Summary
Questo protocollo isola le vesciche extracellulari (EV) lontano dai virioni con elevata efficienza e resa incorporando precipitazioni EV, ultracentrifugazione del gradiente di densità e cattura di particelle per consentire un flusso di lavoro semplificato e una riduzione dell'avvio volume, con conseguente preparazione riproducibile per l'uso in tutte le ricerche EV.
Abstract
Uno dei principali ostacoli nel campo della ricerca sulla vescicolo extracellulare (EV) oggi è la capacità di ottenere preparati EV purificati in un ambiente di infezione virale. Il metodo presentato ha lo scopo di isolare i VE lontano dai virioni (cioè L'HIV-1), consentendo una maggiore efficienza e resa rispetto ai metodi di ultracentrifugazione convenzionali. Il nostro protocollo contiene tre passaggi: precipitazione EV, separazione del gradiente di densità e cattura delle particelle. I saggi a valle (ad esempio, western blot e PCR) possono essere eseguiti direttamente dopo la cattura delle particelle. Questo metodo è vantaggioso rispetto ad altri metodi di isolamento (ad esempio, ultracentrifugation) in quanto consente l'uso di volumi di partenza minimi. Inoltre, è più facile da usare rispetto ai metodi alternativi di isolamento EV che richiedono più passaggi di ultracentrifugation. Tuttavia, il metodo presentato è limitato nella sua portata di saggi EV funzionali in quanto è difficile elusioni esitari dalle nostre particelle. Inoltre, questo metodo è adattato a un ambiente strettamente basato sulla ricerca e non sarebbe commercialmente fattibile.
Introduction
La ricerca incentrata sulle vescicle extracellulari (EV), in particolare gli esosomi, un tipo di Veicoli che vanno 30-120 nm e caratterizzato dalla presenza di tre marcatori tetraspanina CD81, CD9 e CD63, è stato in gran parte modellato dallo sviluppo di metodi per isolare e purificare le vesciche di interesse. La capacità di sezionare meccanismi sfaccettati è stata ostacolata a causa di tecniche complesse e dispendiose in termini di tempo che generano campioni composti da una popolazione eterogenea di vescicoli generati attraverso percorsi diversi con una vasta gamma di contenuti, dimensioni e Densità. Anche se questo è un problema per quasi tutte le ricerche EV, è di particolare importanza quando si studiano i vesc nel contesto dell'infezione virale, poiché i virioni e le particelle simili a virus (VLP) possono avere un diametro simile a quello delle vesciche di interesse. Ad esempio, il virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) ha un diametro di circa 100 nm, che ha all'incirca le stesse dimensioni di molti tipi di veicoli elettrici. Per questo motivo, abbiamo progettato un nuovo flusso di lavoro di isolamento EV per risolvere questi problemi.
L'attuale gold standard di isolamento EV è l'ultracentrifugazione. Questa tecnica si avvale delle varie densità vescicolari, che permettono alle vescicoli di essere separate dalla centrifugazione differenziale con sedimentazione differenziale di particelle ad alta densità rispetto a particelle a densità inferiore in ogni fase 1,2. Sono necessari diversi gradini di centrifugazione a bassa velocità per rimuovere le cellule intatte (300-400 x g per 10 min), i detriti cellulari (2.000 x g per 10 minuti) e i corpi apoptotici e le grandi vesciche (10.000 x g per 10 min). Queste purificazioni iniziali sono seguite da ultracentrifugazione ad alta velocità (100,000-200,000 x g per 1,5-2 h) per sedimentare EV. Vengono eseguite fasi di lavaggio per garantire ulteriormente la purezza dei veicoli elettrici, tuttavia, ciò comporta la riduzione del numero di VE isolate, riducendo così la resa totale 3,4. L'utilità di questo metodo è ulteriormente limitata dal requisito di un gran numero di celle (circa 1 x 108) e un grande volume di campionamento (> 100 mL) per ottenere risultati adeguati.
Per affrontare le crescenti preoccupazioni, la precipitazione delle vescicole con polimeri idrofili è diventata una tecnica utile negli ultimi anni. Il glicole in polietilene (PEG), o altri reagenti di precipitazioni correlati, consente all'utente di abbattere le vescicole, i virus e gli aggregati proteina o proteina-RNA all'interno di un campione semplicemente incubando il campione con il reagente di scelta, seguito da un singolo centrifugazione1,2,5. Abbiamo già riferito che l'uso di PEG o metodi correlati per precipitare EV rispetto ai tradizionali risultati di ultracentrifugazione in un rendimento significativamente più alto6. Questa strategia è veloce, facile, non richiede ulteriori attrezzature costose, è prontamente scalabile e mantiene la struttura EV. Tuttavia, a causa della natura promiscua di questo metodo, i campioni risultanti contengono una varietà di prodotti tra cui proteine libere, complessi proteici, una gamma di EV e virioni che richiedono quindi un'ulteriore purificazione per ottenere la popolazione desiderata1 ,2,7,8.
