Summary
Este protocolo isola vesículas extracelulares (EVs) longe de virions com alta eficiência e rendimento através da incorporação de precipitação EV, ultracentlee gradiente de densidade, e captura de partículas para permitir um fluxo de trabalho simplificado e uma redução de partida requisitos de volume, resultando em preparações reprodutíveis para uso em todas as pesquisas EV.
Abstract
Um dos obstáculos principais no campo da pesquisa extracelular do vesícula (EV) é hoje a habilidade de conseguir preparações purified do EV em um ajuste viral da infecção. O método apresentado destina-se a isolar EVs longe de virions (ou seja, HIV-1), permitindo uma maior eficiência e rendimento em comparação com os métodos convencionais de ultracentilugação. Nosso protocolo contém três etapas: precipitação de EV, separação de gradiente de densidade e captura de partículas. Os ensaios a jusante (i.e., Western blot e PCR) podem ser executados diretamente após a captura de partículas. Este método é vantajoso sobre outros métodos do isolamento (isto é, ultracentlee) porque permite o uso de volumes começando mínimos. Além disso, é mais amigável do que métodos alternativos do isolamento de EV que exigem etapas múltiplas do ultracentlee. Entretanto, o método apresentado é limitado em seu espaço de ensaios funcionais do EV porque é difícil eluir EVS intactos de nossas partículas. Além disso, este método é adaptado para um ajuste estritamente baseado em pesquisa e não seria comercialmente viável.
Introduction
Pesquisa centrada em torno de vesículas extracelulares (EVs), especificamente exosomas, um tipo de EV variando 30-120 nm e caracterizada pela presença de três marcadores de tetraspanina CD81, CD9 e CD63, tem sido largamente moldado pelo desenvolvimento de métodos para isolar e purificar as vesículas de interesse. A capacidade de dissecar mecanismos multifacetados tem sido dificultada devido a técnicas complexas e demoradas que geram amostras compostas por uma população heterogênea de vesículas geradas através de diferentes vias com uma ampla gama de conteúdos, tamanhos e Densidades. Embora esta seja uma questão para quase todas as pesquisas EV, é de particular importância ao estudar EVs no contexto da infecção viral, como virions e vírus-como partículas (VLPs) pode ser semelhante em diâmetro para as vesículas de interesse. Por exemplo, o tipo 1 do vírus de imunodeficiência humana (HIV-1) é aproximadamente 100 nanômetro no diâmetro, que é aproximadamente o mesmo tamanho que muitos tipos de EVs. Por esse motivo, projetamos um novo fluxo de trabalho de isolamento de EV para abordar esses problemas.
O padrão ouro atual de isolamento EV é ultracentlee. Esta técnica faz uso das várias densidades da vesícula, o que permite que as vesículas sejam separadas por centrifugação com sedimentação diferencial de partículas de maior densidade versus partículas de menor densidade em cada etapa 1,2. Várias etapas de centrifugação de baixa velocidade são necessárias para remover células intactas (300-400 x g por 10 min), detritos celulares (~ 2.000 x g por 10 min) e corpos apoptóticos/grandes vesículas (~ 10.000 x g por 10 min). Estas purificações iniciais são seguidas por ultracentlee de alta velocidade (100000-200000 x g para 1.5-2 h) aos EVS do sedimento. As etapas da lavagem são executadas para assegurar mais a pureza do EV, entretanto, isto conduz à redução do número de EVS isolados, assim abaixando o rendimento total 3,4. O utilitário deste método é ainda mais limitado pela exigência de um grande número de células (aproximadamente 1 x 108) e um grande volume amostral (≫ 100 ml) para alcançar resultados adequados.
Para abordar as crescentes preocupações, a precipitação de vesículas com polímeros hidrofílicos tornou-se uma técnica útil nos últimos anos. O polietileno glicol (PEG), ou outros reagentes relacionados da precipitação, permite que o usuário puxe para baixo as vesículas, os vírus, e os agregados da proteína ou do proteína-RNA dentro de uma amostra simplesmente incubando a amostra com o reagente da escolha, seguido por um único de baixa velocidade centrifugação1,2,5. Nós temos relatado previamente que o uso do PEG ou de métodos relacionados para precipentar EVs em comparação com os resultados tradicionais do ultracentlee em um rendimento significativamente mais elevado6. Esta estratégia é rápida, fácil, não requer equipamentos caros adicionais, é prontamente escalável, e retém a estrutura EV. No entanto, devido à natureza promíscuo deste método, as amostras resultantes contêm uma variedade de produtos, incluindo proteínas livres, complexos proteicos, uma gama de EVs, e virions, assim, exigindo mais purificação para obter a população desejada1 ,2,7,8.
