Summary
פרוטוקול זה מבודד ושלפוחיות שלפוחית (EVs) הרחק מריטונים עם יעילות גבוהה ותשואה על ידי שילוב משקעים EV, צפיפות הדרגתי מעבר הצבע, ולכידת חלקיקים כדי לאפשר זרימת עבודה יעילה והפחתה של התחלת דרישות נפח, וכתוצאה מכך ההכנות לשימוש בכל מחקר EV.
Abstract
אחד המכשולים העיקריים בתחום של שלפוחית לפוחית מחקרית (EV) מחקר היום היא היכולת להשיג ההכנות EV מטוהרים בסביבה זיהום נגיפי. השיטה המוצגת נועדה לבודד את EVs הרחק מן הריטונים (כלומר, HIV-1), המאפשר יעילות גבוהה יותר ותשואה בהשוואה לשיטות המקובלות המקובלת. הפרוטוקול שלנו מכיל שלושה שלבים: משקעים EV, צפיפות מעבר הצבע ולכידת חלקיקים. במורד הזרם (כלומר, אבן החשופה המערבית ו-PCR) ניתן להפעיל ישירות לאחר לכידת החלקיקים. שיטה זו היא יתרון על שיטות אחרות בידוד (כלומר, ultracent, באמצעות) כפי שהיא מאפשרת שימוש באמצעי אחסון מינימלי המתחיל. יתר על כן, הוא ידידותי יותר למשתמש מאשר שיטות חלופיות EV בידוד המחייב שלבים מרובים ultracentהדו. עם זאת, את השיטה המוצגת מוגבלת היקף הפונקציונלי של EV בחני כפי שקשה לעשות EVs שלם מתוך החלקיקים שלנו. יתרה מזאת, שיטה זו מותאמת להגדרה מבוססת מחקר בלבד ולא תהיה מבחינה מסחרית.
Introduction
מחקר ממורכז סביב שלפוחיות ושלפוחית (EVs), במיוחד אקסוזומים, סוג של EV החל 30-120 ננומטר ומאופיין על ידי נוכחות של שלושה הטטרספב סמנים CD81, CD9, ו CD63, יש בעיקר עיצב על ידי פיתוח שיטות לבידוד ו לטהר את שלפוחית העניין. היכולת לבתר את המנגנונים הפנים היתה מעכבת עקב טכניקות מורכבות וגוזלת זמן היוצרות דגימות המורכבות מאוכלוסיה הטרוגנית של ושלפוחיות באמצעות מסלולים שונים עם מגוון רחב של תוכן, גדלים ו צפיפויות. בעוד זה בעיה עבור כמעט כל מחקר EV, זה חשוב במיוחד כאשר לימוד EVs בהקשר של זיהום נגיפי, כמו הריטונים וחלקיקים כמו וירוס (אחמי ם) יכול להיות דומה בקוטר של שלפוחיות של ריבית. לדוגמה, הנגיף החיסוני האנושי סוג 1 (HIV-1) הוא כ 100 ננומטר בקוטר, וזה בערך באותו גודל כמו סוגים רבים של EVs. מסיבה זו, עיצבנו עבודה בידוד EV הרומן כדי לטפל בנושאים אלה.
התקן הזהב הנוכחי של EV בידוד הוא מאוד. טכניקה זו עושה שימוש בצפיפויות שונות של שלפוחית השמש, אשר מאפשר שלפוחיות להיות מופרדים על ידי צנטריפוגה עם משקעי דיפרנציאליות של חלקיקים בצפיפות גבוהה יותר לעומת חלקיקי צפיפות נמוכה בכל שלב 1,2. כמה צעדים צנטריפוגה במהירות נמוכה נדרשים להסיר תאים שלמים (300-400 x g עבור 10 דקות), פסולת תא (~ 2,000 x g עבור 10 דקות), ו האפוטוטיק גופים/שלפוחיות גדולות (~ 10,000 x g עבור 10 דקות). הפוריאות הראשונית מלווה במהירות גבוהה (100,000-200000 x g עבור 1.5-2 h) כדי משקעים EVs. לשטוף את השלבים מבוצעים כדי להבטיח את הטוהר EV, אולם, התוצאה היא ירידה של מספר EVs מבודדים, ובכך הפחתת התשואה הכוללת 3,4. כלי השירות של שיטה זו מוגבל עוד יותר על-ידי דרישת מספר גדול של תאים (כ 1 x 108) ונפח גדול לדוגמה (≫ 100 mL) כדי להשיג תוצאות מתאימות.
כדי לטפל בחששות ההולכת וגוברת, משקעים של שלפוחיות עם פולימרים הידרופילי הפכו לטכניקה שימושית בשנים האחרונות. פוליאתילן גליקול (פג), או ריאגנטים משקעים קשורים אחרים, מאפשר למשתמש למשוך למטה את שלפוחיות, וירוסים, חלבון או חלבון-RNA אגרגטים בתוך מדגם על-ידי מודסת את המדגם עם מגיב הבחירה, ואחריו מהירות אחת נמוכה צנטריפוגה1,2,5. אנו דיווחו בעבר כי השימוש ב-יתד או שיטות הקשורות לזרז EVs בהשוואה לתוצאות מסורתיות ה, בתשואה גבוהה משמעותית6. אסטרטגיה זו היא מהירה, קלה, אינה דורשת ציוד יקר נוסף, הוא מדרגי בקלות, ושומר על מבנה EV. עם זאת, בשל האופי המופקר של שיטה זו, הדגימות המתקבלות מכילות מגוון של מוצרים, כולל חלבונים בחינם, מכלולי חלבונים, מגוון של EVs, והריטונס ובכך דורשים טיהור נוסף כדי להשיג את האוכלוסייה הרצויה1 ,2,7,8.