Per superare l'eterogeneità dei VE ottenuti da vari metodi di precipitazione, l'ultracentrifugazione del gradiente di densità (DG) viene utilizzata per separare meglio le particelle in base alla loro densità. Questo metodo viene eseguito utilizzando un gradiente stepwise utilizzando un mezzo di gradiente di densità, come iodixanol o saccarosio, che consente la separazione degli EV da proteine, complessi proteici e particelle di virus o virus (VLP). È importante notare che, mentre una volta si pensava che la DG consentisse una separazione più precisa delle sottopopolazioni EV, è ormai noto che le dimensioni e le densità delle varie vesciche possono sovrapporsi. Ad esempio, gli esosomi sono noti per avere densità di galleggiamento di 1,08-1,22 g/mL9, mentre le vescicole isolate dal Golgi (COPI ) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticulum endoplasmico (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticulum degli endoplasmici (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticolo endoplasmico (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticolo endoplasmico (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticolo endoplasmico (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticolo endoplasmico (COPII) ) sedimento a 1,18-1,25 g/mL1,2,3,4,9. Inoltre, se si desidera confrontare le frazioni esosomiche con le frazioni contenenti particelle virali, questo può diventare più difficile a seconda della densità del virus di interesse, ci sono virus diversi dall'HIV-1 che probabilmente equilibrato allo stesso densità come frazioni positive esosomiche2.
Infine, l'arricchimento dei presupposti EV per la visualizzazione a valle e i saggi funzionali è fondamentale per la ricerca EV. L'uso di nanoparticelle che arricchiscono EV, in particolare, particelle di idrogel multifunzionali di 700-800 nm di diametro, sono un passo fondamentale per raggiungere prep EV concentrate. Possiedono un'esca aromatica ad alta affinità che incapsulata da un guscio di setaccio esterno poroso per promuovere la selettività. Le nanoparticelle utilizzate in questo studio includono due distinti preparati con esche di base diverse (Reactive Red 120 NT80; e Cibacron Blue F3GA NT82) che hanno dimostrato di aumentare la cattura dei veli da vari reagenti e biofluidi (vedi la Tabella dei Materiali )6,10,11,12,13,14,15. Le particelle offrono un facile arricchimento degli EV da numerosi materiali di partenza, tra cui frazioni di iodixanolo, colture cellulari supernatali, nonché biofluidi pazienti come plasma, siero, fluidi spinali cerebrali (CSF) e urina6,13 .
Il metodo qui presentato migliora l'efficienza delle attuali tecniche di purificazione dei videoimpres con diverse tecnologie; Precipitazione EV, ultracentrifugazione del gradiente di densità e cattura di particelle, per semplificare il flusso di lavoro, ridurre i requisiti di campionamento e aumentare la resa per ottenere un campione EV più omogeneo da utilizzare in tutte le ricerche EV. Questo metodo è particolarmente utile nello studio dei veicoli elettrici e del loro contenuto durante l'infezione virale in quanto include un passaggio di filtrazione di 0,22 m per escludere le vesciche e i VLP di grandi dimensioni e indesiderati e la separazione della popolazione totale di Veicoli leggeri in base alla densità per isolare i veicoli elettrici dai virioni.
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Protocol
1. Filtrazione e precipitazione delle vescibole extracellulari (EV)
- Per preparare il supernatante di coltura da cellule infette o transfected (cioè linee cellulari e/o cellule primarie), coltura circa 10 mL di cellule a ritardo di sangue per 5 giorni a 37 c e 5% DI CO2 nel mezzo di coltura appropriato (cioè, RPMI o DMEM con 10% bovini fetali siero [FBS]).
NOT: Tutti i reagenti medi di coltura devono essere privi di veicoli elettrici e possono essere acquistati (vedi Tabella dei materiali)o preparati internamente mediante pre-ultracentrifuga del siero a 100.000 x g per 90 min. Questo protocollo ha avuto successo per diverse linee cellulari di uso comune, tra cui: CEM, Jurkat, 293T, U937 (linee non infette), U1, J1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (linee infette HIV-1 e HTLV-1), più cellule trafette e cellule mieloidi primarie e T (entrambe le cellule infette di HIV-1 e HTLV-1), più cellule trascurate e cellule mieloiprimarie e T (entrambe infetti e non infetti); tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato per qualsiasi tipo di cella, inclusi quelli che richiedono condizioni multimediali o di impostazioni cultura specializzate. Potrebbe essere necessario ottimizzare la densità delle cellule per diversi tipi di cellule. Si raccomanda di utilizzare la densità più alta con la morte minima delle cellule dopo 5 giorni. - Centrifugare la coltura a 3.000 x g per 5 min a cellule pellet e scartare il pellet.