Para superar a heterogeneidade de EVs obtidos de vários métodos da precipitação, o ultracentlee do inclinação da densidade (DG) é utilizado para separar melhor partículas baseadas em sua densidade. Este método é realizado usando um gradiente Stepwise usando um meio de gradiente de densidade, como iodixanol ou sacarose, que permite a separação de EVs de proteínas, complexos proteicos, e vírus ou vírus-como partículas (VLPs). É importante notar que, embora já tenha sido pensado que a DG permitiu a separação mais precisa das subpopulações de EV, sabe-se agora que os tamanhos e densidades de várias vesículas podem se sobrepor. Por exemplo, os exosomas são conhecidos por terem densidades de flotação de 1,08-1,22 g/mL9, enquanto as vesículas isoladas do GOLGI (copi+ ou clathrin+) têm densidades de 1,05-1,12 g/ml e as do retículo endoplasmático (copii+ ) sedimento em 1,18-1,25 g/ml1,2,3,4,9. Adicionalmente, se um deseja comparar frações exosomal de encontro às frações que contêm partículas virais, esta pode tornar-se mais difícil depender em cima da densidade do vírus do interesse-há uns vírus à excepção do HIV-1 que equilibram provável ao mesmo densidades como frações positivas exosomáticas2.
Finalmente, o enriquecimento de EV Preps para visualização a jusante e ensaios funcionais é vital para a pesquisa EV. O uso de nanopartículas enriquecedora de EV, especificamente, partículas de hidrogel multifuncionais que variam 700-800 nm de diâmetro, são um passo crítico na obtenção de Preps concentrados de EV. Possuem uma isca aromática da afinidade elevada que encapsulado por um escudo de peneiramento exterior poroso para promover o selectivity. As nanopartículas utilizadas neste estudo incluem duas preparações distintas com diferentes iscas de núcleo (vermelho reactivo 120 NT80; e cibacron Blue F3GA NT82) que demonstraram aumentar a captação de EVS de vários reagentes e biofluídos (ver a tabela de materiais )6,10,11,12,13,14,15. As partículas oferecem o enriquecimento fácil dos EVS dos materiais começando numerosos que incluem frações do iodixanol, sobrenadante da cultura de pilha, assim como biofluídos pacientes tais como o plasma, o soro, os líquidos espinais cerebrais (CSF), e a urina6,13 .
O método aqui apresentado melhora a eficiência das técnicas atuais de purificação de EV, combinando várias tecnologias; Precipitação EV, ultracentlee gradiente de densidade, e captura de partículas, para agilizar o fluxo de trabalho, reduzir os requisitos da amostra, e aumentar o rendimento para obter uma amostra EV mais homogênea para uso em todas as pesquisas EV. Este método é particularmente útil na investigação de EVs e seu conteúdo durante a infecção viral, pois inclui um passo de filtração de 0,22 μm para excluir vesículas grandes, indesejadas e VLPs e separação da população total de EV com base na densidade para efetivamente isolar EVs de virions.
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Protocol
1. filtração e precipitação de vesículas extracelulares (EVs)
- Para preparar o sobrenadante de cultura de células infectadas ou transfectadas (i.e., linhas celulares e/ou células primárias), cultura aproximadamente 10 mL de células de log tardio por 5 dias a 37 ° c e 5% CO2 em meio de cultura apropriado (i.e., RPMI ou DMEM com 10% de bovinos fetais soro [FBS]).
Nota: Todos os reagentes do meio de cultura devem estar livres de EVs, podendo ser comprados (ver tabela de materiais) ou preparados em casa por pré-ultracentlee de soro a 100.000 x g por 90 min. Este protocolo foi bem-sucedido para várias linhas celulares comumente usadas, incluindo: CEM, Jurkat, 293T, U937 (linhas não infectadas), U1, J 1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (linhas infectadas pelo HIV-1 e HTLV-1), células múltiplas transfectadas e células mielóides e T primárias (ambas infectados e não infectados); no entanto, esse protocolo pode ser usado para qualquer tipo de célula, incluindo aqueles que exigem mídia especializada ou condições de cultura. Densidade de células pode precisar ser otimizado para diferentes tipos de células. Recomenda-se que a maior densidade seja usada com morte celular mínima após 5 dias. - Centrifugue a cultura em 3.000 x g por 5 min às pilhas da pelota e rejeite o pellet.