כדי להתגבר על הטרוגניות של EVs שהתקבלו משיטות משקעים שונות, צפיפות מעבר הצבע הדרגתי (DG) מנוצל לחלקיקים נפרדים יותר מבוסס על הצפיפות שלהם. שיטה זו מבוצעת באמצעות מעבר הדרגתי באמצעות בינוני מעבר הדרגתי, כגון יודיאקרול או סוכרוז, המאפשר הפרדת EVs מחלבונים, מכלולי חלבונים, וירוסים או חלקיקים כמו וירוס (אחמי ם). חשוב לציין, שבזמן שבעבר חשבו שDG מאפשרת הפרדה מדויקת יותר של אוכלוסיות המשנה EV, ידוע כיום כי גדלים וצפיפויות של שלפוחיות שונות יכולות לחפוף. למשל, אקסוזומים ידועים שיש צפיפות ציפה של 1.08-1.22 g/mL9, ואילו שלפוחיות מבודדות מ-golgi (copi+ או clathrin רין+) יש צפיפויות של 1.05-1.12 g/mL ואלה מתוך הרשתית רשתית פלזמית (copi+ ) משקע ב-1.18 1.25 גרם/mL 1,2,3,4,9. בנוסף, אם אדם משתוקק להשוות שברים אקזומליים נגד שברים המכילים חלקיקים נגיפי, זה עשוי להיות קשה יותר בהתאם לצפיפות של וירוס של עניין-יש וירוסים אחרים מאשר HIV-1 כי סביר להניח באופן זהה צפיפויות שברים חיוביים שלאקזומ2.
בסופו של דבר, העשרה של EV שיטת ' עבור הדמיה במורד הזרם ומוסר פונקציונלי חיוני למחקר EV. השימוש בחלקיקים EV-מעשיר, במיוחד, רב תפקודי הידרוג'ל חלקיקים כי טווח 700-800 ננומטר בקוטר, הם צעד קריטי בהשגת מרוכז EV preps. הם בעלי פיתיון ארומטי בעלי אהדה גבוהה אשר כשעברו על ידי מעטפת ניפוי החיצונית נקבובי לקדם סלקטיביות. חלקיקי חלקיקים מנוצל במחקר זה כוללים שתי הכנות שונות עם פיתיונות ליבה שונה (מגיב אדום 120 NT80; ו cibacron כחול F3GA NT82) אשר הראו כדי להגדיל את הלכידה של EVs מתוך ריאגנטים שונים ביולואידים (לראות את הטבלה של חומרים )6,10,11,12,13,14,15. החלקיקים מציעים העשרה קלים של EVs מחומרי התחלה רבים כולל שברים יודיקסרול, התרבות התאית סופרנטאנט, כמו גם ביולואידים מטופלים כגון פלזמה, סרום, נוזלי עמוד השדרה מוחין (שדרתי), ושתן6,13 .
השיטה המוצגת כאן משפרת את היעילות של טכניקות הטיהור הנוכחיות של EV על ידי שילוב של מספר טכנולוגיות; EV משקעים, צפיפות מעבר הצבע הדרגתי, ולכידת חלקיקים, כדי לייעל את זרימת העבודה, להפחית את הדרישות לדוגמה, ולהגדיל את התשואה כדי להשיג מדגם הומוגנית יותר EV לשימוש בכל EV מחקר. שיטה זו היא שימושית במיוחד בחקירת EVs ותוכנם במהלך זיהום נגיפי כפי שהיא כוללת צעד סינון 0.22 יקרומטר כדי להוציא את החלק הגדול, לא רצוי ושלפוחיות מים והפרדה של אוכלוסיית EV סה כ מבוסס על צפיפות כדי ביעילות בודד את EVs מהריטונים
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. סינון ומשקעים של שלפוחית ושלפוחיות (EVs)
- כדי להכין את התרבות supernatant מתאים נגועים או מזוהמים (כלומר, קווי תא ו/או תאים ראשוניים), תרבות כ 10 מ ל של תאים מאוחר יומן במשך 5 ימים ב 37 ° צ' ו 5% CO2 במדיום התרבות המתאימה (כלומר, RPMI או DMEM גברת עם 10% העובר עוברי סרום [FBS]).
הערה: כל התרבות ריאגנטים בינוני צריך להיות חופשי של EVs, והוא יכול להיות שנרכשו (לראות את הטבלה של חומרים) או מוכן בבית על ידי טרום-ultracהארכה של סרום ב 100,000 x g עבור 90 דקות. פרוטוקול זה הצליח עבור מספר קווי התאים הנפוצים, כולל: צ'ם, ג'ורקאט, 293T, U937 (קווים לא נגועים), U1, J 1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (HIV-1 ו-HTLV-1 הקווים הנגועים), תאים מרובי מזוהמים, ו-T-תאים מיאלואיד ראשי (שניהם נגוע ונגוע); עם זאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עבור כל סוג תא, כולל אלה הדורשים תנאי מדיה או תרבות מיוחדים. ייתכן שיהיה צורך למטב את צפיפות התאים עבור סוגי תאים שונים. מומלץ להשתמש בצפיפות הגבוהה ביותר עם מוות תאים מינימלי לאחר 5 ימים. - צנטריפוגה את התרבות ב 3,000 x g עבור 5 דקות לתאי גלולה ולהשליך את הגלולה.
