريقة المعروضة عزل المركبات الكهربائية بعيدا عن virions (أي فيروس نقص المناعة البشرية-1)، مما يسمح بكفاءة أعلى وغلة أعلى بالمقارنة مع الأساليب التقليدية فائقة التثخاف. بروتوكولنا يحتوي على ثلاث خطوات: هطول الأمطار EV، فصل تدرج الكثافة، والتقاط الجسيمات. يمكن تشغيل الاختبارات النهائية (أي اللطخة الغربية، وPCR) مباشرة بعد التقاط الجسيمات. هذه الطريقة مفيدة على طرق العزل الأخرى (أي ultracentrifugation) كما أنه يسمح لاستخدام الحد الأدنى من وحدات التخزين الأولية. وعلاوة على ذلك، فهو أكثر سهولة للمستخدم من أساليب عزل EV البديلة التي تتطلب خطوات متعددة فائقة التثاقل. ومع ذلك، فإن الطريقة المعروضة محدودة في نطاق اختبارات EV الوظيفية حيث أنه من الصعب أن elute EVs سليمة من جزيئاتنا. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة مصممة خصيصاً لتهيئة بيئة قائمة على البحوث بحتة ولن تكون مجدية تجارياً.

Introduction

تركز البحث حول الحويصلات خارج الخلية (EVs)، وعلى وجه التحديد exosomes، وهو نوع من EV تتراوح بين 30-120 نانومتر وتتميز بوجود ثلاثة علامات تيتراسبانين CD81، CD9، وCD63، وقد شكلت إلى حد كبير من خلال تطوير أساليب لعزل و تنقية الحويصلات من الفائدة. وقد أعيقت القدرة على تشريح الآليات المتعددة الأوجه بسبب التقنيات المعقدة والمستهلكة للوقت التي تولد عينات تتألف من مجموعة غير متجانسة من الحويصلات المتولدة عبر مسارات مختلفة مع مجموعة واسعة من المحتويات والأحجام، و الكثافه. في حين أن هذه مسألة لجميع البحوث EV تقريبا، فإنه من أهمية خاصة عند دراسة المركبات الكهربائية في سياق العدوى الفيروسية، كما virions والجسيمات الشبيهة بالفيروس (VLPs) يمكن أن تكون مماثلة في القطر إلى الحويصلات ذات الأهمية. فعلى سبيل المثال، يبلغ قطر فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (HIV-1) حوالي 100 نانومتر، وهو تقريبا نفس حجم العديد من أنواع المركبات الكهربائية. لهذا السبب، قمنا بتصميم سير عمل عزل EV جديد لمعالجة هذه المشكلات.

المعيار الذهبي الحالي لعزل EV هو فائق التحامل. هذه التقنية تستفيد من مختلف الكثافات الحويصلة، مما يسمح للحويصلات أن تكون مفصولة بالطرد المركزي مع الترسيب التفاضلي للجسيمات ذات الكثافة العالية مقابل جزيئات الكثافة المنخفضة في كل مرحلة 1،2. وهناك عدة خطوات الطرد المركزي منخفضة السرعة مطلوبة لإزالة الخلايا السليمة (300-400 × ز لمدة 10 دقائق)، وحطام الخلايا (~ 2000 × ز لمدة 10 دقائق)، والهيئات المبرمجة / الحويصلات الكبيرة (~ 10،000 × ز لمدة 10 دقائق). ويلي عمليات التنقية الأولية هذه عمليات الإزالة الفائقة السرعة العالية (000 100-000 200 x ز لمدة 1.5-2 ساعة) إلى المركبات الكهربائية للرواسب. يتم تنفيذ خطوات غسل لمزيد من ضمان نقاء EV، ومع ذلك، وهذا يؤدي إلى خفض عدد المركبات الكهربائية المعزولة، وبالتالي خفض العائد الإجمالي 3،4. كما أن فائدة هذه الطريقة محدودة بسبب متطلبات عدد كبير من الخلايا (حوالي 1 × 108) وحجم عينة كبير (> 100 مل) لتحقيق نتائج كافية.

ولمعالجة الشواغل المتزايدة، أصبح هطول الأمطار من الحويصلات مع البوليمرات المائية تقنية مفيدة في السنوات الأخيرة. البولي ايثيلين غليكول (PEG)، أو غيرها من الكواشف هطول الأمطار ذات الصلة، يسمح للمستخدم لسحب أسفل الحويصلات، والفيروسات، والبروتين أو البروتين الحمض النووي الريبي المجاميع داخل عينة ببساطة عن طريق احتضان العينة مع الكواشف من الاختيار، تليها واحدة منخفضة السرعة الطرد المركزي1،2،5. لقد أبلغنا سابقا أن استخدام PEG أو الأساليب ذات الصلة لتسريع المركبات الكهربائية بالمقارنة مع نتائج ultracentrifugation التقليدية في عائد أعلى بكثير6. هذه الاستراتيجية سريعة وسهلة، لا تتطلب معدات إضافية باهظة الثمن، ويمكن تطويرها بسهولة، ويحتفظ هيكل EV. ومع ذلك، ونظرا لطبيعة منحرفة من هذه الطريقة، والعينات الناتجة تحتوي على مجموعة متنوعة من المنتجات بما في ذلك البروتينات الحرة، ومجمعات البروتين، ومجموعة من المركبات الكهربائية، وبالتالي تتطلب المزيد من تنقية للحصول على السكانالمطلوب1 ،2،7،8.

