A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Dit protocol isoleert extracellulaire blaasjes (Ev’s) uit de buurt van virionen met hoge efficiëntie en opbrengst door het opnemen van EV-neerslag, dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en deeltjes opname om een gestroomlijnde workflow en een reductie van start volume vereisten, resulterend in reproduceerbare preparaten voor gebruik in alle EV-onderzoek.

Abstract

Een van de belangrijkste obstakels op het gebied van extracellulair blaasje (EV) onderzoek vandaag is het vermogen om gezuiverde EV preparaten in een virale infectie setting te bereiken. De gepresenteerde methode is bedoeld om EVs uit de buurt van virionen (d.w.z. HIV-1) te isoleren, waardoor een hogere efficiëntie en opbrengst mogelijk is in vergelijking met conventionele ultracentrifugingsmethoden. Ons protocol bevat drie stappen: EV neerslag, dichtheidsgradiënt scheiding en deeltjes opname. Downstream assays (d.w.z. Western Blot en PCR) kunnen direct na het vastleggen van deeltjes worden uitgevoerd. Deze methode is voordelig ten opzichte van andere isolatie methoden (d.w.z. ultracentrifugatie) omdat het gebruik van minimale start volumes mogelijk maakt. Bovendien is het gebruiksvriendelijker dan alternatieve EV-isolatie methoden waarvoor meerdere ultracentrifugingsstappen nodig zijn. De gepresenteerde methode is echter beperkt in de reikwijdte van functionele EV-testen, omdat het moeilijk is om ongeschonden EVs uit onze deeltjes te eldelen. Bovendien is deze methode afgestemd op een strikt op onderzoek gebaseerde instelling en zou deze niet commercieel levensvatbaar zijn.

Introduction

Onderzoek gecentreerd rond extracellulaire blaasjes (Ev’s), in het bijzonder exosomen, een type EV variërend van 30-120 nm en gekenmerkt door de aanwezigheid van drie tetraspanin markers CD81, CD9 en CD63, is grotendeels gevormd door de ontwikkeling van methoden om te isoleren en Reinig de blaasjes van belang. De mogelijkheid om veelzijdige mechanismen te ontleden is belemmerd vanwege complexe en tijdrovende technieken die monsters genereren die bestaan uit een heterogene populatie van blaasjes die via verschillende trajecten worden gegenereerd met een breed scala aan inhoud, maten en Dichtheden. Hoewel dit een probleem is voor bijna alle EV-onderzoek, is het van bijzonder belang bij het bestuderen van EVS in de context van virale infectie, omdat virionen en virusachtige deeltjes (vlp’s) vergelijkbaar in diameter kunnen zijn voor de blaasjes van belang. Zo is het humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) ongeveer 100 nm in diameter, wat ongeveer even groot is als vele soorten Ev’s. Om deze reden hebben we een nieuwe EV-isolatie workflow ontworpen om deze problemen aan te pakken.

De huidige gouden standaard van EV-isolatie is ultracentrifugatie. Deze techniek maakt gebruik van de verschillende blaasje dichtheden, waardoor de blaasjes kunnen worden gescheiden door centrifugeren met differentiële sedimentatie van hogere dichtheids deeltjes versus lagere dichtheids deeltjes in elke fase ^1,2. Er zijn verschillende stappen voor het centrifugeren van lage snelheid vereist om intacte cellen te verwijderen (300-400 x g gedurende 10 min), celresten (~ 2.000 x g gedurende 10 min) en apoptotische lichamen/grote blaasjes (~ 10.000 x g gedurende 10 min). Deze initiële zuiveringen worden gevolgd door ultrasnelle ultracentrifugatie (100000-200000 x g voor 1.5-2 h) aan sediment EVS. Wasstappen worden uitgevoerd om de zuiverheid van de EV verder te waarborgen, maar dit resulteert in de vermindering van het aantal geïsoleerde ev’s, waardoor de totale opbrengst ^3,4wordt verlaagd. Het nut van deze methode wordt verder beperkt door de eis van een groot aantal cellen (ongeveer 1 x 10⁸) en een groot monstervolume (≫ 100 ml) om adequate resultaten te bereiken.