- לסנן את התרבות supernatant באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר סטרילי ולאסוף פילטרט בצינור נקי.
- הוסף כמות שווה של משקעים יתד (1:1 יחס) כדי לסנן supernatant. היפוך צינור מספר פעמים כדי להבטיח תערובת הומוגנית.
הערה: אל וורטקס. - התערובת מודטה ב -4 ° c לילה (O/N).
- התערובת צנטריפוגה ב 1,500 x g עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי להניב גלולה EV הטרוגנית.
הערה: גלולה EV צריך להופיע לבן או לבנים בצבע. - מחק את הסופרנט של התרבות שנדלה.
- מחדש את הגלולה EV ב 150 – 300 μL של 1 x פוספט באגירה מלוחים ללא סידן ומגנזיום (PBS) ולשמור על קרח.
2. בניית מעבר צפיפות
- מערבבים הדרגתי ודחיסות יודיאקיול בינונית עם 1x PBS כדי ליצור 11 שונים בצפיפות 1 mL מ 6 כדי 18% יודיקסנול ב 1.2% הדרגות בצינורות מיקרוצנטריפוגה נפרדים, כפי שמוצג באיור 1X.
- מערבולת כל צינור לערבב.
- שברים צפיפות שכבה לתוך ניקוי מראש ויבש מנופף דלי ultracentrifuge צינור החל בשבר #18 והסיום עם #6 שבר כפי שצוין באיור 1B.
הערה: כל הצינורות צריך להיות מחוטא באמצעות תרסיס 10% אקונומיקה ואחריו ואחריו שטיפה 3x עם מים מיוהים ושטיפת הסופי של מים מעוקרים סטרילי לפני טעינת שברים מעבר הצבע. - הוסף מושעה גלולה EV (300 μL) לחלק העליון של מעבר הצבע שכבתית בצינור ultracentrifuge.
- Ultracentrifuge ב-100, 00 x g ב -4 ° צ' עבור 90 דקות.
- הסר בזהירות את השברים 1 מ"ל מצינור ultracentrifuge ולהעביר כל שבר לצינורות מיקרוצנטריפוגה חדשים.
3. העשרת שברי EV באמצעות חלקיקי חלקיקים
- ליצור 30% שאיפה של חלקיקים באמצעות כמויות שוות של NT80, NT82, ו-1x PBS.
הערה: התערובת צריכה להיות מורתחת לפני השימוש כדי להבטיח הומוגניות. - הוסף 30 μL של שפופרת כל מיקרוצנטריפוגה מכיל את שברי הצפיפות ואת הפיפטה/להפוך אותם מספר פעמים כדי לערבב.
- לסובב את EV-העשיר ננו-חלקיק-המכיל צפיפות שבריר מיקרוצנטריפוגה צינורות O/N ב 4 ° c על כ 20 סל ד.
- דחיסות צנטריפוגה שבר מיקרוצנטריפוגה צינורות ב 20,000 x g עבור 5 דקות ב-RT.
- להשליך את הנוזל ולשטוף את הגלולה EV פעמיים עם 1x PBS.
הערה: ננו-חלקיק כדורי יכול להיות קפוא ב-20 ° c או בשימוש מיידי עבור שונים במורד הזרם (כלומר, ה-PCR, הכתם המערבי, ספקטרומטר המסה, ושאר מוסר).
4. מומלץ הכנה של ננו-חלקיק גלולה עבור במורד הזרם Assays
-
עבור בידוד RNA
- השהה מחדש את הגלולה ב-50 μl של מים שטופלו באמצעות 0.001% דיאתיל (depc) מסוננים באמצעות מסנן של 0.2 יקרומטר ובודד RNA בהתאם לפרוטוקול של יצרן הערכה.
-
אלקטרופורזה בג
- השהה מחדש את הגלולה ישירות בתוך 15 μL של מאגר Laemmli.
- חום לדוגמה 3x ב 95 ° c עבור 3 דקות. מערבולת בעדינות ומסובבת בין כל מחזור חום.
- מדגם צנטריפוגה עבור 15 s ב 20,000 x g ו לטעון את כל החומר החומק ישירות על ג'ל.
הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הגבל את כמות החלקיקים הנטענים אל הג והפעל את הג ב-100 V כדי להבטיח שהחלקיקים הנותרים יהיו כלולים בבארות.