- Filtre o sobrenadante de cultura usando um filtro estéril de 0,22 μm e colete o filtrado em um tubo limpo.
- Adicione o volume igual do reagente da precipitação do PEG (relação 1:1) ao sobrenadante filtrado. Inverta o tubo diversas vezes para assegurar uma mistura homogênea.
Nota: Não vortex. - Incubar a mistura a 4 ° c durante a noite (O/N).
- Centrifugue a mistura em 1.500 x g por 30 minutos na temperatura ambiente (RT) para produzir um pellet HETEROGÊNEO de EV.
Nota: EV pellet deve aparecer branco ou off-White na cor. - Descarte o sobrenadante de cultura empobrecido EV.
- Ressuscitem o sedimento EV em 150 – 300 μL de soro fisiológico com tampão de fosfato 1x sem cálcio e magnésio (PBS) e mantenha-se no gelo.
2. construção de um gradiente de densidade
- Misture o meio de gradiente de densidade iodixanol com 1X PBS para criar 11 frações de densidade de 1 mL diferentes de 6 a 18% de iodixanol em incrementos de 1,2% em tubos de microcentrífuga separados, como mostrado na Figura 1a.
- Vórtice cada tubo para misturar.
- Frações da densidade da camada em um tubo de balanço pre-limpado e seco da cubeta do ultracentlee que começa com fração #18 e terminando com a fração #6 como indicado na Figura 1b.
Nota: Todos os tubos devem ser higienizados utilizando um spray de alvejante a 10% seguido de enxaguar 3x com água desionizada e uma lavagem final de água desionizada estéril antes do carregamento das frações de gradiente. - Adicione a pelota ressuscitada do EV (300 μL) à parte superior do inclinação mergulhado no tubo do ultracentlee.
- Ultracentlee em 100, 00 x g em 4 ° c para 90 min.
- Retire cuidadosamente as frações de 1 mL do tubo ultracentlee e transfira cada fração para novos tubos de microcentrífuga.
3. enriquecimento das frações EV uusando nanopartículas
- Crie uma pasta de nanopartículas de 30% usando volumes iguais de NT80, NT82 e 1X PBS.
Nota: A mistura deve ser vórtice antes de usar para garantir a homogeneidade. - Adicionar 30 μL da pasta a cada tubo de microcentrífuga contendo as frações de densidade e pipetar/invertê-los várias vezes para misturar.
- Gire os tubos de microcentrífuga de fração de densidade contendo nanopartículas EV enriquecedora O/N a 4 ° c a aproximadamente 20 rpm.
- Centrífuga tubos de microcentrífuga de fração de densidade em 20.000 x g por 5 min em RT.
- Descarte o líquido e lave o pellet EV duas vezes com 1X PBS.
Nota: As pelotas da nanopartícula podem ser congeladas em-20 ° c ou ser usadas imediatamente para vários ensaios a jusante (isto é, PCR, borrão ocidental, espectrometria maciça, e outros ensaios).
4. preparação recomendada da pelota da nanopartícula para ensaios a jusante
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Para isolamento de RNA
- Ressuscitou o pellet em 50 μL de água desionizada autoclavada tratada com 0, 1% de pirocarbonato de dietilo (DEPC) filtrado através de um filtro de 0,2 μm e isole o RNA de acordo com o protocolo do fabricante do kit.
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Para eletroforese em gel
- Suspender o pellet diretamente em 15 μL de tampão de Laemmli.
- Amostra de calor 3x a 95 ° c por 3 min. Vortex suavemente e gire para baixo entre cada ciclo de calor.
- Centrifugue a amostra para 15 s em 20.000 x g e carregue todo o material eluída diretamente no gel.
Nota: para melhores resultados, limitar a quantidade de partículas carregadas sobre o gel e executar o gel em 100 V para garantir que todas as partículas restantes estão contidos para os poços.
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Para a digestão de tripsina
- Ressuscitação da pelota em 20 μL de ureia antes da alquilação e tripsinização da amostra. As nanopartículas podem ser peletizadas por uma centrifugação de 14.000 x g em RT por 10 min. a amostra contendo o peptídeo tripsinizadas pode ser transferida para um tubo de coleta limpo.