- Filtrare il supernatante di coltura utilizzando un filtro sterile 0,22 m e raccogliere filtrate in un tubo pulito.
- Aggiungere lo stesso volume del reagente di precipitazione PEG (rapporto 1:1) al supernatante filtrato. Invertire il tubo più volte per garantire una miscela omogenea.
NOT: NON vortice. - Incubare la miscela a 4 gradi durante la notte (O/N).
- Centrifuga a 1.500 x g per 30 min a temperatura ambiente (RT) per produrre un pellet EV eterogeneo.
NOT: Il pellet EV dovrebbe apparire di colore bianco o bianco sporco. - Scartare il supernatante della cultura impoverita di EV.
- Risospendere il pellet EV in 150-300 .
2. Costruzione di un gradiente di densità
- Mescolare il mezzo di gradiente di densità iodixanol con 1x PBS per creare 11 diverse frazioni di densità di 1 mL da 6 a 18% di iodixanol in incrementi dell'1,2% in tubi di microcentrifuga separati come mostrato nella Figura 1A.
- Vorticare ogni tubo per mescolare.
- Frazioni di densità dello strato in un tubo di ultracentrifuga a secchi e pre-pulito a partire a partire da #18 frazione e terminando con #6 di frazione come indicato nella Figura 1B.
NOT: Tutti i tubi devono essere sanificati utilizzando uno spray candeggina del 10% seguito da seguito dal risciacquo 3 volte con acqua deionizzata e un lavaggio finale di acqua sterile deionizzata prima del caricamento delle frazioni sfumate. - Aggiungere il pellet EV risospeso (300 o L) alla parte superiore del gradiente stratificato nel tubo di ultracentrifuga.
- Ultracentrifuga a 100,00 x g a 4 gradi centigradi per 90 min.
- Rimuovere con attenzione le frazioni di 1 mL dal tubo di ultracentrifuga e trasferire ogni frazione in nuovi tubi di microcentrifuga.
3. Arricchimento delle Frazioni EV uUtilizzo di nanoparticelle
- Creare un liquame del 30% di nanoparticelle utilizzando volumi uguali di NT80, NT82 e 1x PBS.
NOT: La miscela deve essere vortice prima dell'uso per garantire l'omogeneità. - Aggiungere 30 l liquami ad ogni tubo di microcentrifuga contenente le frazioni di densità e pipette/inverter più volte per mescolare.
- Ruotare i tubi di microcentrifuga della frazione di frazione di frazione di frazione di frazione di frazione di pixel che lo o/N a 4 gradi centigradi a circa 20 giri/min.
- Centrifuga densità densità microcentrifuga tubi a 20.000 x g per 5 min a RT.
- Scartare il liquido e lavare il pellet EV due volte con 1x PBS.
NOT: I pellet di nanoparticella possono essere congelati a -20 gradi centigradi o immediatamente utilizzati per vari analisi a valle (ad esempio, PCR, macchie occidentali, spettrometria di massa e altri saggi).
4. Preparazione consigliata di Nanoparticle Pellet per i saggi a valle
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Per l'isolamento dell'RNA
- Risospendere il pellet in 50 gradi di acqua autoclaved deionizzata trattata con 0,001% di pirocarbonato dietieto (DEPC) filtrata attraverso un filtro di 0,2 m e isolare l'RNA secondo il protocollo del produttore del kit.
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Per l'elettroforesi in gel
- Risospendere il pellet direttamente in 15 - L di laemmli tampone.
- Riscaldare il campione 3x a 95 gradi centigradi per 3 min. Vortex delicatamente e girare verso il basso tra ogni ciclo di calore.
- Centrifuga per 15 s a 20.000 x g e caricare tutto il materiale eluito direttamente sul gel.
NOTA: Per ottenere i migliori risultati, limitare la quantità di particelle caricate sul gel ed eseguire il gel a 100 V per garantire che le particelle rimanenti siano contenute nei pozzi.
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Per la digestione della metapsinella
- Risospendere il pellet a 20 o l di urea prima dell'alchilazione e della provadella campione. Le nanoparticelle possono essere pelletate da una centrifugazione di 14.000 x g a RT per 10 min.