-
עבור טריפסין העיכול
- השהה מחדש את הגלולה ב -20 μL של אוריאה לפני אלקיללציה וטריסיזציה של המדגם. חלקיקים יכולים להיות מטרים על ידי 14,000 x g צנטריפוגה ב RT עבור 10 דקות. המדגם המכיל את פפטיד טריסינטזציה ניתן להעביר לתוך צינור איסוף נקי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פג המשקעים מגדילה את תשואה EV
הגישה המשולבת שלנו לבידוד EV הוא יעיל יותר באופן משמעותי במונחים של התאוששות EV לעומת המסורתית ultracentהתחברות, כפי שניכר על ידי 90% צמצום הנפח של הפעלת חומר נדרש. עם זאת, התקן הזהב הנוכחי ב EV בידוד, דורש כ 100 mL של התרבות supernatant לייצר EV הכנה נאותה עבור במורד הזרם, בעוד פרוטוקול הרומן שלנו דורש רק 10 מ ל. הפחתה זו מתאפשרת באמצעות השימוש של המשקעים יתד EV מגיב אשר מספק עלייה משמעותית תשואה EV כפי שנמדד על ידי ניתוח ננו מעקב (נ. ת. ע). התוצאות באיור 2A, אשר פורסמו בעבר6, לציין כי בעת שימוש ב-10 מ ל של תרבות המשקעים משקעים מEVs הביא להחלמה של 7.27 x 1010 , אשר היה כ 500 מתקפל יותר מאשר מספר של EVs התאושש מאותו חומר התחלתי באמצעות הארכה (1.45 x 108). יעילות מוגברת של הבידוד של אקסוזומים, תת סוג מסוים של EV, נצפתה גם בולט על ידי רמות מוגברת של היטב מאופיין מסמן חלבונים, CD81, CD63, ו CD9. ניתוח כתמי מערבי השוואת ev שיטת ' המיוצר מהפוגות או משקעים ev באמצעות משקעים יתד משקע מוצג באיור 2b. תוצאות אלה מציגות גידול 3,000 מתקפל ב-CD81, עלייה של 4 מקפלים ב CD63, ועלייה 40 מקפלים ב CD9 כפי שנמדד על ידי ניתוח densi try. יחד, התוצאות האלה מרמזות על כך שהפרוטוקול המוקף לא רק מגדיל את התשואה הכוללת של EV, אלא גם מגביר את ההתאוששות של האקסוזומים בהשוואה להפוגות.
אפיון EVs והפרדה של EVs הרחק מ-HIV 1 וירוס
על מנת לאפיין את השלפוחית השתן בכל שבר בעקבות הננו-חלקיק העשרה, EVs מבודדים מ-"צ'ם נגוע" או ה-HIV-1 הנגועים בתרבות התאית המותווה באמצעות פרוטוקול מחולק לאבן ומאופיין באבן מערבית של כל שבר יודיקסרול מועשר בננו-חלקיק. הנתונים באיור 3A מראים את התוצאות שפורסמו בעבר, אשר מדגימות את הנוכחות או העדר של שלוש הטCD81 האקזומנים (מCD63, וCD9) בכל שבר (תאי צ'ם; הלוח העליון). התוצאות מצביעות על כך, האקסוזומים, כפי שהוגדר על ידי נוכחות של כל שלושת הטטרשות בתוך השבר, נמצאים בשלוש אוכלוסיות נפרדות: Exo #1 הכולל שברים 10.8-12.0, Exo #2 הכולל שברים 15.6-27.0, ו Exo 3 הכולל רק את השבר 18.0. למרות נוכחותם של שלוש אוכלוסיות נפרדות, הפרוטוקול אינו יכול לשלול את האפשרות של נוכחות של סוגים נוספים של EVs בתוך כל שבר. יתר על כן, תוצאות אלה לא לגמרי לכלול את האפשרות כי יש שלפוחיות באוכלוסיות אלה, כי הם חיוביים עבור שילוב של הטטרספאז נבדק סמנים. EVs אלה ניתן להפריד עוד יותר על ידי אסטרטגיות טיהור נוספות.
השדה המתפתח במהירות של EV/אקסוכמה המחקר התפוצץ מאז התגלית שלהם והביא פונקציות מחדש רבים ויישומים עבור אלה שלפוחיות. בפרט, תפקידם כמו שליחים תאיים בפיזיולוגיה לא רק נורמלי אלא גם במחלה הובילה לשימוש של משאבים משמעותיים כדי לנתח את ההשפעות ואת השירות של שלפוחיות ושלפוחית, במיוחד אקסוזומים, על תאים לנמען16 , מיכל בן 17 , 18. מחקרים רבים יש מעורב EVs בפתוגנזה של מגוון זיהומים, כולל HIV-16,10,12,19,20,21 , 22. עם זאת, מידת הדמיון בין EVs לבין הריטונים מהווה מכשול פוטנציאלי בהגדרת מנגנוני EV-תיווך אלה. כדי לטפל בדאגה זו, עיצבנו את הפרוטוקול שלנו ליישום מעבר הדרגתי כדי להפריד באופן יעיל אוכלוסיות EV מהרימונים. לשם כך, התרבות התאית supernatant מ-HIV 1 תאים נגועים היו חשופים פרוטוקול הציג ונותחו על ידי הכתם המערבי לנוכחות של HIV-1 מחסום p24 כדי לקבוע איזה שבר או שברים הכיל HIV-1 הריסונים. התוצאות המוצגות באיור 3A (הפאנל האמצעי) מראות את הלוקליזציה של p24 בשלושה תנאים עצמאיים: בהעדר הסליל, בנוכחות הסליל (פורבול 12-myristate 13-אצטט; PMA), ובנוכחות PMA וטיפול תרופתי שילוב (עגלה), הטיפול הסטנדרטי עבור HIV-1. נתונים אלה מצביעים על כך נגיף ה-HIV-1 הוא מותאם לשבר 16.8 כפי שנמדד על ידי נוכחות של p24 ו polyprotein Pr55 שלה ללא ביקכה. יתר על כן, כאשר התאים חשופים לסל, הכולל Indinavir, מעכב פרוטאז אשר מונע את המחשוף של Pr55 כדי p24, p24 לא זוהה בכל שבר. במקום זאת, רק Pr55 זוהה והיה נוכח בשברים 16.8-28.9, המציין משמרת של וירוס לתוך שברים צפופים יותר. תוצאות דומות הושגו באמצעות מקרופאגים ראשיים (פאנל תחתון). למרות הפרוטוקול המתואר התוצאות משקעי שיתוף של Exo #2 ו Exo #3 אוכלוסיות עם וירוס, האוכלוסיה #1 Exo (שברים 10.8-12.0) נשאר וירוס ללא וירוסים, המאפשר עבור במורד הזרם המורד של זיהום וירוסים.