وللتغلب على عدم تجانس المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها من مختلف أساليب هطول الأمطار، يُستخدم تدرج الكثافة الفائق (DG) لفصل الجسيمات على نحو أفضل استناداً إلى كثافتها. يتم تنفيذ هذه الطريقة باستخدام تدرج تدريجي باستخدام وسيط تدرج الكثافة، مثل iodixanol أو السكروز، والذي يسمح لفصل المركبات الكهربائية من البروتينات، ومجمعات البروتين، وجزيئات تشبه الفيروس أو الفيروس (VLPs). ومن المهم ملاحظة أنه في حين كان يعتقد في وقت من الأوقات أن المديرية العامة سمحت بفصل أكثر دقة بين التجمعات السكانية الفرعية للEV، فمن المعروف الآن أن الأحجام والكثافات من الحويصلات المختلفة يمكن أن تتداخل. على سبيل المثال، من المعروف أن exosomes لديها كثافات التعويم من 1.08-1.22 غرام / مل9،في حين أن الحويصلات المعزولة من غولجي (COPI+ أو clathrin+) لديها كثافات من 1.05-1.12 غرام / مل وتلك من الشبكية endoplasmic (COPII+ ) الرواسب في 1.18-1.25 غرام / مل1،2،3،4،9. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان المرء يرغب في مقارنة الكسور الخارجية مع الكسور التي تحتوي على الجسيمات الفيروسية، وهذا قد يصبح أكثر صعوبة اعتمادا على كثافة الفيروس من الفائدة - هناك فيروسات أخرى غير فيروس نقص المناعة البشرية-1 التي من المرجح أن توازن في نفس الكثافات والكسور الإيجابية الخارجية2.

وأخيرا، فإن إثراء الإعدادية EV للتصور المصب والاختبارات الوظيفية أمر حيوي لبحوث EV. استخدام الجسيمات النانوية التي تثري EV، وعلى وجه التحديد، جزيئات هيدروجيل متعددة الوظائف التي تتراوح بين 700-800 نانومتر في القطر، هي خطوة حاسمة في تحقيق الإعدادية EV المركزة. أنها تمتلك طعم العطرية تقارب عالية التي مغلفة بقذيفة غرب مسامية غرب المنال لتعزيز الانتقائية. وتشمل الجسيمات النانوية المستخدمة في هذه الدراسة إعدادين متميزين مع طعوم أساسية مختلفة (رد الفعل الأحمر 120 NT80؛ وCibacron Blue F3GA NT82) التي أظهرت زيادة التقاط المركبات الكهربائية من مختلف الكواشف والسوائل الحيوية (انظر جدول المواد )6،10،11،12،13،14،15. الجسيمات توفر سهولة إثراء المركبات الكهربائية من العديد من المواد بدءا بما في ذلك كسور iodixanol، supernatant ثقافة الخلية، فضلا عن السوائل الحيوية المريض مثل البلازما، المصل، السوائل الشوكية الدماغية (CSF)، والبول6،13 .

الطريقة المعروضة هنا يحسن كفاءة تقنيات تنقية EV الحالية من خلال الجمع بين العديد من التكنولوجيات; EV هطول الأمطار، كثافة التدرج ultracentrifugation، والتقاط الجسيمات، لتبسيط سير العمل، والحد من متطلبات العينة، وزيادة العائد للحصول على عينة EV أكثر تجانسا للاستخدام في جميع البحوث EV. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص في التحقيق في المركبات الكهربائية ومحتوياتها خلال العدوى الفيروسية كما أنه يتضمن خطوة ترشيح 0.22 ميكرومتر لاستبعاد الحويصلات الكبيرة وغير المرغوب فيها وVLPs والفصل بين مجموع السكان EV على أساس الكثافة إلى فعالية عزل المركبات الكهربائية من virions.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الترشيح وهطول الأمطار من الحويصلات خارج الخلية (EVs)

  1. لإعداد الثقافة الفائقة من الخلايا المصابة أو المنقولة (أي خطوط الخلايا و/أو الخلايا الأولية)، والثقافة حوالي 10 مل من الخلايا المتأخرة لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ثاني أكسيد الكربون في وسط الثقافة المناسبة (أي RPMI أو DMEM مع 10٪ من البقر الجنيني المصل [FBS]).
    ملاحظة: يجب أن تكون جميع الكواشف المتوسطة الثقافة خالية من المركبات الكهربائية، ويمكن شراؤها إما (انظر جدول المواد)أو أعدت في المنزل عن طريق ما قبل ultracentrifugation المصل في 100،000 × ز لمدة 90 دقيقة. وقد نجح هذا البروتوكول لعدة خطوط الخلايا الشائعة الاستخدام بما في ذلك: CEM، Jurkat، 293T، U937 (خطوط غير مصابة)، U1، J1.1، ACH2، HUT102، MT-2 (HIV-1 وHTLV-1 خطوط المصابة)، والخلايا المتحولة متعددة، والخلايا الرئيسية والخلايا T (كلاهما المصابة وغير المصابة)؛ ومع ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لأي نوع خلية، بما في ذلك تلك التي تتطلب وسائط متخصصة أو ظروف الثقافة. قد تحتاج كثافة الخلايا إلى تحسين أنواع الخلايا المختلفة. من المستحسن أن يتم استخدام أعلى كثافة مع الحد الأدنى من موت الخلايا بعد 5 أيام.
  2. طرد مركزي الثقافة في 3000 × ز لمدة 5 دقائق إلى خلايا بيليه وتجاهل بيليه.
  3. تصفية supernatant الثقافة باستخدام مرشح معقمة 0.22 م وجمع filtrate في أنبوب نظيفة.
  4. إضافة حجم متساو من الكاشف الترسيب PEG (نسبة 1:1) إلى supernatant تصفيتها. عكس أنبوب عدة مرات لضمان خليط متجانس.
    ملاحظة: لا دوامة.
  5. يحضن خليط في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها (O / N).
  6. خليط الطرد المركزي في 1500 × ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) لإنتاج بيليه EV غير متجانسة.
    ملاحظة: EV بيليه يجب أن تظهر بيضاء أو بيضاء في اللون.
  7. تجاهل ثقافة EV المنضبة.
  8. إعادة تعليق بيليه EV في 150-300 درجة مئوية من 1X الفوسفات المخزنة المالحة دون الكالسيوم والمغنيسيوم (PBS) والحفاظ على الجليد.