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Representative Results
Precipitação de PEG aumenta o rendimento de EV
Nossa abordagem de combinação para o isolamento de EV é significativamente mais eficiente em termos de recuperação de EV em comparação com a ultracentlee tradicional, como evidente pela redução de 90% no volume de material de partida necessário. Ultracentlee, o padrão ouro atual no isolamento EV, requer aproximadamente 100 mL de sobrenadante de cultura para produzir uma preparação adequada de EV para ensaios a jusante, enquanto o nosso novo protocolo requer apenas 10 mL. Esta redução é possível através da utilização do reagente de precipitação PEG EV que proporciona um aumento significativo no rendimento de EV medido pela análise de nanotracking (NTA). Os resultados da Figura 2a, que foram publicados anteriormente6, indicam que, ao utilizar 10 ml de precipitação de Peg de cultura sobrenadante resultou na recuperação de 7,27 x 1010 evs, que foi aproximadamente 500 vezes mais do que o número de EVs recuperados a partir do mesmo material de partida usando ultracentlee (1,45 x 108). O aumento da eficiência do isolamento de exosomas, um subtipo específico de EV, também foi observado como evidente pelo aumento dos níveis de proteínas de marcador exossomo bem caracterizadas, CD81, CD63 e CD9. Western blot análise comparando EV Preps produzidos a partir de qualquer ultracentlee ou precipitação EV usando um reagente de precipitação PEG é mostrado na Figura 2b. Estes resultados mostram um aumento de 3.000 vezes em CD81, um aumento de 4 vezes em CD63, e um aumento de 40 vezes em CD9 medido pela análise da densitometria. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o protocolo delineado não só aumenta o rendimento total de EV, mas também melhora a recuperação de exosomas quando comparado com a ultracentlee.
Caracterização de EVs e separação de EVs longe do vírus HIV-1
Para caracterizar as vesículas presentes em cada fração após o enriquecimento de nanopartículas, os EVs foram isolados de sobrenadante de cultura de células U1 infectados pelo CEM ou HIV-1, utilizando o protocolo delineado e caracterizados pelo uso de Western blot de cada fração de iodixanol enriquecida com nanopartículas. Os dados da Figura 3a mostram nossos resultados previamente publicados que demonstram a presença ou ausência de três tetraspaninas exosomáticas (CD81, CD63 e CD9) em cada fração (células cem; painel superior). Os resultados indicam que os exosomas, como definido pela presença de todas as três tetraspaninas dentro da fração, são encontrados em três populações distintas: EXO #1 que inclui frações 10.8-12.0, exo #2 que inclui as frações 15.6-16.8, e EXO # 3 que inclui apenas a fração 18,0. Apesar da presença de três populações distintas, o protocolo não pode descartar a possibilidade da presença de tipos adicionais de EVs dentro de cada fração. Além disso, esses resultados não excluem definitivamente a possibilidade de haver vesículas nessas populações que são positivas para uma combinação dos marcadores de tetraspanina testados. Estes EVs podiam então ser separados mais por estratégias adicionais da purificação.
O campo ràpida de desenvolvimento da pesquisa de EV/exosome explodiu desde sua descoberta e conduziu a muitas funções e aplicações nova para estas vesículas. Em particular, seu papel como mensageiros intracelulares em não apenas a fisiologia normal, mas também na doença, levou ao uso de recursos significativos para dissecar os efeitos e a utilidade de vesículas extracelulares, especificamente exosomas, em células receptoras16 , 17 anos de , 18. numerosos estudos têm implicado EVS na patogénese de uma variedade de infecções, incluindo o VIH-1 6,10,12,19,20,21 , 22. Entretanto, a similaridade do tamanho entre EVS e virions apresenta um obstáculo potencial em definir estes mecanismos EV-negociados. Para abordar esta preocupação, nós projetamos nosso protocolo para implementar um gradiente de densidade para efetivamente separar populações de EV de virions. Para este fim, o sobrenadante da cultura de pilha das pilhas infectadas HIV-1 foi sujeitado ao protocolo apresentado e analisado pelo borrão ocidental para a presença de HIV-1 gag p24 para determinar que fração ou frações continham virions de HIV-1. Os resultados mostrados na Figura 3a (painel médio) mostram a localização de p24 em três condições independentes: na ausência de um indutor, na presença de um indutor (phorbol 12-Myristate 13-acetato; PMA), e na presença de PMA e terapia antirretroviral combinada (cART), o tratamento padrão para o HIV-1. Esses dados indicam que o vírus HIV-1 está localizado na fração 16,8, medido pela presença de p24 e sua poliproteína uncleaved Pr55. Além disso, quando as células são submetidas ao cART, que inclui indinavir, um inibidor de protease que impede a clivagem de Pr55 a p24, nenhum p24 foi detectado em qualquer fração. Em vez disso, apenas Pr55 foi detectado e esteve presente nas frações de 16,8-18,0, indicando uma mudança de vírus em frações mais densas. Resultados semelhantes foram obtidos por meio de macrófagos primários (painel inferior). Embora o protocolo descrito resulte na cosedimentação de exo #2 e EXO #3 populações com vírus, a população EXO #1 (frações 10.8-12,0) permaneceu livre de vírus, permitindo a jusante ensaios livres de contaminação por vírus.