סוג זה של הפרדת וירוס הרחק EVs מאפשר לנו לטפל באפשרות של פיסות וירוס הזנת EVs או להיות מופרש מתאים נגועים כמו חלבון חופשי. תוצאות באיור 3B מצביעים על כך HIV-1 Nef חלבון ניתן למצוא את האוכלוסיה #1 exo בנוסף #2 exo ו-exo #3 אוכלוסיות. Nef מופיע גם בחלק 6.0, המציין כי Nef יכול להיות מופרש מתאים נגועים כמו חלבון חופשי בתוך EV. בנוסף, חלבון HIV-1 Vpr נמצא השבר 6.0 בעוד HIV-1 תאת החלבון הוא נמצא בעיקר בשבר 6.0, אבל גם מופיע בשברים 7.2-9.6. אנחנו כרגע בודקים את כל השברים לנוכחות של תאת החלבון על ידי אליסה. תוצאות אלה מצביעות על כך גם תאת וגם Vpr יכול להיות מופרש מתאים נגועים, כנראה כמו חלבונים בחינם, בעוד תאת יכולה גם להיות משולבים EVs. באופן קולקטיבי, נתונים אלה מצביעים על כך שהשיטה שלנו של בידוד EV יכול בהצלחה לבודד אקסוזומים (Exo #1) משם HIV-1 הרימונים (Exo #2 ו#3) וכי EVs מן התאים hiv-1 נגוע מכילים כמה חלבונים מסוג HIV-1, אשר עשויים להשפיע על HIV-1 פתוגנזה.
אפיון EVs והפרדה של EVs הרחק מווירוסים אחרים
כדי להחיל פרוטוקול זה על מודלים אחרים של זיהום נגיפי, אנו מאופיינים שלפוחיות מתאים נגועים בווירוסים שונים מספר. איור 3C מציג איור של שלפוחית העין והפצות וירוסים שהתקבלו בעבר בעקבות משקעים, הפרדה והעשרה בהתאם לפרוטוקול המתואר. כפי שהוצג בעבר באיור 3A, אקזומים (CD9+CD63+CD81+) קיימים בשלוש אוכלוסיות שונות (exo #1, שברים 10.8-12.0; Exo #2, שברים 15.6-27.0, ו Exo 3, 18.0 השבר) ו-HIV-1 וירוס לוקליזציה לצפיפות גבוהה יותר 16.8 ו 18.0 שברים (נתיבים 10-11). לא באופן מפתיע, כאשר החלת פרוטוקול זה כדי לאפיין EVs שוחרר מן האדם T-lymphotropic וירוס סוג 1 (HTLV-1), רטרו כי ידוע לגרום לסרטן אצל מבוגרים, הבחנו תוצאות דומות לזה של HIV-1 הקשורים EVs. הפאנל השלישי תאנה. 3C מראה כי וירוס htlv -1 היה בעיקר מקומי לשבר בצפיפות הגבוהה ביותר (18.0) ו, במידה פחותה, שברים 13.2-27.0 כפי שמעידים על ידי נוכחות של חלבון מטריצה 1 htlv (p19). יתר על כן, בעבר גילינו כי htlv-1 הפעלת חלבון, מס, אשר נעדר מתוך htlv-1 virion, קיים בתוך אקסוזומים שוחרר מ htlv-1 תאים נגועים15,23. הנתונים באיור 3C מראים כי המס היה נוכח בשברים בצפיפות נמוכה יותר (6.0-12.0), שניים מהם הצגנו להכיל אקזומים (10.8 ו 12.0).