Om de toenemende bezorgdheid aan te pakken, is het neerslaan van blaasjes met hydrofiele polymeren de laatste jaren een nuttige techniek geworden. Polyethyleenglycol (PEG), of andere verwante precipitatie reagentia, stelt de gebruiker in staat om de vesicles, virussen en eiwitten-of proteïne-RNA-aggregaten binnen een monster te trekken door simpelweg het monster met het reagens naar keuze te inbroed, gevolgd door een enkele lage-snelheid centrifugeren^1,2,5. We hebben eerder gemeld dat het gebruik van PEG of gerelateerde methoden om EVs te precipderen in vergelijking met traditionele ultracentrifugatie resulteert in een significant hogere opbrengst⁶. Deze strategie is snel, eenvoudig, vereist geen extra dure apparatuur, is gemakkelijk schaalbaar en behoudt de EV-structuur. Vanwege de promiscue aard van deze methode bevatten de resulterende monsters een verscheidenheid aan producten, waaronder vrije eiwitten, eiwitcomplexen, een reeks Ev’s en virionen, waardoor verdere zuivering nodig is om de gewenste populatie te verkrijgen^{1 ,2,7,8}.

Om de heterogeniteit van de uit verschillende neerslag methoden verkregen EVs te overwinnen, wordt dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie (DG) gebruikt om deeltjes beter te scheiden op basis van hun dichtheid. Deze methode wordt uitgevoerd met behulp van een stapsgewijze helling met behulp van een dichtheidsgradiënt medium, zoals iodixanol of sucrose, die de scheiding van EVs van eiwitten, eiwitcomplexen en virus-of virusachtige deeltjes (Vlp’s) mogelijk maakt. Het is belangrijk op te merken dat, hoewel er ooit werd gedacht dat DG een preciezere scheiding van EV-subpopulaties toeliet, het nu bekend is dat maten en dichtheden van verschillende blaasjes elkaar kunnen overlappen. Exosomen zijn bijvoorbeeld gekend om flotatie dichtheden van 1,08-1.22 g/ml⁹te hebben, terwijl blaasjes geïsoleerd van de Golgi (Copi⁺ of clathrin⁺) een dichtheden van 1.05-1.12 g/ml en die van het endoplasmische reticulum (copii⁺ ) sediment bij 1,18-1,25 g/ml^1,2,3,4,9. Bovendien, indien men exosomale fracties wil vergelijken tegen fracties die virale deeltjes bevatten, kan dit, afhankelijk van de dichtheid van het virus van belang, moeilijker worden — er zijn andere virussen dan HIV-1 die waarschijnlijk op hetzelfde dichtheden als exosomale positieve fracties².

Tot slot is de verrijking van EV-Preps voor downstreamvisualisatie en functionele assays van vitaal belang voor EV-onderzoek. Het gebruik van EV-verrijkende nanodeeltjes, met name multi-functionele hydrogelpartikels met een diameter van 700-800 nm, is een cruciale stap in het bereiken van geconcentreerde EV-Preps. Ze bezitten een aromatische aas met een hoge affiniteit die is ingekapseld door een poreuze buitenste zeef schaal om selectiviteit te bevorderen. De nanodeeltjes die in deze studie worden gebruikt, omvatten twee verschillende preparaten met verschillende kern loten (reactieve rode 120 NT80; en Cibacron blauw F3GA NT82) die hebben aangetoond dat de inname van EVs uit verschillende reagentia en biovloeistoffen toeneemt (Zie de tabel met materialen )^{6,10,11,12,13,14,15}. De deeltjes bieden een eenvoudige verrijking van EVS uit talrijke uitgangsmaterialen, waaronder iodixanol-fracties, supernatant van de celcultuur, evenals biovloeistoffen van patiënten zoals plasma, serum, cerebrale spinale vloeistoffen (CSF) en urine^6,13 .