Este tipo de separação do vírus longe de EVS permite-nos de endereçar a possibilidade de partes de vírus que entram em EVS ou de ser secretado das pilhas contaminadas como a proteína livre. Os resultados da Figura 3B indicam que a proteína NEF do HIV-1 pode ser encontrada na população de EXO #1, além das populações exo #2 e EXO #3. NEF também aparece na fração 6,0, indicando que NEF pode ser potencialmente secretado de células infectadas como uma proteína livre e dentro de um EV. Adicionalmente, a proteína HIV-1 VPR é encontrada na fração 6,0, enquanto a proteína do tat HIV-1 é predominantemente encontrada na fração 6,0, mas também aparece nas frações 7.2-9.6. Atualmente, estamos testando todas as frações para a presença de proteína tat por ELISA. Estes resultados indicam que o Tat e o VPR podem ser secretados a partir de células infectadas, provavelmente como proteínas livres, enquanto tat também pode ser incorporado em EVs. Coletivamente, esses dados indicam que nosso método de isolamento de EV pode isolar com sucesso exosomas (EXO #1) longe de virions HIV-1 (exo #2 e #3) e que os EVs de células infectadas pelo HIV-1 contêm algumas proteínas HIV-1, que podem afetar a patogênese do HIV-1.
Caracterização de EVs e separação de EVs longe de outros vírus
Para aplicar este protocolo a outros modelos virais da infecção, nós caracterizamos vesículas das pilhas contaminadas com diversos vírus diferentes. A Figura 3C mostra uma ilustração de distribuições de vesículas e vírus previamente obtidas após precipitação, separação e enriquecimento de acordo com o protocolo descrito. Como mostrado anteriormente na Figura 3a, os EXOSOMAS (CD9+CD63+CD81+) estão presentes em três populações diferentes (EXO #1, frações 10,8-12,0; Exo #2, frações 15,6-16,8 e EXO # 3, 18,0 fração) e vírus HIV-1 localizam-se nas frações de maior densidade 16,8 e 18,0 (faixas 10-11). Não surprisingly, ao aplicar este protocolo para caracterizar EVS liberados do tipo humano 1 do vírus do T-lymphotropic (HTLV-1), um retrovírus que seja sabido para causar o cancro nos adultos, nós observamos resultados similares àquele de EVS HIV-1-relacionados. O terceiro painel da Fig. 3C mostra que o vírus HTLV-1 foi localizado principalmente para a fração de maior densidade (18,0) e, em menor grau, frações 13,2-16,8 como evidenciado pela presença de proteína de matriz HTLV-1 (P19). Além disso, nós encontramos previamente que a proteína de transativação HTLV-1, imposto, que é ausente do virion HTLV-1, está atual dentro dos exossomos liberados das pilhas infectadas HTLV-115,23. Os dados da Figura 3C mostram que o imposto estava presente nas frações de menor densidade (6,0-12,0), dois dos quais temos demonstrado conter exosomas (10,8 e 12,0).