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Representative Results
Le precipitazioni PEG aumentano la resa EV
Il nostro approccio combinato all'isolamento EV è significativamente più efficiente in termini di recupero EV rispetto all'ultracentrifugazione tradizionale, come evidente dalla riduzione del 90% del volume di materiale di partenza richiesto. Ultracentrifugation, l'attuale gold standard in isolamento EV, richiede circa 100 mL di coltura supernatant per produrre un'adeguata preparazione EV per i test a valle, mentre il nostro nuovo protocollo richiede solo 10 mL. Questa riduzione è resa possibile dall'uso del reagente di precipitazione PEG EV che fornisce un aumento significativo della resa EV misurata dall'analisi di nanotracking (NTA). I risultati della figura 2A, che sono stati pubblicati in precedenza6, indicano che quando si utilizzano 10 mL di precipitazioni PEG supernatali colture hanno portato al recupero di 7,27 x 1010 EV, che era di circa 500 volte superiore al numero di EV recuperati dallo stesso materiale di partenza utilizzando ultracentrifugazione (1,45 x 108). Una maggiore efficienza dell'isolamento degli esosomi, un sottotipo specifico di EV, è stata osservata anche come evidente dall'aumento dei livelli di proteine marcatore esosomiche ben caratterizzate, CD81, CD63 e CD9. L'analisi delle macchie occidentali che confrontano le prep EV prodotte dall'ultracentrifugazione o dalla precipitazione EV utilizzando un reagente di precipitazione PEG è illustrata nella Figura 2B. Questi risultati mostrano un aumento di 3.000 volte nel CD81, un aumento di 4 volte nel CD63 e un aumento di 40 volte del CD9 misurato dall'analisi della densitometria. Nel loro insieme, questi risultati suggeriscono che il protocollo delineato non solo aumenta la resa totale di EV, ma migliora anche il recupero degli esosomi rispetto all'ultracentrifugazione.
Caratterizzazione dei veicoli elettrici e separazione dei veicoli elettrici dal virus HIV-1
Al fine di caratterizzare le vescicoli presenti in ogni frazione dopo l'arricchimento delle nanoparticelle, i veicoli elettrici sono stati isolati dal CEM non infetto o dall'HIV-1 ha infettato il supernatante della coltura cellulare U1 usando il protocollo delineato e caratterizzato utilizzando la macchia occidentale di ogni frazione di ioxanolo arricchita da nanoparticelle. I dati nella figura 3A mostrano i risultati pubblicati in precedenza che dimostrano la presenza o l'assenza di tre tetraspanine esosomiche (CD81, CD63 e CD9) in ogni frazione (celle CEM; pannello superiore). I risultati indicano che gli esosomi, come definito dalla presenza di tutti e tre i tetraspanini all'interno della frazione, si trovano in tre popolazioni distinte: Exo #1 che include frazioni 10,8-12.0, Exo #2 che include frazioni 15,6-16,8, e Exo solo la frazione 18.0. Nonostante la presenza di tre popolazioni distinte, il protocollo non può escludere la possibilità della presenza di ulteriori tipi di eV all'interno di ogni frazione. Inoltre, questi risultati non escludono definitivamente la possibilità che ci siano vesciche in queste popolazioni che sono positive per una combinazione dei marcatori tetraspanina testati. Questi Veicoli elettrici potrebbero quindi essere ulteriormente separati da ulteriori strategie di purificazione.
Il campo in rapido sviluppo della ricerca EV/exosome è esploso dopo la loro scoperta e ha portato a molte nuove funzioni e applicazioni per queste vesciche. In particolare, il loro ruolo di messaggeri intracellulari nella fisiologia non solo normale, ma anche nella malattia ha portato all'uso di risorse significative per sezionare gli effetti e l'utilità delle vesciche extracellulari, in particolare degli esosomi, sulle cellule riceventi16 , 17 mi lato , 18.Numerosi studi hanno implicato EV nella patogenesi di una varietà di infezioni, tra cui HIV-16,10,12,19,20,21 , 22.Tuttavia, la somiglianza delle dimensioni tra veicoli elettrici e virioni rappresenta un potenziale ostacolo nella definizione di questi meccanismi mediati dal VL. Per affrontare questo problema, abbiamo progettato il nostro protocollo per implementare un gradiente di densità per separare efficacemente le popolazioni di EV dai virioni. A tal fine, la coltura cellulare supernatant proveniente da cellule infette da HIV-1 è stata sottoposta al protocollo presentato e analizzata dalla macchia occidentale per la presenza di HIV-1 Gag p24 per determinare quale frazione o frazione conteneva virioni HIV-1. I risultati mostrati nella Figura 3A (pannello centrale) mostrano la localizzazione di p24 in tre condizioni indipendenti: in assenza di un induttore, in presenza di un induttore (Phorbol 12-myristate 13-acetato; PMA), e in presenza di PMA e combinazione di terapia antiretrovirale (cART), il trattamento standard per HIV-1. Questi dati indicano che il virus HIV-1 è localizzato alla frazione 16,8 misurata dalla presenza di p24 e dalla sua poliproteina zio-apolcata Pr55. Inoltre, quando le cellule sono sottoposte a cART, che include Indinavir, un inibitore della proteasi che impedisce la scissione di Pr55 a p24, non è stato rilevato alcun p24 in nessuna frazione. Invece, solo Pr55 è stato rilevato ed era presente nelle frazioni 16.8-18.0, indicando uno spostamento del virus in frazioni più dense. Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando macrofagi primari (pannello inferiore). Anche se il protocollo descritto si traduce nella co-sedimentazione di Exo #2 e Exo #3 popolazioni con virus, exo #1 popolazione (frazioni 10.8-12.0) è rimasta priva di virus, consentendo analisi a valle prive di contaminazione da virus.