2. بناء تدرج الكثافة

  1. مزيج iodixanol كثافة التدرج المتوسطة مع 1X PBS لخلق 11 مختلفة 1 مل كسور الكثافة من 6 إلى 18٪ iodixanol في 1.2٪ زيادات في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة منفصلة كما هو مبين في الشكل 1A.
  2. دوامة كل أنبوب لخلط.
  3. كسور كثافة الطبقة في أنبوب فائق الطاردة للتأرجح تم تنظيفه مسبقًا وجافًا بدءًا من #18 الكسر وانتهاءً #6 الكسر كما هو موضح في الشكل 1B.
    ملاحظة: وينبغي تطهير جميع الأنابيب باستخدام رذاذ التبييض 10٪ تليها البخاخة 3X مع الماء منزوع الأيونات وغسل نهائي من المياه المعقمة منزوعة الأيونات قبل تحميل الكسور التدرج.
  4. أضف بيليه EV المعلق (300 درجة مئوية) إلى الجزء العلوي من التدرج الطبقات في أنبوب الطاردالفائق.
  5. فائق الطرد المركزي في 100،00 × غرام في 4 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
  6. قم بإزالة الكسور التي تعمل بمليون لتر بعناية من أنبوب الطاردة للطرد المركزي فائقة ونقل كل كسر إلى أنابيب مركزية جديدة.

3. إثراء كسور EV uusing الجسيمات النانوية

  1. إنشاء الطين 30٪ من الجسيمات النانوية باستخدام كميات متساوية من NT80، NT82، و 1X PBS.
    ملاحظة: وينبغي أن يكون الخليط دوامة قبل استخدامها لضمان التجانس.
  2. إضافة 30 درجة مئوية من الطين إلى كل أنبوب الطرد المركزي الصغير التي تحتوي على كسور الكثافة والماصة / عكس لهم عدة مرات لخلط.
  3. تدوير EV-إثراء الجسيمات النانوية التي تحتوي على كثافة كسر أنابيب الطرد المركزي الصغيرة O / N في 4 درجة مئوية في حوالي 20 دورة في الدقيقة.
  4. أنابيب الطرد المركزي الكثافة الكسر microcentrifuge في 20،000 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
  5. تجاهل السائل وغسل EV بيليه مرتين مع 1X PBS.
    ملاحظة: يمكن تجميد كريات الجسيمات النانوية عند -20 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لمختلف الاختبارات النهائية (أي PCR، ووصمة عار غربية، وقياس الطيف الكتلي، وغيرها من الاختبارات).

4. التحضير الموصى بها من الجسيمات النانوية بيليه لتجارب المصب

  1. لعزل الحمض النووي الريبي
    1. إعادة تعليق بيليه في 50 درجة مئوية من المياه المزيلة الأيونات الأوتوكلاف المعالجة مع 0.001٪ ثنائي إيثيل البيروكربونات (DEPC) تصفيتها من خلال مرشح 0.2 م وعزل الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للطقم.
  2. لجل الكهربائي
    1. إعادة تعليق بيليه مباشرة في 15 درجة مئوية من العازلة Laemmli.
    2. عينة الحرارة 3X في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق دوامة بلطف وتدور بين كل دورة الحرارة.
    3. عينة الطرد المركزي ل15 s في 20،000 × ز وتحميل جميع المواد eluted مباشرة على هلام.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، حدد كمية الجسيمات المحملة على الجل وتشغيل الجل في 100 فولت لضمان احتواء أي جزيئات متبقية إلى الآبار.
  3. لهضم التربسين
    1. إعادة تعليق بيليه في 20 درجة مئوية من اليوريا قبل الألكلة وtrypsinization العينة. يمكن أن تُوَرِّب الجسيمات النانوية بواسطة 14,000 x g centrifugation في RT لمدة 10 دقائق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ارتفاع الأمطار في الأمطار إلى ارتفاع ويزيد من العائد على المركبات الكهربائية
نهجنا الجمع بين عزل EV هو أكثر كفاءة بكثير من حيث الانتعاش EV بالمقارنة مع ultracentrifugation التقليدية، كما يتضح من انخفاض 90٪ في حجم المواد الأولية المطلوبة. Ultracentrifugation، المعيار الذهبي الحالي في عزل EV، يتطلب ما يقرب من 100 مل من الثقافة الفائقة لإنتاج الإعدادية EV كافية لتجارب المصب، في حين أن بروتوكولنا الجديد يتطلب فقط 10 مل. وقد أمكن تحقيق هذا الانخفاض من خلال استخدام كاشف هطول الأمطار EV PEG الذي يوفر زيادة كبيرة في غلة EV كما تقاس بتحليل التتبع النانوي (NTA). النتائج في الشكل 2A، والتي تم نشرها سابقا6، تشير إلى أنه عند استخدام 10 مل من الثقافة supernatant PEG هطول الأمطار أدى إلى استرداد 7.27 × 1010 المركبات الكهربائية ، والتي كانت حوالي 500 أضعاف أكثر من عدد من المركبات الكهربائية المستردة من نفس المواد البداية باستخدام ultracentrifugation (1.45 × 108). كما لوحظت زيادة كفاءة عزل الاكسوسوم، وهو نوع فرعي محدد من طراز EV، على أنها واضحة من خلال زيادة مستويات بروتينات العلامات الخارجية ذات الخصائص الجيّدة، وCD81، وCD63، وCD9. يظهر في الشكل 2Bتحليل اللطخة الغربية التي تقارن الإعدادية EV المنتجة إما من ultracentrifugation أو EV هطول الأمطار باستخدام كاشف هطول الأمطار PEG . وتظهر هذه النتائج زيادة قدرها 000 3 ضعف في CD81، وزيادة قدرها 4 أضعاف في CD63، وزيادة قدرها 40 ضعفاً في CD9 مقيسة بتحليل قياس الكثافة. وتشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن البروتوكول المحدد لا يزيد من إجمالي عائد المركبات الكهربائية فحسب، بل يعزز أيضاً استعادة الاكسوسوم عند مقارنتها بـ ultracentrifugation.