בשלב הבא, בדקנו את פרוטוקול הבידוד בהקשר של וירוסים גדולים יותר וקטנים יותר כגון נגיף האבולה (ebov) ו-zika וירוס (zika), בהתאמה, כמו HIV-1 ו-htlv-1 הרימונים הם שניהם רטרווירוסים ודומה מאוד בקוטר. שימוש ב-vip כתחליף ביולוגי מחליף ברמה 2 (bsl-2) מודל של הרכבת ebov ויציאה, מצאנו כי ה-vip, שהוא כ 1 יקרומטר באורך, מניח את השבר בצפיפות הגבוהה ביותר (18.0) בהעדר של 0.22 יקרומטר סינון (הפאנל האמצעי, איור 3c). יתר על כן, כאשר VP40, חלבון מטריקס EBOV מתבטא ברמות גבוהות, הוא מופרש מתא באמצעות כמה מנגנונים שונים וכתוצאה מכך נוכחות של VP40 בכל שבר צפיפות, כולל אלה האקסוזומים מותאמים לשפות13 , 14. לעומת זאת, הרימונים zikv קטנים באופן משמעותי מאשר HIV-1 הרימונים, מדידת כ 40 ננומטר בקוטר. התרשים המייצג בפאנל התחתון של איור 3C מראה את הנוכחות של הרימונים zikv בצפיפות נמוכה (6.0-8.4) וצפיפות גבוהה (15.6-28.9) שברים, מציע נוכחות של וירוס בחינם ו-EV וירוס, בהתאמה.
איור 1: בנייה של צפיפות יודיקסנול מעבר צבע. (א) כמויות יחסיות של יודיאקיול ו-PBS מנוצל כדי ליצור כל שבר צפיפות (שבר). השבר מציין את אחוז יודיאקיול הכלול בכל שבר. הצפיפות היחסית והמיקום שלהם במעבר הצבע מתוארים מרוב כבד להקל. (ב) הצבת שברי הצפיפות (6.0-18) ב ultracentrifuge tube מוצג (צד שמאל), כמו גם את המיקום של שלוש אוכלוסיות EV (exo #1, exo #2, exo #3), שלפוחיות כמו exo, ומכלולי חלבון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: יתד משקעים הכימית מגביר תשואה EV. (א) כדי להשוות התאוששות EV, EVs היו מבודדים 5 d HIV-1 נגוע מונוציט (U1) תרבות supernatant (10 מ ל) באמצעות המסורתי המסורתית (100,000 x g) או יתד משקעים מגיב (דגירה ביחס 1:1). EVs משני הליכי העשרה נותחו באמצעות ניתוח nanotracking עקב כדי להעריך את הריכוז EV כתוצאה כמתואר DeMarino רינו, ואח '6. נ. ת. ע נמדד ב -11 משרות עצמאיות בטרילקאט טכני. הסורגים הכחולים מייצגים ממוצע של מדידות 33 ± ש גויטיין משמעות סטטיסטית נקבע באמצעות מבחן tדו-זנבית של סטודנט; p < 0.001. ב. EVs מתוך 5 ימים של תרבות צ'ם באמצעות משקעים (UC) או המשקעים באמצעות הפרדה בצפיפות יודיקסנול. הקשר בוצע באמצעות 100 mL של התרבות סופרנאטאנט (ליין 1) בעוד יתד משקעים ומשבר יודיקסרול בעקבות בוצע באמצעות 10 מ ל של התרבות supernatant (ליין 2). גלולה EV סה כ שהתקבלו מתוך הפרדה ושבריר 10.8 מ יתד/יודיקסנול ההפרדה נותחו על ידי אבן החשופה המערבי לנוכחות של חלבונים הסמן אקסוזומבית (CD81, CD63, ו CD9) עם Actin כפקד. עבור בהירות, מסלולים נבחרים מאותו אבן חשופה עם חשיפות זהות מוצגים בלוח B. דמות זו השתנתה מתוך DeMarino רינו, ואח '.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: בידוד של EVs מן וירוסים. (א) התרבות של חמישה ימים על ידי מתאי צ'ם לא נגוע (הפאנל העליון), HIV-1 (Ba-L; מע: 0.01) הנגועים תאים U1 (± PMA ו ± עגלה טיפול; הלוח האמצעי) או HIV-1 נגועים מקרופאגים ראשוניים (הפאנל התחתון) היו מודבטים עם יתד משקעים מגיב ב 4 ° c בלילה. EVs הופרדו לשברים באמצעות מעבר הדרגתי של צפיפות יודיקסנול. EVs מכל השברים העשירו באמצעות NT80/82 חלקיקים בין לילה ב -4 ° c. Nanopellets ם נותחו באמצעות אבן החשופה המערבית לנוכחות חלבונים בעלי מרקר אקזומלי CD81, CD63 וCD9. U1 (± PMA ו ± עגלה טיפול) ו-HIV-1 מקרופאגים הראשי הנגועים נותחו לנוכחות של HIV-1 מחסום חלבון (p24 ו Pr55; ביקע וביטול HIV-1 מחסום polyprotein, בהתאמה), כמו גם CD63. . בלוטים השתלטו על האקטין כשליטה מספר אוכלוסיות אמת (CD81+CD63+CD9+) מתוארות באדום. דמות זו השתנתה מ DeMarino רינו, ואח '6 (ב) התרבות חמישה ימים של סופר מתאי U1 נגועים היו מודלטים עם משקעים יתד מגיב ב 4 ° c בלילה. EVs הופרדו לשברים באמצעות מעבר הדרגתי של צפיפות יודיקסנול. EVs מכל השברים העשירו באמצעות NT80/82 חלקיקים בין לילה ב -4 ° c. שברים היו לרוץ על אבן חשופה מערבית לנוכחות של HIV-1 Nef, Vpr, ו-תאת. . אקטין שימש כשליטה מספר האוכלוסיות האמיתיות (CD81+CD63+CD9+) מתוארות באדום כפי שהוגדר בעבר ב-demarino רינו, ואח '6 (ג) ייצוג של פרופילי הפרדה שאפיינו בעבר מארבעה וירוסים שונים: HIV-1, HTLV-1, EBOV, ו-ZIKV. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תהליך העבודה של פרוטוקול. זרימת העבודה הרומן משלבת מספר טכניקות כולל סינון, EV משקעים באמצעות משקעים יתד משקע, בצפיפות יודיקסיול הפרדה, ו ננו-חלקיק העשרה של EVs. הניצול של פרוטוקול זה מפריד EVs מווירוסים שונים ומספק דגימת נפח קטן עבור במורד הזרם כולל qpcr, כתם המערבי, ספקטרומטר המסה, רצפי RNA, ניתוח ציטוקין, אליסה, ו-cell מבוססי בחני. דמות זו השתנתה מתוך DeMarino רינו, ואח '.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המותווה מאפשרת תשואה EV משופרת והפרדת הווירוס מ-EVs באמצעות גישה משולבת לבידוד. כמויות גדולות יחסית של חומרי התחלה (כלומר, תא supernatant) ניתן לסנן לפני EV בידוד על ידי משקעים, הפרדת DG, ו ננו-חלקיק העשרה, וכתוצאה מכך הנפח הסופי של ~ 30 μL, המאפשר שימוש מיידי במגוון של במורד הזרם השימוש בהעשרה ננו-חלקיק הוא חיוני בהשוואה להפוגות מסורתיות, חלקיקים אלה העשירים ביותר הוכחו ללכוד באופן יעיל יותר, מניב גדול או שווה לסכום של שלפוחיות מ-1 מ ל של תרבות סופר-ננטי בהשוואה ל -10 מ ל של התרבות הסופרנטית היוונית15. בסך הכל, הפרוטוקול המתואר כולל את השילוב של כמה טכניקות ידועות ולכן צריך להציג קשיים מוגבלים. עם זאת, שילוב של חלקיקים EV-מעשיר מציג טכניקה חדשה אשר יכול לדרוש פתרון בעיות ו/או שינויים כדי להשיג תוצאות רצויות בהתאם לצורך במטה הזרם או היעד הביולוגי של עניין. אנו ממליצים כי חלקיקים להיות מודנים עם מסוננים תרבות התא supernatants לילה. אם חלבון היעד או ה-RNA של הריבית הוא של שפע נמוך במערכת המודל, הפרוטוקול יכול להיות מותאם כדי להגדיל את תקופת הדגירה כדי להבטיח לכידת היעד. ניצול של חלקיקים במורד במורד הזרם יכול להתבצע בדרך כלל על ידי השעיית הגלולה במאגר לדוגמה הרצוי עבור כל שיטת. לדוגמה, ניתן להשעות מחדש את החלקיקים ישירות במאגר Laemmli לניתוח כתמי אבן מערבית. חומר שנתפסו צריך להיות לאחר מכן ביעילות יותר שופרשים מן חלקיקי חלקיקים ב-SDS באמצעות חימום ומחזורי vortexing. כדי להשיג הפרדה נאותה של חלבון, טיפול יש לנקוט כדי להגביל את כמות חלקיקי חלקיקים נטען לתוך הג, ואת הג צריך להיות מופעל על כ 100 V כדי להבטיח את כל החלקיקים הנותרים כלולים בבארות. יתר על כן, עבור ויזואליזציה של חלבונים משקל מולקולרי נמוך, העברה רטובה לילה משיגה תוצאות אופטימליות. למרות שהשימוש בחלקיקים מביא להעשרה משמעותית של אוכלוסיות שלפוחית, יש לקחת צעדים נוספים לחומר שנלכד מתוך החלקיקים. יתר על כן, הימנעות החומר יכול להגביל את כלי השירות של EVs ב בחני פונקציונלי במורד הזרם כמו מאגרי הימנעות רבים יכולים לפגוע בשלמות של קרום EV. מחקר נוסף נדרש כדי להנדס אסטרטגיה כדי לאפשר הסרת שלפוחיות שלמות מן חלקיקי חלקיקים לאחר הדגירה. חיסרון נוסף של חלקיקים אלה הוא חוסר האפיון הנוכחי. המעטפת החיצונית של החלקיקים תוכננה להוציא מולקולות גבוהות במשקל מולקולרי. עם זאת, מיקוד ספציפי של החלקיקים כדי EVs אינו מתרחש, וכתוצאה מכך גורמים מייסדים רבים ואותות רקע יכול להיות נוכח במורד הזרם.