De hier gepresenteerde methode verbetert de efficiëntie van de huidige EV-zuiverings technieken door verschillende technologieën te combineren; EV neerslag, dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie, en deeltjes opname, om de workflow te stroomlijnen, monster vereisten te verminderen en de opbrengst te verhogen om een meer homogene EV-sample te verkrijgen voor gebruik in alle EV-onderzoek. Deze methode is met name nuttig bij het onderzoek naar EVs en de inhoud ervan tijdens virale infectie, omdat het een filtratie stap van 0,22 μm bevat om grote, ongewenste blaasjes en Vlp’s uit te sluiten en de totale EV-populatie te scheiden op basis van dichtheid om effectief Isoleer EVs uit virionen.

Protocol

1. filtratie en precipitatie van extracellulaire blaasjes (Ev’s) Ter voorbereiding van de kweek supernatant van besmette of getransformuteerde cellen (d.w.z. cellijnen en/of primaire cellen), kweek ongeveer 10 mL laat-log cellen gedurende 5 dagen bij 37 °C en 5% CO2 in een geschikt kweekmedium (D.W.Z. RPMI of DMEM met 10% foetale runderen serum [FBS]).Opmerking: Alle reagentia voor kweekmedium moeten vrij zijn van EVs en kunnen ofwel worden aangekocht (Zie tabel met materialen) of in eigen huis worden bereid door pre-ultracentrifugatie van serum bij 100.000 x g gedurende 90 min. Dit protocol is succesvol geweest voor verschillende veelgebruikte cellijnen, waaronder: CEM, Jurkat, 293T, U937 (niet-geïnfecteerde lijnen), U1, J 1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (HIV-1 en HTLV-1 geïnfecteerde lijnen), meerdere getransfunteerde cellen en primaire myeloïde en T-cellen (beide geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde); Dit protocol kan echter worden gebruikt voor elk celtype, met inbegrip van die die gespecialiseerde media of cultuur voorwaarden vereisen. De dichtheid van cellen moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor verschillende celtypen. Het wordt aanbevolen dat de hoogste dichtheid na 5 dagen met minimale celdood wordt gebruikt. Centrifugeer de kweek op 3.000 x g gedurende 5 minuten tot pellet cellen en gooi de pellet weg. Filtreer de kweek supernatant met een steriel 0,22 μm filter en verzamel filtraat in een schone buis. Voeg gelijk volume PEG precipitatie reagens (1:1 ratio) toe aan gefilterde supernatant. Inverteer buis meerdere malen om een homogeen mengsel te garanderen.Opmerking: Niet Vortex. Incubate mengsel bij 4 °C ‘s nachts (O/N). Centrifuge mengsel bij 1.500 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) om een HETEROGENE EV pellet te leveren.Opmerking: EV pellet moet wit of gebroken wit in kleur verschijnen. Gooi de verarmd cultuur supernatant weg. Rebreng de EV pellet in 150 – 300 μL 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (PBS) en blijf op ijs. 2. constructie van een dichtheidsgradiënt Meng jodixanol-dichtheidsgradiënt medium met 1x PBS om 11 verschillende dichtheids fracties van 1 mL te maken van 6 tot 18% iodixanol in stappen van 1,2% in afzonderlijke micro centrifugebuizen, zoals weergegeven in Figuur 1a. Vortex elke buis te mengen. Laag dichtheids fracties in een voorgereinigde en droge swingende emmer ultracentrifuge buis beginnend met breuk #18 en eindigend met breuk #6 zoals aangegeven in Figuur 1b.Opmerking: Alle buizen moeten worden gezuiverd met behulp van een 10% bleekmiddel spray gevolgd doorspoelen 3x met gedeïoniseerd water en een laatste wassen van steriel gedeïoniseerd water vóór het laden van de gradiënt fracties. Voeg geresuspendeerde EV pellet (300 μL) toe aan de bovenkant van de gelaagde gradiënt in de ultracentrifuge buis. Ultracentrifuge bij 100, 00 x g bij 4 °c gedurende 90 min. Verwijder voorzichtig de 1 mL fracties uit de ultracentrifuge buis en breng elke fractie over in nieuwe micro centrifugebuizen. 3. verrijking van de EV-fracties uUsing nanodeeltjes Maak een 30% slurry van nanodeeltjes met gelijke volumes NT80, NT82 en 1x PBS.Opmerking: Het mengsel moet voorafgaand aan het gebruik worden getexed om de homogeniteit te waarborgen. Voeg 30 μL van de slurry toe aan elke micro centrifugebuis met de dichtheids fracties en pipet/Inverteer ze meerdere malen om te mengen. Draai EV-verrijkende nanodeeltjes-bevattende dichtheids fractie micro centrifugebuizen O/N bij 4 °C bij ongeveer 20 TPM. Centrifugeer dichtheids fractie micro centrifugebuizen bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi de vloeistof weg en was EV pellet twee keer met 1x PBS.Opmerking: Nanodeeltjes pellets kunnen worden bevroren bij-20 °C of onmiddellijk worden gebruikt voor verschillende downstream testen (d.w.z. PCR, Western Blot, massaspectrometrie, en andere testen). 4. Aanbevolen bereiding van nanodeeltjes pellet voor downstream assays Voor RNA-isolatie Respendeer de pellet in 50 μL geautoclaveerd gedeïoniseerd water, behandeld met 0,001% diethylpyrocarbonaat (DEPC) gefilterd door een 0,2 μm filter en isolaat RNA volgens het Protocol van de fabrikant van de kit. Voor gel elektroforese Rebreng de pellet direct in 15 μL Laemmli buffer. Warmte monster 3x bij 95 °C gedurende 3 min. Vortex zachtjes en spin naar beneden tussen elke warmte cyclus. Centrifugeer het monster voor 15 sec. bij 20.000 x g en laad al het geeleerde materiaal direct op de gel.Opmerking: voor de beste resultaten, beperk de hoeveelheid deeltjes geladen op de gel en voer de gel op 100 V om ervoor te zorgen dat eventuele resterende deeltjes zijn opgenomen in de putten. Voor trypsine spijsvertering Respendeer de pellet in 20 μL ureum vóór alkylatie en trypsinoisatie van het monster. Nanodeeltjes kunnen worden gepelleteerd door een 14.000 x g centrifugeren bij RT gedurende 10 min. monster met de trypsinized peptide kan worden overgebracht in een schone opvang buis.