توصيف المركبات الكهربائية وفصل المركبات الكهربائية بعيدا عن فيروس نقص المناعة البشرية-1
من أجل توصيف الحويصلات الموجودة في كل جزء بعد إثراء الجسيمات النانوية، تم عزل المركبات الكهربائية من CEM غير المصابة أو فيروس نقص المناعة البشرية-1 المصابة ثقافة الخلايا U1 supernatant باستخدام البروتوكول المبينة وتتميز باستخدام وصمة عار الغربية من كل الجسيمات النانوية المخصب iodixanol كسر. تُظهر البيانات الواردة في الشكل 3A نتائجنا المنشورة سابقاً والتي تبين وجود أو عدم وجود ثلاثة رباعيات أسوسومية (CD81 وCD63 وCD9) في كل كسر (خلايا CEM؛ اللوحة العليا). وتشير النتائج إلى أن الاكسوسوسوم، كما هو محدد بوجود جميع رباعيات السبانين الثلاثة داخل الكسر، توجد في ثلاثة مجموعات سكانية متميزة: exo #1 الذي يتضمن الكسور 10.8-12.0، exo #2 الذي يتضمن الكسور 15.6-16.8، وExo#3 الذي يتضمن فقط كسر 18.0. وعلى الرغم من وجود ثلاثة مجموعات سكانية متميزة، لا يمكن للبروتوكول أن يستبعد إمكانية وجود أنواع إضافية من المركبات الكهربائية داخل كل جزء. وعلاوة على ذلك، فإن هذه النتائج لا تستبعد بشكل قاطع إمكانية وجود حويصلات في هذه المجموعات السكانية إيجابية بالنسبة لمجموعة من علامات تيتراسانين التي تم اختبارها. ويمكن بعد ذلك فصل هذه المركبات الكهربائية بمزيد من الاستراتيجيات الإضافية للتنقية.

وقد انفجر مجال التطور السريع لبحوث EV/exosome منذ اكتشافها وأدى إلى العديد من الوظائف والتطبيقات المكتشفة الجديدة لهذه الحويصلات. وعلى وجه الخصوص، أدى دورهم كرسل داخل الخلايا ليس فقط في علم وظائف الأعضاء العادية ولكن أيضا في المرض إلى استخدام موارد كبيرة لتشريح آثار وفائدة الحويصلات خارج الخلية، وعلى وجه التحديد exosomes، على الخلايا المتلقية16 , 17 سنة , 18.وقد تورطت العديد من الدراسات EVs في مسببات الأمراض من مجموعة متنوعة من العدوى، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية-16،10،12،19،20،21 , 22- ومع ذلك، فإن تشابه الحجم بين المركبات الكهربائية والمركبات الكهربائية يشكل عقبة محتملة في تحديد هذه الآليات التي تتوسط فيها المركبات الكهربائية. ولمعالجة هذا الشاغل، قمنا بتصميم بروتوكولنا لتنفيذ تدرج الكثافة لفصل مجموعات المركبات الكهربائية بشكل فعال عن الأيونات. ولهذا الغرض، خضعت ثقافة الخلايا الفائقة من الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 للبروتوكول المعروض وتحليلها بواسطة وصمة عار غربية لوجود فيروس نقص المناعة البشرية-1 Gag p24 لتحديد الكسور أو الكسور التي تحتوي على فيروس نقص المناعة البشرية-1 virions. النتائج المبينة في الشكل 3A (لوحة الأوسط) يظهر توطين p24 في ثلاثة شروط مستقلة: في غياب محفز, في وجود محفز (Phorbol 12-myristate 13-خلات; PMA)، وفي وجود PMA والجمع بين العلاج المضاد للفيروسات العكوسة (cART)، والعلاج القياسي لفيروس نقص المناعة البشرية-1. وتشير هذه البيانات إلى أن فيروس فيروس نقص المناعة البشرية-1 مترجم إلى كسر 16.8 كما يقاس بوجود p24 وPr55 غير المذيب. وعلاوة على ذلك، عندما تتعرض الخلايا لcART، والتي تشمل Indinavir، مثبط البروتياز الذي يمنع انشقاق Pr55 إلى p24، لم يتم الكشف عن p24 في أي جزء. بدلاً من ذلك، تم الكشف عن Pr55 فقط وكان موجوداً في الكسور 16.8-18.0، مما يشير إلى تحول الفيروس إلى كسور أكثر كثافة. تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام الضامة الأولية (اللوحة السفلى). وعلى الرغم من أن البروتوكول الموصوف يؤدي إلى الترسب المشترك لدى #2 إكسو وإكسو #3 السكان المصابين بالفيروس، فإن مجموعة #1 إكسو (الكسور 10.8 إلى 12.0) ظلت خالية من الفيروس، مما سمح بإجراء عمليات فحص في المراحل النهائية خالية من التلوث بالفيروس.