השיטה המתוארת משמשת בעיקר למטרות מעבדה. פיתחנו לאחרונה שיטות חלופיות כדי להרחיב את היכולות של הגישה המשולבת שלנו לטכניקות נוספות עבור בידוד EVs מ בקנה מידה קטן, ביולואידים החולה כגון פלזמה ו-שדרתי ו בקנה מידה גדול, מסחרי הייצור EV. עבור בידוד של EVs הרחק וירוס בחומר החולה יש לנו שילב את השימוש בגודל כרומטוגרפיה הדרה (SEC) עמודות, אשר מנוצלים במקום צפיפות הדרגתי. עמודות אלה מועילות בכך שהם חד פעמיות ולכן הם אידיאליים במעבדות לבלימה גבוהה. עם זאת, עמודות SEC נפרדות חלקיקים בהתאם לגודל, ולכן, מאחר שסוג זה של הפרדה הוא ישים רק עבור הפרדה של וירוסים גדולים או קטנים מאוד, כגון ebov (~ 1 μm) או zikv (~ 40 nm), בהתאמה, מ EVs או הפרדה הרחק מ חלבון חופשי. במונחים של ייצור EV בקנה מידה גדול, הפיתוחים האחרונים בשיטות מבוססות סינון, כלומר סינון זרימה (TFF), הורשו לבידוד יעיל של EVs מתוך כרכים לדוגמה גדול. Tff היסטורית שימש לטיהור של nanosized בגודל, כולל וירוסים, ובאמצעות אופטימיזציה של פרוטוקולים מערכת זו בהצלחה הותאם לבידוד של EVs24,25. בקצרה, במהלך תהליך TFF, נוזל המדגם זורם בצורה מלאה על פני השטח של קרום חדיר למחצה אשר באופן סלקטיבי שומר על השלפוחיות על בסיס גודל ומשקל מולקולרי, ובכך מאפשר הפרדת EVs הרחק חלבונים חינם ואחרים זיהום biomolecules26. כאשר לעומת זאת, הוא דיווח כי TFF תוצאות תשואה גבוהה יותר, מצבור פחות, ומפחית את ההבדלים הרבה-הרבה של EVs27. בנוסף, השימוש TFF לצורך הייצור הטוב (GMP)-כיתה בידוד של EVs עבור היישום הטיפולי דווח גם28. בשל המדרגיות והיכולת שלה, טכנולוגיה זו מציעה פוטנציאל גדול למחקר EV עתידי.
וירוסים מגיעים בגדלים שונים וצפיפויות, ולכן בהתאם לווירוס המדובר, אופטימיזציה של פרוטוקול זה עשוי להידרש. עבור וירוסים גדולים מאוד כגון האבולה (~ 1 יקרומטר או גדול יותר באורך), סינון פשוט יכול להיות מנוצל כדי להסיר את הרוב המכריע של הריסונים וגופים מזהם גדול כגון הגופים אחמי ם ו אפוטוטיק14. זה מאפשר את רוב ההפרדה של וירוס הרחק EVs להיות הפעלה בקצה הקדמי של טיהור. עם זאת, במקרה של וירוסים קטנים יותר כגון מעיים (~ 30 ננומטר), וירוס zika (~ 40 nm), צהבת B וירוס (~ 42 nm), וירוס הפטיטיס C (~ 55 nm), ואחרים, את השבר שבו משקע הרימונים יהיה צורך להיקבע לפני המטה תפקודית פונקציונלי ניתוחים. אי אפשר תמיד להעריך את החלק הסביר של משקעי השבר בהתבסס על קוטר החלקיקים בלבד. לדוגמה, פוליאווירוס, שהוא 30 ננומטר בקוטר, ידוע גם שהוא כושל ב הפרשה האוטומטית29,30,31,32,33, ולכן סביר להניח שנמצא על הצד הימני של מעבר הצבע (שברים צפופים יותר) ולא לשמאל (שברים צפופים פחות). בעוד יש לנו אופטימיזציה פרוטוקול זה במקרה של HIV-1, HTLV-1, ו-EBOV אחמי ם, וירוסים נוספים יצטרכו אפיון כדי לכוונן את הפרוטוקול עבור טיהור ספציפי שלהם הרחק EVs.
הפרוטוקול המתואר כאן (איור 4) מאפשר, בפעם הראשונה, את המשתמש להפריד EVs מן וירוס עם יעילות משופרת וכמויות קטנות יותר של חומר מתחיל לעומת התקן זהב של EV בידוד, התקדמות. שיטה זו ניתן להתאים בקלות לתנאים בהישג יד, כולל גדלים שונים לדוגמה, התשואות הנדרשות, מסוג החומר ההתחלתי (כלומר, התרבות הסופר לעומת החולה החומר), ווירוסים שונים בגדלים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.L. מזוהה עם קרס ננומדעים inc. המייצרת ריאגנטים ו/או מכשירים המשמשים במאמר זה. כל הסופרים האחרים לא מצהירים על קונפליקטים פוטנציאליים בעניין.
Acknowledgments
אנחנו רוצים להודות לכל חברי מעבדת Kashanchi, במיוחד גוון קוקס. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענקים (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894, ו NS099029 ל סיר f סאוויני).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CEM CD4+ Cells | NIH AIDS Reagent Program | 117 | CEM |
| DPBS without Ca and Mg (1x) | Quality Biological | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG precipitation reagent |
| Exosome-Depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
| Fetal Bovine Serum | Peak Serum | PS-FB3 | Serum |
| HIV-1 infected U937 Cells | NIH AIDS Reagent Program | 165 | U1 |
| Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
| Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
| Optima XE-980 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
- Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
- DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
- Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).
- Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
- Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).
- Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).
- Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
- Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542 (2017).
- Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
- Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).
- Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
- Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
- McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
- Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, Clifton, N.J. 33-41 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).
- Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).
- Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
- Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
- Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).
- Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).