Representative Results

PEG-neerslag verhoogt de EV-opbrengstOnze combinatie benadering van EV-isolatie is aanzienlijk efficiënter in termen van EV-terugwinning in vergelijking met traditionele ultracentrifugatie, zoals blijkt uit de reductie van 90% in het volume van het benodigde startmateriaal. Ultracentrifugatie, de huidige gouden standaard in EV-isolatie, vereist ongeveer 100 mL cultuur supernatant om een adequate EV-prep voor downstream-assays te produceren, terwijl ons nieuwe protoco…

Discussion

De beschreven methode zorgt voor een verbeterde EV-opbrengst en de scheiding van het virus van EVs met behulp van een gecombineerde benadering van isolatie. Relatief grote hoeveelheden uitgangsmateriaal (d.w.z. celsupernatant) kunnen vóór de EV-isolatie worden gefilterd door precipitatie, DG scheiding en verrijking van nanodeeltjes, resulterend in een eindvolume van ~ 30 μL, waardoor direct gebruik in een verscheidenheid van downstream assays. Het gebruik van nanodeeltjes verrijking is essentieel omdat, in vergelijkin…

Materials

CEM CD4<sup>+</sup> Cells	NIH AIDS Reagent Program	117	CEM
DPBS without Ca and Mg (1x)	Quality Biological	114-057-101
ExoMAX Opti-Enhancer	Systems Biosciences	EXOMAX24A-1	PEG precipitation reagent
Exosome-Depleted FBS	Thermo Fisher Scientific	A2720801
Fetal Bovine Serum	Peak Serum	PS-FB3	Serum
HIV-1 infected U937 Cells	NIH AIDS Reagent Program	165	U1
Nalgene Syringe Filter 0.2 &micro;m SFCA	Thermo Scientific	723-2520
Nanotrap (NT80)	Ceres Nanosciences	CN1030	Reactive Red 120 core
Nanotrap (NT82)	Ceres Nanosciences	CN2010	Cibacron Blue F3GA core
Optima XE-980 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
OptiPrep Density Gradient Medium	Sigma-Aldrich	D1556-250mL	Iodixanol
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	331362
Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm	Beckman Coulter	344059