Questo tipo di separazione del virus lontano dai veicoli elettrici ci permette di affrontare la possibilità che i pezzi di virus entrino nei veicoli elettrici o vengano secreti dalle cellule infette come proteine libere. I risultati nella Figura 3B indicano che la proteina Hiv-1 Nef può essere trovata nella popolazione di Exo #1 oltre alla popolazione Exo #2 ed Exo #3. Nef appare anche nella frazione 6.0, indicando che Nef può essere potenzialmente secreto da cellule infette come proteina libera e all'interno di un EV. Inoltre, la proteina HIV-1 Vpr si trova nella frazione 6.0, mentre la proteina Tat HIV-1 si trova prevalentemente nella frazione 6.0, ma appare anche nelle frazioni 7.2-9.6. Attualmente stiamo testando tutte le frazioni per la presenza di proteina Tat da parte di ELISA. Questi risultati indicano che sia Tat che Vpr possono essere secreti da cellule infette, probabilmente come proteine libere, mentre Tat potrebbe anche essere incorporato nei veicoli elettrici. Collettivamente, questi dati indicano che il nostro metodo di isolamento EV può isolare con successo gli esosomi (Exo #1) lontano dai virioni HIV-1 (Exo #2 e #3) e che gli EV delle cellule infette da HIV-1 contengono alcune proteine HIV-1, che possono influenzare la patogenesi dell'HIV-1.
Caratterizzazione dei veicoli elettrici e separazione dei veicoli elettrici lontano da altri virus
Per applicare questo protocollo ad altri modelli di infezione virale, abbiamo caratterizzato vescicoli da cellule infettate da diversi virus diversi. La figura 3C mostra un'illustrazione delle distribuzioni di vesciche e virus ottenute in precedenza in seguito a precipitazioni, separazione e arricchimento secondo il protocollo descritto. Come illustrato in precedenza nella Figura 3A, gli esosomi (CD9,CD63eCD81 ) sono presenti in tre popolazioni diverse (Exo #1, frazioni 10,8-12.0; Exo #2, frazioni 15,6-16,8 e Exo 3, 18,0 frazioni) e virus HIV-1 si localizzano alla densità maggiore 16,8 e 18,0 frazioni (lane 10-11). Non sorprende, quando si applica questo protocollo per caratterizzare EV rilasciati dal virus umano T-linfotropico Tipo 1 (HTLV-1), un retrovirus che è noto per causare il cancro negli adulti, abbiamo osservato risultati simili a quelli di EV CORRELATI all'HIV-1. Il terzo pannello in Fig. 3C mostra che il virus HTLV-1 è stato localizzato principalmente alla frazione di densità più alta (18,0) e, in misura minore, alle frazioni 13,2-16,8 come dimostra la presenza di proteine a matrice HTLV-1 (p19). Inoltre, abbiamo già scoperto che la proteina di trasattivazione HTLV-1, Tax, che è assente dal virion HTLV-1, è presente all'interno di esosomi rilasciati da cellule infette HTLV-115,23. I dati nella figura 3C mostrano che l'imposta era presente nelle frazioni a densità inferiore (6,0-12,0), due delle quali abbiamo dimostrato di contenere esosomi (10,8 e 12,0).