هذا النوع من فصل الفيروس بعيدا عن المركبات الكهربائية يسمح لنا لمعالجة إمكانية قطع من الفيروس دخول المركبات الكهربائية أو يجري إفرازها من الخلايا المصابة كبروتين مجاني. وتشير النتائج في الشكل 3باء إلى أن بروتين فيروس نقص المناعة البشرية-1 Nef يمكن العثور عليه في #1 السكان إكسو بالإضافة إلى #2 إكسو وإكسو #3 السكان. Nef يظهر أيضا في كسر 6.0، مما يشير إلى أن Nef يمكن أن تفرز من الخلايا المصابة كبروتين مجاني وداخل EV. بالإضافة إلى ذلك، يتم العثور على بروتين فيروس نقص المناعة البشرية-1 Vpr في 6.0 جزء في حين يتم العثور على بروتين التات HIV-1 في الغالب في 6.0 جزء، ولكن يظهر أيضا في الكسور 7.2-9.6. نحن حاليا اختبار جميع الكسور لوجود بروتين تات من قبل ELISA. وتشير هذه النتائج إلى أن كلا من Tat وVpr يمكن أن تفرز من الخلايا المصابة، على الأرجح كبروتينات حرة، في حين يمكن أيضا إدراج تات في المركبات الكهربائية. وتشير هذه البيانات مجتمعة إلى أن أسلوبنا في عزل المركبات الكهربائية يمكن أن يؤدي بنجاح إلى عزل الاكسوسوم (Exo #1) بعيداً عن فيروس نقص المناعة البشرية-1 (exo #2 و#3) وأن المركبات الكهربائية من الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 تحتوي على بعض البروتينات المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1، والتي قد تؤثر على مسببات الأمراض من فيروس نقص المناعة البشرية-1.

توصيف المركبات الكهربائية وفصل المركبات الكهربائية بعيدا عن الفيروسات الأخرى
لتطبيق هذا البروتوكول على نماذج العدوى الفيروسية الأخرى، لقد تميز الحويصلات من الخلايا المصابة بعدة فيروسات مختلفة. ويبين الشكل 3 جيم رسماً توضيحياً لتوزيعات الحويصلات والفيروسات التي تم الحصول عليها سابقاً بعد هطول الأمطار والفصل والإثراء وفقاً للبروتوكول الموصوف. كما هو مبين سابقا في الشكل 3A، exosomes (CD9+CD63+CD81+) موجودة في ثلاثة مجموعات سكانية مختلفة (Exo #1، الكسور 10.8-12.0; exo #2، والكسور 15.6-16.8، وExo#3، 18.0 fraction) وفيروس HIV-1 يُترجم إلى الكثافة الأعلى 16.8 و18.0 الكسور (الممرات 10-11). ليس من المستغرب، عند تطبيق هذا البروتوكول لتوصيف المركبات الكهربائية الصادرة من فيروس الإنسان T-اللمفاوية نوع 1 (HTLV-1)، وهو فيروس الرجعية التي من المعروف أن يسبب السرطان في البالغين، لاحظنا نتائج مماثلة لتلك التي من فيروس نقص المناعة البشرية-1 ذات الصلة المركبات الكهربائية. ويبين الفريق الثالث في الشكل 3C أن فيروس HTLV-1 كان مترجماً في المقام الأول إلى أعلى نسبة كثافة (18.0)، وبدرجة أقل، الكسور 13-2-16.8 كما يتضح من وجود بروتين مصفوفة HTLV-1 (p19). وعلاوة على ذلك، وجدنا سابقا أن البروتين HTLV-1 تبديل، الضرائب، والتي هي غائبة عن virion HTLV-1، موجودة داخل exosomes صدر من HTLV-1 الخلايا المصابة15،23. وتظهر البيانات الواردة في الشكل 3C أن الضريبة كانت موجودة في الكسور ذات الكثافة المنخفضة (6.0-12.0)، وقد تبين أن اثنين منها يحتويان على اكسوسوم (10.8 و12.0).

وبعد ذلك، اختبرنا بروتوكول العزل في سياق فيروسات أكبر وأصغر حجماً مثل فيروس الإيبولا وفيروس زيكا (ZIKV)، على التوالي، حيث أن فيروس نقص المناعة البشرية-1 وHTLV-1 هما فيروسات رجعية ومتشابهة جداً في القطر. باستخدام VLP كنموذج بديل للسلامة البيولوجية 2 (BSL-2) من EBOV التجميع والخروج، وجدنا أن VLP، الذي يبلغ طوله حوالي 1 ميكرومتر، يقوم بتوطين أعلى كسر كثافة (18.0) في غياب 0.22 ميكرومتر الترشيح (اللوحة الوسطى، الشكل 3C). وعلاوة على ذلك، عندما يتم التعبير عن VP40، بروتين مصفوفة EBOV، على مستويات عالية، يتم إفرازه من الخلية من خلال عدة آليات مختلفة مما أدى إلى وجود VP40 في كل كسر الكثافة، بما في ذلك تلك التي يتم توطين exosomes13 , 14. وعلى النقيض من ذلك، فإن virions ZIKV هي أصغر بكثير من فيروس نقص المناعة البشرية-1 virions، وقياس ما يقرب من 40 نانومتر في القطر. ويبين الرسم التخطيطي التمثيلي في اللوحة السفلية من الشكل 3C وجود فيريتون زيكف في كل من الكثافة المنخفضة (6.0-8.4) والكسور العالية الكثافة (15.6-18.0)، مما يشير إلى وجود كل من الفيروس المجاني والفيروس المغلف بالمركبات الكهربائية، على التوالي.