Em seguida, testamos o protocolo de isolamento no contexto de vírus maiores e menores, como o vírus Ebola (EBOV) e o vírus Zika (ZIKV), respectivamente, como os viriões HIV-1 e HTLV-1 são tanto retrovírus quanto de diâmetro muito semelhante. Utilizando VLP como modelo substituto de biossegurança nível 2 (BSL-2) do conjunto EBOV e saída, verificou-se que VLP, que tem aproximadamente 1 μm de comprimento, localiza a fração de maior densidade (18,0) na ausência de filtração de 0,22 μm (painel médio, Figura 3C). Além disso, quando VP40, a proteína da matriz de ebov, é expressada em níveis elevados, é secretada da pilha através de diversos mecanismos diferentes tendo por resultado a presença de VP40 em cada fração da densidade, incluindo aquelas a que os exossomos são localizados13 , 14. em contraste, os virions de zikv são significativamente menores do que o HIV-1 virions, medindo aproximadamente 40 nanômetro no diâmetro. O diagrama representativo no painel inferior da Figura 3C mostra a presença de virions de zikv em frações de baixa densidade (6,0-8,4) e alta densidade (15,6-18,0), sugerindo a presença de vírus livre e vírus EV-encapsulated, respectivamente.
Figura 1: Construção de um gradiente de densidade iodixanol. (A) quantidades relativas de iodixanol e PBS utilizadas para criar cada fração de densidade (fração #). A fração # denota a porcentagem de iodixanol incluída em cada fração. Suas densidades relativas e colocação no gradiente são representadas de mais pesado para mais leve. (B) a colocação das frações da densidade (6.0-18) no tubo do ultracentlee é mostrada (lado esquerdo) assim como a posição das três populações do EV (EXO #1, exo #2, EXO #3), EXO-como vesículas, e complexos da proteína. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: o reagente de precipitação Peg aumenta o rendimento de EV. (A) para comparar a recuperação de EV, os EVS foram isolados do sobrenadante de cultura de monócitos infectados com HIV-1 (U1) de 5 d (10 ml), utilizando a ultracentíada tradicional (100.000 x g) ou o reagente de precipitação de Peg (incubação a uma proporção de 1:1). Os EVs de ambos os procedimentos de enriquecimento foram analisados por meio da análise de nanorastreamento para avaliar a concentração de EV resultante, conforme descrito em DeMarino, et al.6. A NTA foi mensurada em 11 posições independentes em triplicata técnica. As barras azuis representam uma média das 33 medições ± S.D. significância estatística foi determinada por meio de teste tde Student bicaudal; p < 0, 1. B. EVS do sobrenadante da cultura cem de 5 dias usando a precipitação do ultracentlee (UC) ou do Peg seguida pela separação da densidade do iodixanol. A ultracentidação foi realizada com 100 mL de sobrenadante de cultura (Lane 1), enquanto a precipitação PEG e o fracionamento iodixanol subsequente foram realizados com 10 mL de sobrenadante de cultura (pista 2). A pelota total de EV Obtida de ultracentlee e a fração 10,8 da separação de PEG/iodixanol foram analisadas por Western blot para a presença de proteínas de marcadores exosomóticos (CD81, CD63 e CD9) com actina como controle. Para maior clareza, as faixas selecionadas do mesmo borrão com exposições idênticas são mostradas no painel B. Este número foi modificado de DeMarino, et al.6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: isolamento de EVs longe de vírus. (A) sobrenadantes de cultura de cinco dias de células cem não infectadas (painel superior), VIH-1 (BA-L; MOI: 0, 1) as células U1 infectadas (± PMA e ± tratamento do carrinho; painel médio) ou macrófagos primários infectados pelo HIV-1 (painel inferior) foram incubadas com reagente de precipitação de PEG a 4 ° c durante a noite. Os EVs foram separados em frações usando um gradiente de densidade iodixanol. Os EVs de todas as frações foram enriquecidos usando NT80/82 partículas durante a noite a 4 ° c. Os nanopellets de CEM foram analisados usando o borrão ocidental para a presença de proteínas do marcador exosomal CD81, CD63, e CD9. U1 (± PMA e ± cART) e macrófagos primários infectados pelo HIV-1 foram analisados quanto à presença de proteína de mordaça do HIV-1 (p24 e Pr55; poliproteína de mordaça com clivagem e uncleaved HIV-1, respectivamente), bem como CD63. Blots foram sonados para actina como um controle. As populações verdadeiras de exossomo (CD81+CD63+CD9+) são esboçadas no vermelho. Este número foi modificado de DeMarino, et al.6 (B) os sobrenadantes de cultura de cinco dias de células U1 infectadas foram incubados com reagente de precipitação de Peg a 4 ° c durante a noite. Os EVs foram separados em frações usando um gradiente de densidade iodixanol. Os EVs de todas as frações foram enriquecidos usando NT80/82 partículas durante a noite a 4 ° c. As frações foram executadas em um borrão ocidental para a presença de HIV-1 NEF, de VPR, e de tat. A actina foi utilizada como controle. As populações verdadeiras de exossomo (CD81+CD63+CD9+) são esboçadas no vermelho como definido previamente em DeMarino, et al.6 (C) ilustração representativa de perfis previamente caracterizados da separação do EV de quatro vírus diferentes: HIV-1, HTLV-1, EBOV e ZIKV. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: fluxo de trabalho do protocolo. O novo fluxo de trabalho combina várias técnicas, incluindo filtração, precipitação EV usando reagente de precipitação PEG, separação de gradiente de densidade iodixanol e enriquecimento de nanopartículas de EVs. A utilização deste protocolo separa EVs de vários vírus e fornece uma amostra de pequeno volume para ensaios a jusante, incluindo qPCR, Western blot, espectrometria de massas, sequenciamento de RNA, análise de citocinas, ELISA e ensaios baseados em células. Este número foi modificado de DeMarino, et al.6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método esboçado permite o rendimento aumentado de EV e a separação de vírus de EVs usando uma aproximação da combinação ao isolamento. Quantidades relativamente grandes de material de partida (ou seja, sobrenadante celular) podem ser filtradas antes do isolamento de EV por precipitação, separação de DG e enriquecimento de nanopartículas, resultando em um volume final de ~ 30 μL, permitindo o uso imediato em uma variedade de ensaios a jusante. O uso do enriquecimento de nanopartículas é essencial, uma vez que, em comparação com a ultracentragem tradicional, estas nanopartículas enriquecedora de EV foram mostradas para capturar vesículas de forma mais eficiente, produzindo uma quantidade maior ou igual a de vesículas de 1 mL de cultura sobrenadante comparado com 10 mL de sobrenadante de cultura ultracentígida15. Globalmente, o protocolo descrito inclui a combinação de várias técnicas bem conhecidas e, portanto, deve apresentar dificuldades limitadas. No entanto, a incorporação de nanopartículas EV-enriquecedora introduz uma nova técnica que pode exigir solução de problemas e/ou modificações para alcançar resultados desejáveis, dependendo do ensaio a jusante ou alvo biológico de interesse. Recomendamos que as nanopartículas sejam incubadas com sobrenadantes de cultura celular filtrada durante a noite. Se a proteína alvo ou RNA de interesse é de baixa abundância no sistema modelo, o protocolo pode ser adaptado para aumentar o período de incubação para garantir a captura do alvo. A utilização de nanopartículas em ensaios a jusante pode tipicamente ser realizada por Ressuspender a pelota no tampão de amostra desejado para cada ensaio. Por exemplo, as nanopartículas podem ser ressuscipended diretamente no tampão de Laemmli para a análise ocidental do borrão. O material capturado deve então ser mais eficientemente eluído das nanopartículas em SDS através de ciclos de aquecimento e vortexing. Para alcançar a separação adequada de proteínas, deve-se tomar cuidado para limitar a quantidade de nanopartículas carregadas no gel, e o gel deve ser executado em aproximadamente 100 V para garantir que quaisquer partículas remanescentes estejam contidas nos poços. Além disso, para a visualização de proteínas de baixo peso molecular, uma transferência úmida durante a noite atinge resultados ideais. Embora o uso de nanopartículas resulte em enriquecimento significativo das populações de vesículas, devem ser tomadas medidas adicionais para Eluir o material capturado das partículas. Além disso, a eluição do material pode potencialmente limitar a utilidade de EVs em ensaios funcionais a jusante como muitos buffers de eluição podem danificar a integridade da membrana EV. Pesquisa adicional é necessária para projetar uma estratégia para permitir a remoção de vesículas intactas de nanopartículas pós-incubação. Outra desvantagem dessas partículas é a atual falta de caracterização. O escudo exterior da partícula foi projetado para excluir moléculas de alto peso molecular. No entanto, a segmentação específica das partículas para EVs não ocorrerá e, como resultado, muitos fatores de confusão e sinais de fundo podem estar presentes em ensaios a jusante.