Successivamente, abbiamo testato il protocollo di isolamento nel contesto di virus sempre più piccoli, come il virus Ebola (EBOV) e il virus zika, rispettivamente, poiché i virioni HIV-1 e HTLV-1 sono sia retrovirus che di diametro molto simili. Utilizzando il VLP come modello di livello di biosicurezza surrogata 2 (BSL-2) dell'assemblaggio e dell'uscita EBOV, abbiamo scoperto che il VLP, che è lungo circa 1 m, si localizza alla frazione di densità più alta (18,0) in assenza di filtrazione di 0,22 m (pannello centrale, Figura 3C). Inoltre, quando VP40, la proteina matrice EBOV, è espressa ad alti livelli, viene secreta dalla cellula attraverso diversi meccanismi con conseguente presenza di VP40 in ogni frazione di densità, compresi quelli a cui gli esosomi sono localizzati13 , 14.Al contrario, i virioni di iKV sono significativamente più piccoli dei virioni DELL'HIV-1, misurando circa 40 nm di diametro. Il diagramma rappresentativo nel pannello inferiore della Figura 3C mostra la presenza di virioni di iKV sia a bassa densità (6,0-8,4) che ad alta densità (15,6-18,0) frazioni, suggerendo la presenza rispettivamente di virus libero e virus incapsulato da EV.
Figura 1: Costruzione di un gradiente di densità di iodixanolo. (A) Quantità relative di iodixanol e PBS utilizzate per creare ogni frazione di densità (Frazione . La frazione indica la percentuale di iodixanol inclusa in ogni frazione. Le loro densità relative e la loro collocazione nel gradiente sono rappresentate dal più pesante al più leggero. (B) Il posizionamento delle frazioni di densità (6,0-18) nel tubo di ultracentrifuga è indicato (lato sinistro) così come la posizione delle tre popolazioni di EV (Exo #1, Exo #2, Exo #3), vesciche simili a Exo e complessi proteici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il reagente di precipitazione PEG aumenta la resa EV. (A) Per confrontare il recupero eV, gli EV sono stati isolati dal mononnato di coltura infettato da 5 d HIV-1 (10 mL) utilizzando l'ultracentrifugazione tradizionale (100.000 x g)o il reagente di precipitazione PEG (incubazione a un rapporto 1:1). I veicoli di lavoro di entrambe le procedure di arricchimento sono stati analizzati utilizzando l'analisi dei nanotracciati per valutare la concentrazione di EV risultante, come descritto in DeMarino, etal. 6. NTA è stato misurato in 11 posizioni indipendenti in triplice copia tecnica. Le barre blu rappresentano una media delle 33 misurazioni - Il significato statistico di S.D. è stato determinato utilizzando un test t -test diStudent a due code; p < 0.001. B. EV da 5 giorni CEM coltura supernatant utilizzando sia ultracentrifugatition (UC) o precipitazioni PEG seguita da separazione densità iodixanol. L'ultracentrifugation è stata eseguita utilizzando 100 mL di coltura supernatante (Lane 1) mentre le precipitazioni PEG e la successiva frazione iodixanolo sono state eseguite utilizzando 10 mL di coltura supernatant (lane 2). Il pellet EV totale ottenuto dall'ultracentrifugatizione e la frazione di 10,8 dalla separazione PEG/iodixanol sono stati analizzati dalla macchia occidentale per la presenza di proteine marcatore esosomiche (CD81, CD63 e CD9) con Actin come controllo. Per chiarezza, le corsie selezionate dalla stessa macchia con esposizioni identiche vengono visualizzate nel pannello B. Questa cifra è stata modificata da DeMarino, etal. 6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Isolamento dei veicoli elettrici lontano dai virus. (A) Supernatants di coltura di cinque giorni provenienti da cellule CEM non infette (pannello superiore), HIV-1 (Ba-L; MOI: 0,01) cellule U1 infette (trattamento di PMA e cART; pannello centrale) o macrofagi primari infetti da HIV-1 (pannello inferiore) sono stati incubati con reagente di precipitazione PEG a 4 gradi durante la notte. Gli EV sono stati separati in frazioni utilizzando un gradiente di densità di iodixanolo. Gli eV di tutte le frazioni sono stati arricchiti usando particelle NT80/82 durante la notte a 4 gradi centigradi. Le nanopelle CEM sono state analizzate usando la macchia occidentale per la presenza di proteine marcatore esosomiche CD81, CD63 e CD9. Sono stati analizzati i macrofagi primari infetti da HIV-1 per la presenza di proteine HIV-1 Gag (p24 e Pr55; rispettivamente poliproteine HIV-1 Gag infette) e di Affetto da HIV-1 Gag, nonché CD63. Le macchie sono state sondate per l'actin come controllo. Le popolazioni di esosomi (CD81,CD63eCD9) sono evidenziate in rosso. Questa cifra è stata modificata da DeMarino, et al6 (B) I supernatanti di coltura di cinque giorni provenienti da cellule U1 infette sono stati incubati con il reagente di precipitazione peg a 4 gradi durante la notte. Gli EV sono stati separati in frazioni utilizzando un gradiente di densità di iodixanolo. Gli eV di tutte le frazioni sono stati arricchiti usando particelle NT80/82 durante la notte a 4 gradi centigradi. Le frazioni venivano eseguite su una macchia occidentale per la presenza di HIV-1 Nef, Vpr e Tat. Actin è stato usato come controllo. Le popolazioni di esosomi (CD81,CD63eCD9) sono evidenziate in rosso come precedentemente definito in DeMarino, et al.6 (C) Illustrazione rappresentativa dei profili di separazione EV precedentemente caratterizzati da quattro diversi virus: HIV-1, HTLV-1, EBOV e .IKV. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: flusso di lavoro del protocollo. Il nuovo flusso di lavoro combina diverse tecniche tra cui la filtrazione, la precipitazione EV con il reagente di precipitazione PEG, la separazione del gradiente di densità iodixanol e l'arricchimento di nanoparticelle degli EV. L'utilizzo di questo protocollo separa i veicoli elettrici da vari virus e fornisce un campione di piccolo volume per i saggi a valle, tra cui qPCR, macchie occidentali, spettrometria di massa, sequenziamento dell'RNA, analisi della citochina, ELISA e saggi basati sulle cellule. Questa cifra è stata modificata da DeMarino, etal. 6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo delineato consente una maggiore resa evlari e la separazione del virus dagli eV utilizzando un approccio combinato all'isolamento. Quantità relativamente elevate di materiale di partenza (ad es. supernatante cellulare) possono essere filtrate prima dell'isolamento EV mediante precipitazioni, separazione della DG e arricchimento delle nanoparticelle, con un volume finale di 30 saggi a valle. L'uso dell'arricchimento delle nanoparticelle è essenziale in quanto, rispetto all'ultracentrifugazione tradizionale, queste nanoparticelle che arricchiscono gli EV hanno dimostrato di catturare le vescicoli in modo più efficiente, producendo una quantità maggiore o uguale alla quantità di vescicoli da 1 mL di coltura supernatali rispetto ai 10 mL di coltura ultracentrifuga supernatant15. Nel complesso, il protocollo descritto comprende la combinazione di diverse tecniche ben note e pertanto dovrebbe presentare difficoltà limitate. Tuttavia, l'incorporazione di nanoparticelle che arricchiscono eV introduce una nuova tecnica che può richiedere la risoluzione dei problemi e/o modifiche per ottenere risultati desiderabili a seconda dell'analisi a valle o dell'obiettivo biologico di interesse. Consigliamo di incubare nanoparticelle con supernatanti filtrati di coltura cellulare durante la notte. Se la proteina bersaglio o l'RNA di interesse è di scarsa abbondanza nel sistema modello, il protocollo può essere adattato per aumentare il periodo di incubazione per garantire la cattura del bersaglio. L'utilizzo delle nanoparticelle nei saggi a valle può in genere essere realizzato ricomponendo il pellet nel buffer di campione desiderato per ogni analisi. Ad esempio, le nanoparticelle possono essere risospese direttamente nel buffer Laemmli per l'analisi delle macchie occidentali. Il materiale catturato dovrebbe quindi essere eluito in modo più efficiente dalle nanoparticelle in SDS tramite cicli di riscaldamento e vortice. Per ottenere un'adeguata separazione delle proteine, occorre prestare attenzione a limitare la quantità di nanoparticelle caricate nel gel e il gel deve essere eseguito a circa 100 V per garantire che eventuali particelle rimanenti siano contenute nei pozzi. Inoltre, per la visualizzazione di proteine a basso peso molecolare, un trasferimento bagnato notturno ottiene risultati ottimali. Anche se l'uso di nanoparticelle comporta un significativo arricchimento di popolazioni di vescicoli, devono essere intrapresi ulteriori passi per evitare il materiale catturato dalle particelle. Inoltre, l'eluzione del materiale può potenzialmente limitare l'utilità dei veicoli elettrici nei saggi funzionali a valle, poiché molti buffer di eluzione possono danneggiare l'integrità della membrana EV. Sono necessarie ulteriori ricerche per progettare una strategia per consentire la rimozione delle vescicle intatte dalle nanoparticelle dopo l'incubazione. Un altro svantaggio di queste particelle è l'attuale mancanza di caratterizzazione. Il guscio esterno della particella è stato progettato per escludere molecole ad alto peso molecolare. Tuttavia, il targeting specifico delle particelle ai Veicoli elettrici non ha luogo e, di conseguenza, molti fattori di confusione e segnali di fondo possono potenzialmente essere presenti nei saggi a valle.