Figure 1
الشكل 1: بناء تدرج كثافة iodixanol. (A)كميات نسبية من iodixanol وPBS تستخدم لإنشاء كل كسر الكثافة (كسر #). يشير الكسر # إلى النسبة المئوية للأيوديكانول المضمنة في كل كسر. يتم تصوير كثافاتها النسبية ووضعها في التدرج من أثقل إلى أخف. (ب)يظهر وضع كسور الكثافة (6.0-18) في أنبوب فائق الطرد المركزي (الجانب الأيسر) وكذلك موقع مجموعات EV الثلاثة (Exo #1، exo #2، exo #3)، الحويصلات الشبيهة بإكسو، ومجمعات البروتين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الكاشف هطول الأمطار PEG يزيد من غلة EV. (أ)لمقارنة الانتعاش EV، تم عزل المركبات الكهربائية من 5 د فيروس نقص المناعة البشرية-1 المصابة أحادية الخلية (U1) ثقافة supernatant (10 مل) باستخدام ultracentrifugation التقليدية (100،000 × ز)أو PEG الترسيب الكاشف (الحضانة بنسبة 1:1). تم تحليل المركبات الكهربائية من كلا الإجراءين للتخصيب باستخدام تحليل التتبع النانوي لتقييم تركيز المركبات الكهربائية الناتج ة على النحو المبين في DeMarino وآخرون6. تم قياس NTA في 11 وظيفة مستقلة في ثلاثة أضعاف التقنية. القضبان الزرقاء تمثل متوسط القياسات 33 ± S.D. تم تحديد الأهمية الإحصائية باستخدام اختبار tالطالب ذي الذيل اثنين; p < 0.001. B. EVs من 5 أيام CEM الثقافة supernatant باستخدام إما ultracentrifugation (UC) أو PEG هطول الأمطار تليها فصل كثافة iodixanol. تم تنفيذ Ultracentrifugation باستخدام 100 مل من الثقافة الفائقة (لين 1) في حين تم تنفيذ هطول الأمطار PEG وتجزئة iodixanol اللاحقة باستخدام 10 مل من الثقافة supernatant (حارة 2). تم تحليل مجموع بيليه EV التي تم الحصول عليها من ultracentrifugation و10.8 جزء من فصل PEG/iodixanol بواسطة وصمة عار الغربية لوجود بروتينات علامة exosomal (CD81، CD63، وCD9) مع أكتين كعنصر تحكم. وللتوضيح، تظهر الممرات المحددة من نفس اللطخة مع التعرضات المتطابقة في اللوحة B. وقد عُدل هذا الرقم من DeMarinoوآخرون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: عزل المركبات الكهربائية بعيداً عن الفيروسات. (أ)المناضد الثقافية لمدة خمسة أيام من خلايا CEM غير المصابة (اللوحة العليا)، فيروس نقص المناعة البشرية-1 (Ba-L؛ وزارة الداخلية: 0.01) الخلايا المصابة U1 (± PMA و ± العلاج cART؛ لوحة الأوسط) أو فيروس نقص المناعة البشرية-1 المصابة الضامة الأولية (لوحة أسفل) تم احتضانها مع الكاشف هطول الأمطار PEG في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تم فصل المركبات الكهربائية إلى كسور باستخدام تدرج كثافة iodixanol. تم إثراء المركبات الكهربائية من جميع الكسور باستخدام جزيئات NT80/82 بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. تم تحليل النانوبيليتات CEM باستخدام وصمة عار الغربية لوجود البروتينات علامة exosomal CD81، CD63، وCD9. تم تحليل U1 (± PMA و ± العلاج cART) والضامة الأولية المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 لوجود بروتين الكمامة فيروس نقص المناعة البشرية-1 (p24 و Pr55؛ مخطوف وغير مفك فيروس نقص المناعة البشرية-1 الكمامة بولي بروتين، على التوالي)، فضلا عن CD63. تم فحص الفتحات للأكتين كتحكم. يتم تحديد التجمعات الخارجية الحقيقية (CD81+CD63+CD9+) باللون الأحمر. تم تعديل هذا الرقم من DeMarino، وآخرون6 (B)تم احتضان الناطورين الثقافة لمدة خمسة أيام من الخلايا تحت 1 المصابة مع كاشف هطول الأمطار PEG في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تم فصل المركبات الكهربائية إلى كسور باستخدام تدرج كثافة iodixanol. تم إثراء المركبات الكهربائية من جميع الكسور باستخدام جزيئات NT80/82 بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. تم تشغيل الكسور على وصمة عار الغربية لوجود فيروس نقص المناعة البشرية-1 Nef، Vpr، وTat. تم استخدام أكتين كتحكم. التجمعات الخارجية الحقيقية (CD81+CD63+CD9+ )موضحة باللون الأحمر كما تم تعريفها سابقاً في DeMarino وآخرون6 (C)توضيح تمثيلي لملامح فصل EV التي كانت تتميز سابقاً من أربعة فيروسات مختلفة: فيروس نقص المناعة البشرية-1، HTLV-1، EBOV، وZIKV. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: سير عمل البروتوكول. يجمع سير العمل الجديد بين العديد من التقنيات بما في ذلك الترشيح، وهطول الأمطار EV باستخدام كاشف الأمطار PEG، وفصل تدرج كثافة iodixanol، وإثراء الجسيمات النانوية من المركبات الكهربائية. ويفصل استخدام هذا البروتوكول المركبات الكهربائية عن الفيروسات المختلفة ويوفر عينة صغيرة من الحجم للتجارب النهائية بما في ذلك qPCR، واللطخة الغربية، والقياس الطيفي الكتلي، وتسلسل الحمض النووي الريبي، وتحليل السيتوكين، وELISA، والاختبارات القائمة على الخلايا. وقد عُدل هذا الرقم من DeMarinoوآخرون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تسمح الطريقة الموضحة بتعزيز عائد EV وفصل الفيروس عن المركبات الكهربائية باستخدام نهج مركب للعزل. يمكن تصفية كميات كبيرة نسبيا من المواد الأولية (أي الخلية الفائقة) قبل عزل EV عن طريق هطول الأمطار، وفصل DG، وإثراء الجسيمات النانوية، مما يؤدي إلى حجم نهائي قدره ~ 30 درجة مئوية، مما يسمح للاستخدام الفوري في مجموعة متنوعة من المصب الاختبارات. استخدام إثراء الجسيمات النانوية ضروري، بالمقارنة مع ultracentrifugation التقليدية، وقد ثبت هذه الجسيمات النانوية إثراء EV لالتقاط الحويصلات أكثر كفاءة، مما أسفر عن أكبر من أو يساوي كمية من الحويصلات من 1 مل من الثقافة supernatant مقارنة مع 10 مل من ثقافة فائقة الطرد المركزي supernatant15. وعموما، يتضمن البروتوكول الموصوف مزيجا من عدة تقنيات معروفة، ومن ثم ينبغي أن يمثل صعوبات محدودة. ومع ذلك، فإن إدراج الجسيمات النانوية التي تثري المركبات الكهربائية يقدم تقنية جديدة يمكن أن تتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها و/أو التعديلات لتحقيق نتائج مرغوب فيها اعتماداً على الفحص في المصب أو الهدف البيولوجي موضع الاهتمام. نوصي باحتضان الجسيمات النانوية مع الشركات الخارقة لثقافة الخلايا المصفاة بين عشية وضحاها. إذا كان البروتين المستهدف أو الحمض النووي الريبي من الفائدة منخفضة الوفرة في النظام النموذجي، يمكن تكييف البروتوكول لزيادة فترة الحضانة لضمان التقاط الهدف. ويمكن عادة استخدام الجسيمات النانوية في الاختبارات المصب عن طريق إعادة تعليق بيليه في المخزن المؤقت العينة المطلوبة لكل اختبار. على سبيل المثال، يمكن إعادة تعليق الجسيمات النانوية مباشرة في المخزن المؤقت Laemmli لتحليل اللطخة الغربية. ثم يجب أن تكون المواد التي تم التقاطها أكثر كفاءة من الجسيمات النانوية في SDS عن طريق دورات التدفئة والدوامات. لتحقيق فصل كاف من البروتين، وينبغي توخي الحذر للحد من كمية الجسيمات النانوية المحملة في هلام، وينبغي تشغيل هلام في حوالي 100 V لضمان أي جزيئات المتبقية يتم احتواؤها في الآبار. وعلاوة على ذلك، لتصور البروتينات ذات الوزن الجزيئي المنخفض، فإن نقل الرطب بين عشية وضحاها يحقق النتائج المثلى. وعلى الرغم من أن استخدام الجسيمات النانوية يؤدي إلى إثراء كبير لتجمعات الحويصلات، يجب اتخاذ خطوات إضافية للحصول على المواد الملتقطة من الجسيمات. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يحد من فائدة المركبات الكهربائية في الاختبارات الوظيفية في المصب حيث أن العديد من المخازن المؤقتة للإلتاءصال يمكن أن تضر بسلامة غشاء EV. وهناك حاجة إلى إجراء بحوث إضافية لهندسة استراتيجية للسماح بإزالة الحويصلات السليمة من الجسيمات النانوية بعد الحضانة. وثمة عيب آخر لهذه الجسيمات هو الافتقار الحالي إلى التوصيف. وقد تم تصميم الغلاف الخارجي للجسيمات لاستبعاد جزيئات الوزن الجزيئي العالية. ومع ذلك، لا يتم استهداف الجسيمات على مركبات EVs على وجه التحديد، ونتيجة لذلك يمكن أن يكون العديد من العوامل المربكة وإشارات الخلفية موجودة في الاختبارات النهائية.