O método descrito é principalmente para ser usado para fins laboratoriais. Nós desenvolvemos recentemente métodos alternativos para expandir as capacidades de nossa aproximação da combinação às técnicas adicionais para isolar EVS dos biofluídos de pequena escala, pacientes tais como o plasma e o CSF e a produção em grande escala, comercial do EV. Para a isolação de EVs longe do vírus no material paciente nós incorporamos o uso de colunas da cromatografia da exclusão do tamanho (SEC), que são utilizadas no lugar de um inclinação da densidade. Estas colunas são benéficas em que são descartáveis e conseqüentemente são ideais em laboratórios elevados da contenção. No entanto, as colunas SEC separam as partículas de acordo com o tamanho, portanto, segue-se que este tipo de separação só é aplicável para a separação de vírus grandes ou muito pequenos, tais como EBOV (~ 1 μm) ou ZIKV (~ 40 nm), respectivamente, de EVs ou separação longe de proteína livre. Em termos de produção em grande escala de EV, os avanços recentes em métodos baseados em filtração, a saber, a filtração tangencial do fluxo (TFF), permitiram o isolamento eficiente de EVs de grandes volumes de amostra. Tff tem sido historicamente utilizado para a purificação de biomoléculas nanodimensionadas, incluindo vírus, e através da otimização de protocolos este sistema foi adaptado com sucesso para o isolamento de EVS24,25. Momentaneamente, durante o processo de TFF, o líquido da amostra flui tangencialmente através da superfície de uma membrana semi-permeável que conserve seletivamente os vesículas baseados no tamanho e no peso molecular, assim permitindo a separação de EVS longe das proteínas livres e de outras contaminando biomoléculas26. Quando comparado ao ultracentlee, relatou-se que os resultados de TFF em uns rendimentos mais elevados, menos agregação, e reduzem a variabilidade do lote-à-lote de EVs27. Adicionalmente, o uso de TFF para a boa prática da fabricação (GMP)-isolação da classe de EVs para a aplicação terapêutica foi relatado igualmente28. Devido a sua escalabilidade e reprodutibilidade, esta tecnologia oferece o grande potencial para a pesquisa futura do EV.
Os vírus vêm em diferentes tamanhos e densidades, portanto, dependendo do vírus em questão, a otimização deste protocolo pode ser necessária. Para vírus muito grandes, como o Ebola (~ 1 μm ou maior de comprimento), a filtração simples pode ser utilizada para remover a grande maioria dos viriões e grandes corpos contaminantes, como VLPs e corpos apoptóticos14. Isto permite a maioria da separação do vírus longe de EVs para ser executável na extremidade dianteira da purificação. No entanto, no caso de vírus menores, tais como enterovírus (~ 30 nm), vírus Zika (~ 40 nm), vírus da hepatite B (~ 42 nm), vírus da hepatite C (~ 55 nm), e outros, a fração em que o sedimento virions terá de ser determinado antes de mais a jusante funcional Análises. Um não pode sempre aproximar a fração provável do sedimentação baseado no diâmetro da partícula sozinho. Por exemplo, o poliovírus, que é de 30 nm de diâmetro, também é conhecido por ser encapsulado em os secretora29,30,31,32,33, e, portanto, é provável que seja encontrado em o lado direito do gradiente (frações mais densas) em vez da esquerda (frações menos densa). Quando nós otimizarmos este protocolo no caso de HIV-1, de HTLV-1, e de VLPs de EBOV, os vírus adicionais precisarão a caracterização para afinar o protocolo para sua purificação específica longe dos EVs.
O protocolo aqui descrito (Figura 4) permite, pela primeira vez, o usuário separar EVS do vírus com maior eficiência e volumes menores de material de partida em comparação com o padrão-ouro de isolamento EV, ultracentlee. Este método pode facilmente ser adaptado às circunstâncias à disposicão que incluem tamanhos de amostra de variação, rendimentos exigidos, tipo de material de partida (isto é, sobrenadante da cultura contra o material paciente), e vários vírus diferentes de tamanhos diferentes.
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Disclosures
B.L. é afiliado com Ceres Nanosciences Inc. que produz reagentes e/ou instrumentos utilizados neste artigo. Todos os outros autores não declaram potenciais conflitos de interesse.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório Kashanchi, especialmente Gwen Cox. Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde (NIH) subsídios (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 e NS099029 para F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CEM CD4+ Cells | NIH AIDS Reagent Program | 117 | CEM |
| DPBS without Ca and Mg (1x) | Quality Biological | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG precipitation reagent |
| Exosome-Depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
| Fetal Bovine Serum | Peak Serum | PS-FB3 | Serum |
| HIV-1 infected U937 Cells | NIH AIDS Reagent Program | 165 | U1 |
| Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
| Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
| Optima XE-980 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 |
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