Il metodo descritto deve essere utilizzato principalmente per scopi di laboratorio. Recentemente abbiamo sviluppato metodi alternativi per espandere le capacità del nostro approccio combinato a tecniche aggiuntive per isolare i veicoli elettrici da biofluidi di pazienti su piccola scala come plasma e CSF e produzione di veicoli elettrici commerciali su larga scala. Per l'isolamento dei VE lontano dal virus nel materiale del paziente abbiamo incorporato l'uso di colonne di cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC), che vengono utilizzate al posto di un gradiente di densità. Queste colonne sono utili in quanto sono usa e getta e quindi sono ideali nei laboratori ad alto contenimento. Tuttavia, le colonne SEC separano le particelle in base alle dimensioni, quindi ne consegue che questo tipo di separazione è applicabile solo per la separazione di virus grandi o molto piccoli, come es. proteine libere. In termini di produzione di veicoli elettrici su larga scala, i recenti progressi nei metodi basati sulla filtrazione, vale a dire la filtrazione del flusso tangenziale (TFF), hanno permesso l'isolamento efficiente dei veicoli elettrici da grandi volumi di campionamento. Il TFF è stato storicamente utilizzato per la purificazione di biomolecole di dimensioni nanometriche, compresi i virus, e attraverso l'ottimizzazione dei protocolli questo sistema è stato adattato con successo per l'isolamento degli EV24,25. In breve, durante il processo TFF, il fluido campione scorre tangenzialmente sulla superficie di una membrana semipermeabile che mantiene selettivamente le vesciche in base alle dimensioni e al peso molecolare, consentendo così la separazione degli EV lontano da proteine libere e altri contaminante biomolecole26. Rispetto all'ultracentrifuga, è stato riferito che il TFF produce rendimenti più elevati, meno aggregazioni, e riduce la variabilità lot-to-lottability degli EV27. Inoltre, è stato segnalato anche l'uso di TFF per l'isolamento di qualità GMP (Good Practice) di EV per l'applicazioneterapeutica 28. Grazie alla sua scalabilità e riproducibilità, questa tecnologia offre un grande potenziale per la futura ricerca EV.
I virus sono disponibili in diverse dimensioni e densità, quindi a seconda del virus in questione, potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione di questo protocollo. Per virus molto grandi come l'Ebola (1 m o più grande di lunghezza), è possibile utilizzare una semplice filtrazione per rimuovere la stragrande maggioranza dei virioni e dei grandi corpi contaminanti come VLP e corpi apoptotici14. Ciò consente la maggior parte della separazione del virus lontano dai veicoli elettrici per essere eseguibile sul front-end della purificazione. Tuttavia, nel caso di virus più piccoli, come l'enterovirus (30 nm), il virus zoka (40 nm), il virus dell'epatite B (42 nm), il virus dell'epatite C (55 nm) e altri, la frazione in cui sarà necessario determinare il sedimento di virioni prima di migliorare il funzionamento a valle Analisi. Non si può sempre approssimare la probabile frazione di sedimentazione basata solo sul diametro delle particelle. Ad esempio, il poliovirus, di 30 nm di diametro, è anche noto per essere incapsulato in autofagosomi secretoria29,30,31,32,33, e quindi è probabile che si trovino su il lato destro del gradiente (frazioni più dense) anziché quello sinistro (frazioni meno dense). Anche se abbiamo ottimizzato questo protocollo nel caso di HIV-1, HTLV-1 e EBOV VLP, ulteriori virus avranno bisogno di caratterizzazione per ottimizzare il protocollo per la loro purificazione specifica lontano dai veicoli elettrici.
Il protocollo qui descritto (Figura 4) consente, per la prima volta, all'utente di separare i VE dal virus con una maggiore efficienza e piccoli volumi di materiale di partenza rispetto al gold standard di isolamento EV, ultracentritezione. Questo metodo può essere facilmente adattato alle condizioni a portata di mano, tra cui diverse dimensioni del campione, rese richieste, tipo di materiale di partenza (cioè, coltura supernatante rispetto al materiale del paziente), e vari virus diversi di diverse dimensioni.
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Disclosures
B.L. è affiliata con Ceres Nanosciences inc. Tutti gli altri autori non dichiarano potenziali conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Kashanchi, in particolare Gwen Cox. Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health (NIH) Grants (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 e NS099029 a F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CEM CD4+ Cells | NIH AIDS Reagent Program | 117 | CEM |
| DPBS without Ca and Mg (1x) | Quality Biological | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG precipitation reagent |
| Exosome-Depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
| Fetal Bovine Serum | Peak Serum | PS-FB3 | Serum |
| HIV-1 infected U937 Cells | NIH AIDS Reagent Program | 165 | U1 |
| Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
| Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
| Optima XE-980 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 |
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