الطريقة الموصوفة هي في المقام الأول لاستخدامها في الأغراض المختبرية. لقد قمنا مؤخرًا بتطوير طرق بديلة لتوسيع قدرات نهجنا المركب على تقنيات إضافية لعزل المركبات الكهربائية عن السوائل الحيوية الصغيرة الحجم للمرضى مثل البلازما والسائل السائل والسائل الكربوني اللاإحتيامحل وإنتاج EV التجاري على نطاق واسع. لعزل المركبات الكهربائية بعيدا عن الفيروس في المواد المريض قمنا بدمج استخدام حجم استبعاد أعمدة اللونيات (SEC)، والتي تستخدم بدلا من تدرج الكثافة. هذه الأعمدة مفيدة من حيث أنها يمكن التخلص منها، وبالتالي فهي مثالية في مختبرات الاحتواء العالي. ومع ذلك، أعمدة SEC منفصلة الجسيمات وفقا لحجم، وبالتالي، فإنه يترتب على ذلك أن هذا النوع من الفصل ينطبق فقط لفصل الفيروسات الكبيرة أو الصغيرة جدا، مثل EBOV (~ 1 ميكرومتر) أو ZIKV (~ 40 نانومتر)، على التوالي، من المركبات الكهربائية أو الانفصال بعيدا عن بروتين مجاني. من حيث إنتاج المركبات الكهربائية على نطاق واسع، سمحت التطورات الأخيرة في الأساليب القائمة على الترشيح، أي ترشيح التدفق العرضي (TFF)، بعزل المركبات الكهربائية بكفاءة عن أحجام العينات الكبيرة. وقد استخدمت TFF تاريخيا لتنقية الجزيئات الحيوية نانوية الحجم، بما في ذلك الفيروسات، ومن خلال تحسين البروتوكولات تم تكييف هذا النظام بنجاح لعزل المركبات الكهربائية24،25. باختصار، خلال عملية TFF، عينة تدفقات السوائل بشكل عرضي عبر سطح غشاء شبه نفاذية التي تحتفظ بشكل انتقائي الحويصلات على أساس الحجم والوزن الجزيئي، مما يسمح لفصل المركبات الكهربائية بعيدا عن البروتينات الحرة وغيرها تلوث الجزيئات الحيوية26. بالمقارنة مع ultracentrifugation, وقد أفيد أن TFF يؤدي إلى عوائد أعلى, أقل تجميع, ويقلل من تقلب الكثير إلى الكثير من المركبات الكهربائية27. بالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ أيضا عن استخدام TFF لممارسة التصنيع الجيدة (GMP) الصف العزل من المركبات الكهربائية للتطبيق العلاجي28. نظرًا لقابلية التوسع وإمكانية التكرار، توفر هذه التكنولوجيا إمكانات كبيرة لبحوث EV المستقبلية.

الفيروسات تأتي في أحجام وكثافات مختلفة، وبالتالي اعتمادا على الفيروس في السؤال، قد تكون هناك حاجة إلى تحسين هذا البروتوكول. بالنسبة للفيروسات الكبيرة جداً مثل الإيبولا (حوالي 1 ميكرومتر أو أكبر في الطول)، يمكن استخدام الترشيح البسيط لإزالة الغالبية العظمى من virions والهيئات الملوثة الكبيرة مثل VLPs والهيئات المبرمجة14. وهذا يسمح لمعظم فصل الفيروس بعيدا عن المركبات الكهربائية لتكون قابلة للتنفيذ على الطرف الأمامي من تنقية. ومع ذلك، في حالة الفيروسات الصغيرة مثل الفيروس المعوي (~ 30 نانومتر)، فيروس زيكا (~ 40 نانومتر)، فيروس التهاب الكبد B (~ 42 نانومتر)، فيروس التهاب الكبد C (~ 55 نانومتر)، وغيرها، فإن الكسر الذي سوف تحتاج إلى تحديد رواسب virions قبل مزيد من المصب وظيفية تحليلات. ولا يمكن للمرء دائما أن يقارب الكسر المحتمل للترسب استنادا إلى قطر الجسيمات وحده. على سبيل المثال، فيروس شلل الأطفال، الذي يبلغ قطره 30 نانومتر، ومن المعروف أيضا أن مغلفة في autophagosomes إفراز29،30،31،32،33،وبالتالي من المرجح أن تكون موجودة على الجانب الأيمن من التدرج (الكسور الأكثر كثافة) بدلاً من اليسار (الكسور الأقل كثافة). في حين أننا قد الأمثل هذا البروتوكول في حالة فيروس نقص المناعة البشرية-1، HTLV-1، وEBOV VLPs، سوف تحتاج الفيروسات الإضافية توصيف لضبط البروتوكول لتنقية محددة بعيدا عن المركبات الكهربائية.

البروتوكول المبين هنا(الشكل 4)يسمح، لأول مرة، للمستخدم لفصل المركبات الكهربائية من الفيروس مع كفاءة معززة وكميات أصغر من المواد البداية بالمقارنة مع المعيار الذهبي لعزل EV، ultracentrifugation. ويمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة مع الظروف في متناول اليد بما في ذلك أحجام العينة المختلفة، والغلة المطلوبة، ونوع المواد الأولية (أي الثقافة الفائقة مقابل مادة المريض)، والفيروسات المختلفة المختلفة من أحجام مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

B.L. هو التابعة لسيريس Nanosciences المؤتمر الوطني العراقي التي تنتج الكواشف و / أو الأدوات المستخدمة في هذه المقالة. ولا يعلن جميع المؤلفين الآخرين عن أي تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgments

نود أن نشكر جميع أعضاء مختبر كاشانشي، وخاصة جوين كوكس. وقد تم دعم هذا العمل بمنح المعاهد الوطنية للصحة (AI078859، AI074410، AI127351-01، AI043894، وNS099029 إلى F.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CEM CD4+ Cells NIH AIDS Reagent Program 117 CEM
DPBS without Ca and Mg (1x) Quality Biological 114-057-101
ExoMAX Opti-Enhancer Systems Biosciences EXOMAX24A-1 PEG precipitation reagent
Exosome-Depleted FBS Thermo Fisher Scientific A2720801
Fetal Bovine Serum Peak Serum PS-FB3 Serum
HIV-1 infected U937 Cells NIH AIDS Reagent Program 165 U1
Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA Thermo Scientific 723-2520
Nanotrap (NT80) Ceres Nanosciences CN1030 Reactive Red 120 core
Nanotrap (NT82) Ceres Nanosciences CN2010 Cibacron Blue F3GA core
Optima XE-980 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma-Aldrich D1556-250mL Iodixanol
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 331362
Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm Beckman Coulter 344059

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
  2. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
  3. Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
  4. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  5. Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
  6. DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).
  7. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  8. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
  9. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  10. Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
  11. Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).
  12. Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
  13. Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).
  14. Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  15. Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).
  16. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
  17. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  18. Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).
  19. Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
  20. Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542 (2017).
  21. Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
  22. Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).
  23. Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
  24. Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
  25. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
  26. Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, Clifton, N.J. 33-41 (2017).
  27. Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
  28. Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).
  29. Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).
  30. Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
  31. Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
  32. Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).
  33. Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).

Tags

علم المناعة والعدوى العدد 151 الحويصلات خارج الخلية exosome فيروس تنقية كثافة التدرج ultracentrifugation هطول الأمطار الجسيمات النانوية إثراء EV
تنقية عالية الغلة الاستعدادات الحويصلة خارج الخلية بعيدا عن الفيروس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DeMarino, C., Barclay, R. A., Pleet, … More

DeMarino, C., Barclay, R. A., Pleet, M. L., Pinto, D. O., Branscome, H., Paul, S., Lepene, B., El-Hage, N., Kashanchi, F. Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus. J. Vis. Exp. (151), e59876, doi:10.3791/59876 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter