Summary
Dieses Protokoll isoliert extrazelluläre Vesikel (EVs) von Virionen mit hoher Effizienz und Ausbeute, indem EV-Fällung, Dichtegradient-Ultrazentrifugation und Partikelerfassung integriert werden, um einen optimierten Workflow und eine Reduzierung des Startens zu ermöglichen. Mengenanforderungen, die zu reproduzierbaren Präparaten für den Einsatz in allen EV-Forschungen führen.
Abstract
Eine der größten Hürden auf dem Gebiet der extrazellulären Vesikelforschung (EV) ist heute die Fähigkeit, gereinigte EV-Präparate in einer Virusinfektion zu erreichen. Die vorgestellte Methode soll Elektrofahrzeuge von Virionen (d. h. HIV-1) abisolaten und eine höhere Effizienz und Ausbeute im Vergleich zu herkömmlichen Ultrazentrifugationsmethoden ermöglichen. Unser Protokoll enthält drei Schritte: EV-Ausfällung, Dichtegradiententrennung und Partikelerfassung. Downstream-Assays (z. B. Western Blot und PCR) können direkt nach der Partikelerfassung ausgeführt werden. Diese Methode ist vorteilhaft gegenüber anderen Isolationsmethoden (d. h. Ultrazentrifugation), da sie die Verwendung von minimalen Startvolumina ermöglicht. Darüber hinaus ist es benutzerfreundlicher als alternative EV-Isolationsmethoden, die mehrere Ultrazentrifugationsschritte erfordern. Die vorgestellte Methode ist jedoch in ihrem Umfang an funktionellen EV-Assays begrenzt, da es schwierig ist, intakte Elektrofahrzeuge aus unseren Partikeln zu entfernen. Darüber hinaus ist diese Methode auf einen rein forschungsbasierten Rahmen zugeschnitten und wäre kommerziell nicht rentabel.
Introduction
Die Forschung, die sich auf extrazelluläre Vesikel (EVs) konzentriert, insbesondere Exosomen, eine Art von EV im Bereich 30-120 nm und gekennzeichnet durch das Vorhandensein von drei Tetraspanin-Markern CD81, CD9 und CD63, wurde weitgehend durch die Entwicklung von Methoden zur Isolierung und die Vesikel von Interesse zu reinigen. Die Fähigkeit, vielfältige Mechanismen zu dissektieren, wurde durch komplexe und zeitaufwändige Techniken behindert, die Proben erzeugen, die aus einer heterogenen Population von Vesikeln bestehen, die über verschiedene Wege mit einer Vielzahl von Inhalten, Größen und Dichten. Während dies ein Problem für fast die gesamte EV-Forschung ist, ist es von besonderer Bedeutung bei der Untersuchung von Elektrofahrzeugen im Zusammenhang mit Virusinfektionen, da Virionen und virusähnliche Partikel (VLPs) im Durchmesser den Vesikeln von Interesse ähnlich sein können. Zum Beispiel hat das Human Immunodeficiency Virus Typ 1 (HIV-1) einen Durchmesser von etwa 100 nm, was ungefähr der Größe vieler Arten von Elektrofahrzeugen entspricht. Aus diesem Grund haben wir einen neuartigen EV-Isolations-Workflow entwickelt, um diese Probleme anzugehen.
Der aktuelle Goldstandard der EV-Isolierung ist die Ultrazentrifugation. Diese Technik nutzt die verschiedenen Vesikeldichten, die es ermöglichen, die Vesikel durch Zentrifugation mit Differentialsedimentation von Partikeln mit höherer Dichte im Vergleich zu Partikeln mit niedrigerer Dichte in jeder Stufe 1,2zu trennen. Mehrere Mittel zur Zentrifugierung mit niedriger Geschwindigkeit sind erforderlich, um intakte Zellen (300-400 x g für 10 min), Zellablagerungen (für 10 min) und apoptotische Körper/große Vesikel (10.000 x g für 10 min) zu entfernen. Auf diese anfänglichen Reinigungen folgt eine Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugation (100.000-200.000 x g für 1,5-2 h) zu Sediment-EVs. Waschschritte werden durchgeführt, um die Reinheit der Evev weiter zu gewährleisten, dies führt jedoch zur Verringerung der Anzahl isolierter Elektrofahrzeuge, wodurch die Gesamtausbeute 3,4verringert wird. Der Nutzen dieser Methode wird durch den Bedarf an einer großen Anzahl von Zellen (ca. 1 x 108) und einem großen Probenvolumen (> 100 ml) weiter eingeschränkt, um angemessene Ergebnisse zu erzielen.
Um den wachsenden Bedenken Rechnung zu tragen, ist die Fällung von Vesikeln mit hydrophilen Polymeren in den letzten Jahren zu einer nützlichen Technik geworden. Polyethylenglykol (PEG) oder andere verwandte Niederschlagsreagenzien ermöglichen es dem Anwender, die Vesikel, Viren und Protein- oder Protein-RNA-Aggregate innerhalb einer Probe herunterzuziehen, indem die Probe einfach mit dem Reagenz der Wahl inkubiert wird, gefolgt von einer einzigen Zentrifugation1,2,5. Wir haben bereits berichtet, dass die Verwendung von PEG oder verwandten Methoden zur Ausscheidung von Elektrofahrzeugen im Vergleich zur herkömmlichen Ultrazentrifugation zu einer deutlich höheren Ausbeute6führt. Diese Strategie ist schnell, einfach, erfordert keine zusätzliche teure Ausrüstung, ist leicht skalierbar und behält die EV-Struktur bei. Aufgrund des promiskuitiven Charakters dieser Methode enthalten die resultierenden Proben jedoch eine Vielzahl von Produkten, darunter freie Proteine, Proteinkomplexe, eine Reihe von Elektrofahrzeugen und Virionen, die eine weitere Reinigung erfordern, um die gewünschte Population zu erhalten1 ,2,7,8.
Um die Heterogenität von Elektrofahrzeugen zu überwinden, die aus verschiedenen Niederschlagsmethoden gewonnen werden, wird die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (DG) genutzt, um Partikel auf der Grundlage ihrer Dichte besser zu trennen. Diese Methode wird mit einem stufenweisen Gradienten unter Verwendung eines Dichtegradientenmediums wie Iodixanol oder Saccharose durchgeführt, das die Trennung von Elektrofahrzeugen von Proteinen, Proteinkomplexen und virus- oder virusähnlichen Partikeln (VLPs) ermöglicht. Es ist wichtig zu beachten, dass, obwohl man einst dachte, dass die DG eine genauere Trennung der EV-Subpopulationen zulässt, es heute bekannt ist, dass sich Größen und Dichten verschiedener Vesikel überschneiden können. So haben Exosomen bekanntermaßen Flotationsdichten von 1,08-1,22 g/ml9, während aus dem Golgi isolierte Vesikel (COPI+ oder Clathrin+) Dichten von 1,05-1,12 g/ml und solche aus dem endoplasmatischen Retikulum (COPII+ ) Sediment bei 1,18-1,25 g/mL1,2,3,4,9. Wenn man exosomale Fraktionen mit Fraktionen vergleichen möchte, die Viruspartikel enthalten, kann dies je nach Dichte des Virus von Interesse schwieriger werden – es gibt andere Viren als HIV-1, die wahrscheinlich gleichzeitig ausgleichen. Dichte als exosomale positive Fraktionen2.
Schließlich ist die Anreicherung von EV-Preps für nachgelagerte Visualisierungen und funktionelle Assays für die EV-Forschung von entscheidender Bedeutung. Die Verwendung von EV-anreichernden Nanopartikeln, insbesondere multifunktionalen Hydrogelpartikeln mit einem Durchmesser von 700-800 nm, ist ein entscheidender Schritt zur Erreichung konzentrierter EV-Preps. Sie besitzen einen aromatischen Köder mit hoher Affinität, der von einer porösen äußeren Siebschale gekapselt wird, um die Selektivität zu fördern. Zu den in dieser Studie verwendeten Nanopartikeln gehören zwei unterschiedliche Präparate mit unterschiedlichen Kernködern (Reactive Red 120 NT80 und Cibacron Blue F3GA NT82), die nachweislich die Erfassung von Elektrofahrzeugen aus verschiedenen Reagenzien und Biofluiden erhöhen (siehe Tabelle der Materialien). )6,10,11,12,13,14,15. Die Partikel bieten eine einfache Anreicherung von Elektrofahrzeugen aus zahlreichen Ausgangsmaterialien, darunter Iodixanolfraktionen, Zellkulturüberstand, sowie Patientenbiofluide wie Plasma, Serum, zerebrale Rückenmarksflüssigkeiten (CSF) und Urin6,13 .
Die hier vorgestellte Methode verbessert die Effizienz der aktuellen EV-Reinigungstechniken durch die Kombination mehrerer Technologien; EV-Fällung, Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und Partikelerfassung, um den Workflow zu optimieren, die Probenanforderungen zu reduzieren und die Ausbeute zu erhöhen, um eine homogenere EV-Probe für den Einsatz in allen EV-Forschungen zu erhalten. Diese Methode ist besonders nützlich bei der Untersuchung von Elektrofahrzeugen und deren Inhalt während einer Virusinfektion, da sie einen Filterschritt von 0,22 m umfasst, um große, unerwünschte Vesikel und VLPs sowie die Trennung der gesamten EV-Population auf der Grundlage der Dichte zu einer effektiven EVs von Virions zu isolieren.
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Protocol
1. Filtration und Niederschlag von extrazellulären Vesikeln (EVs)
- Um den Kulturüberstand aus infizierten oder transfizierten Zellen (d. h. Zelllinien und/oder Primärzellen) vorzubereiten, kulturieren Sie etwa 10 ml Late-Log-Zellen für 5 Tage bei 37 °C und 5 %CO2 in geeigneten Kulturmedien (d. h. RPMI oder DMEM mit 10 % fetalem Rinder Serum [FBS]).
HINWEIS: Alle Kulturmedium-Reagenzien sollten frei von Elektrofahrzeugen sein und können entweder gekauft werden (siehe Materialtabelle) oder in Eigenung durch Vor-Ultrazentrifugation von Serum bei 100.000 x g für 90 min hergestellt werden. Dieses Protokoll war erfolgreich für mehrere häufig verwendete Zelllinien, darunter: CEM, Jurkat, 293T, U937 (nicht infizierte Linien), U1, J1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (HIV-1 und HTLV-1 infizierte Linien), mehrere transfizierte Zellen und primäre myeloide und T-Zellen (beide infiziert und nicht infiziert); Dieses Protokoll kann jedoch für jeden Zelltyp verwendet werden, einschließlich derer, die spezielle Medien- oder Kulturbedingungen erfordern. Die Dichte der Zellen muss möglicherweise für verschiedene Zelltypen optimiert werden. Es wird empfohlen, die höchste Dichte mit minimalem Zelltod nach 5 Tagen zu verwenden. - Zentrifugieren Sie die Kultur bei 3.000 x g für 5 min zu Pelletzellen und entsorgen Sie das Pellet.
- Filtern Sie den Kulturüberstand mit einem sterilen 0,22 m Filter und sammeln Filtrat in einem Röhrchen.
- Fügen Sie dem gefilterten Überstand das gleiche Volumen des PEG-Niederschlagsreagenzes (1:1-Verhältnis) hinzu. Inverttube mehrmals, um eine homogene Mischung zu gewährleisten.
HINWEIS: Nicht wirbeln. - Inkubationsmischung bei 4 °C über Nacht (O/N).
- Zentrifugengemisch bei 1.500 x g für 30 min bei Raumtemperatur (RT) zu einem heterogenen EV-Pellet.
HINWEIS: EV Pellet sollte weiß oder off-white in der Farbe erscheinen. - Entsorgen Sie den EV-erschöpften Kulturüberstand.
- Das EV-Pellet in 150–300 l phosphatgepufferter Saline ohne Kalzium und Magnesium (PBS) aussetzen und auf Eis halten.
2. Konstruktion eines Dichtegradienten
- Mischen Sie Dasiodixanol dichte Gradientenmedium mit 1x PBS, um 11 verschiedene 1 ml Dichtefraktionen von 6 bis 18% Iodixanol in 1,2% Schritten in separaten Mikrozentrifugenröhren zu erzeugen, wie in Abbildung 1Adargestellt.
- Wirbel jede Röhre zu mischen.
- Schichtdichtefraktionen in ein vorgereinigtes und trocken schwingendes Eimer-Ultrazentrifugenrohr beginnend mit #18 und endend mit #6 wie in Abbildung 1Bangegeben.
HINWEIS: Alle Rohre sollten mit einem 10% Bleichspray desinfiziert werden, gefolgt von dem Spülen 3x mit entionisiertem Wasser und einer letzten Wäsche von sterilem entionisiertem Wasser vor dem Laden der Gradientenfraktionen. - Fügen Sie resuspendiertes EV-Pellet (300 l) an die Spitze des geschichteten Gradienten im Ultrazentrifugenrohr.
- Ultrazentrifuge bei 100,00 x g bei 4 °C für 90 min.
- Entfernen Sie vorsichtig die 1 ml-Fraktionen aus dem Ultrazentrifugenrohr und übertragen Sie jede Fraktion in neue Mikrozentrifugenrohre.
3. Anreicherung von EV-Fraktionen uUsing Nanoparticles
- Erstellen Sie eine 30%ige Gülle von Nanopartikeln mit gleichen Volumina von NT80, NT82 und 1x PBS.
HINWEIS: Das Gemisch sollte vor der Verwendung gewirbelt werden, um homogenzuwerden. - Fügen Sie jedem Mikrozentrifugenrohr, das die Dichtefraktionen enthält, 30 l der Gülle hinzu und die Pipette/Invertiten mehrmals zum Mischen.
- EV-anreichernde nanopartikelhaltige Dichtefraktion Mikrozentrifugenröhren O/N bei 4 °C bei ca. 20 U/min drehen.
- Zentrifugendichte Fraktion Mikrozentrifugenrohre bei 20.000 x g für 5 min bei RT.
- Entsorgen Sie die Flüssigkeit und waschen Sie EV Pellet zweimal mit 1x PBS.
HINWEIS: Nanopartikelpellets können bei -20 °C eingefroren oder sofort für verschiedene nachgeschaltete Assays (z. B. PCR, Western Blot, Massenspektrometrie und andere Assays) verwendet werden.
4. Empfohlene Herstellung von Nanopartikelpellet für Downstream-Assays
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Für RNA-Isolierung
- Setzen Sie das Pellet in 50 l autoklaviertem entionisiertem Wasser, das mit 0,001% Diethylpyrocarbonat (DEPC) gefiltert wird, durch einen 0,2-mm-Filter wieder aufundstillen und die RNA gemäß dem Protokoll des Kitherstellers isolieren.
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Für Gelelektrophorese
- Setzen Sie das Pellet direkt in 15 l Laemmli-Puffer aus.
- 3 min. 3 min. 3x 3x vorziehen und zwischen jedem Wärmezyklus nach unten drehen.
- Zentrifugenprobe für 15 s bei 20.000 x g und laden Sie das gesamte eluierte Material direkt auf das Gel.
HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, begrenzen Sie die Menge der Partikel, die auf das Gel geladen werden, und führen Sie das Gel bei 100 V aus, um sicherzustellen, dass alle verbleibenden Partikel in den Brunnen enthalten sind.
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Für die Trypsinverdauung
- Setzen Sie das Pellet vor der Alkylierung in 20 l Harnstoff aus und versuchen Sie die Probe. Nanopartikel können durch eine Zentrifugation von 14.000 x g bei RT 10 min pelletiert werden. Proben, die das trypsinisierte Peptid enthalten, können in ein sauberes Sammelrohr übertragen werden.
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Representative Results
PEG-Niederschlag erhöht EV-Ausbeute
Unser Kombinationsansatz zur EV-Isolierung ist in Bezug auf die EV-Rückgewinnung deutlich effizienter als bei der herkömmlichen Ultrazentrifugation, wie die 90%ige Reduzierung des benötigten Ausgangsmaterials zeigt. Ultrazentrifugation, der aktuelle Goldstandard in der EV-Isolierung, benötigt ca. 100 ml Kulturüberstand, um eine adäquate EV-Vorbereitung für nachgeschaltete Assays zu erzeugen, während unser neuartiges Protokoll nur 10 ml benötigt. Möglich wird diese Reduktion durch den Einsatz des PEG EV-Niederschlagsreagenzes, das eine signifikante Erhöhung der EV-Ausbeute ermöglicht, gemessen durch Nanotracking-Analyse (NTA). Die Ergebnisse in Abbildung 2A, die zuvor veröffentlicht wurden6, zeigen, dass bei der Verwendung von 10 ml Kultur überstandPEG Niederschlag führte in der Erholung von 7,27 x 1010 EVs, das war etwa 500-mal mehr als die Anzahl von Elektrofahrzeugen, die mit Hilfe der Ultrazentrifugation aus demselben Ausgangsmaterial zurückgewonnen wurden (1,45 x 108). Erhöhte Effizienz der Isolierung von Exosomen, einem spezifischen EV-Subtyp, wurde auch beobachtet, wie durch erhöhte Konzentrationen von gut charakterisierten Exosomen-Marker-Proteinen, CD81, CD63 und CD9 deutlich wurde. Die Western Blot-Analyse zum Vergleich von EV-Preps, die entweder aus Ultrazentrifugation oder EV-Fällung mit einem PEG-Fällreagenz hergestellt werden, ist in Abbildung 2Bdargestellt. Diese Ergebnisse zeigen eine 3.000-fache Zunahme von CD81, eine Vervierfachung der CD63 und eine 40-fache Zunahme von CD9, gemessen an der Densitometrie-Analyse. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das skizzierte Protokoll nicht nur die Gesamtleistung der Elektrofahrzeuge erhöht, sondern auch die Rückgewinnung von Exosomen im Vergleich zur Ultrazentrifugation verbessert.
Charakterisierung von Elektrofahrzeugen und Trennung von Elektrofahrzeugen weg vom HIV-1-Virus
Um die vesikelten Vesikel zu charakterisieren, die in jeder Fraktion nach der Nanopartikelanreicherung vorhanden sind, wurden EVs von nicht infiziertem CEM- oder HIV-1-infiziertem U1-Zellkulturüberstand mit dem skizzierten Protokoll isoliert und mit Western Blot jedes nanopartikelangereicherte Iodixanol-Fraktion. Die Daten in Abbildung 3A zeigen unsere zuvor veröffentlichten Ergebnisse, die das Vorhandensein oder Fehlen von drei exosomalen Tetraspaninen (CD81, CD63 und CD9) in jedem Bruch (CEM-Zellen; oberes Panel) belegen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Exosomen, wie durch das Vorhandensein aller drei Tetraspanine innerhalb der Fraktion definiert, in drei unterschiedlichen Populationen gefunden werden: Exo #1 die die Fraktionen 10.8-12.0 enthält, Exo #2 die die Fraktionen 15.6-16.8 enthält, und Exo3, das 3 enthält, das nur die 18,0-Fraktion. Trotz des Vorhandenseins von drei unterschiedlichen Populationen kann das Protokoll nicht ausschließen, dass innerhalb jeder Fraktion zusätzliche Arten von Elektrofahrzeugen auftreten. Darüber hinaus schließen diese Ergebnisse nicht definitiv die Möglichkeit aus, dass es Vesikel in diesen Populationen gibt, die für eine Kombination der getesteten Tetraspaninmarker positiv sind. Diese Elektrofahrzeuge könnten dann durch zusätzliche Reinigungsstrategien weiter getrennt werden.
Das sich rasch entwickelnde Feld der EV/Exosomenforschung ist seit ihrer Entdeckung explodiert und hat zu vielen neu entdeckten Funktionen und Anwendungen für diese Vesikel geführt. Insbesondere ihre Rolle als intrazelluläre Botenstoffe in nicht nur der normalen Physiologie, sondern auch bei Krankheiten hat dazu geführt, dass erhebliche Ressourcen genutzt wurden, um die Auswirkungen und den Nutzen extrazellulärer Vesikel, insbesondere Exosomen, auf Empfängerzellen zu sezieren16 , 17 , 18. Zahlreiche Studien haben EVs in die Pathogenese einer Vielzahl von Infektionen verwickelt, einschließlich HIV-16,10,12,19,20,21 , 22. Die Größenähnlichkeit zwischen Elektrofahrzeugen und Virions stellt jedoch ein potenzielles Hindernis bei der Definition dieser EV-vermittelten Mechanismen dar. Um diesem Problem zu begegnen, haben wir unser Protokoll so konzipiert, dass ein Dichtegradient implementiert wird, um EV-Populationen effektiv von Virions zu trennen. Zu diesem Zweck wurden Zellkulturüberstand aus HIV-1-infizierten Zellen dem vorgestellten Protokoll unterzogen und von Western Blot auf das Vorhandensein von HIV-1 Gag p24 analysiert, um zu bestimmen, welche Fraktion oder Fraktion HIV-1-Virionen enthielt. Die in Abbildung 3A (Mittelpanel) gezeigten Ergebnisse zeigen die Lokalisierung von p24 unter drei unabhängigen Bedingungen: in Ermangelung eines Induktors in Gegenwart eines Induktors (Phorbol 12-Myristate 13-Acetat; PMA) und in Gegenwart von PMA und kombinationsantiretroviraler Therapie (cART), der Standardbehandlung für HIV-1. Diese Daten deuten darauf hin, dass das HIV-1-Virus auf Die Fraktion 16,8 lokalisiert ist, gemessen durch das Vorhandensein von p24 und seinem uncleaved Polyprotein Pr55. Wenn Zellen cART, zu dem Auch Indinavir, ein Proteasehemmer, der die Spaltung von Pr55 bis p24 verhindert, unterworfen werden, wurde in keinem Bruchteil p24 nachgewiesen. Stattdessen wurde nur Pr55 entdeckt und war in den 16.8-18.0-Fraktionen vorhanden, was auf eine Verschiebung des Virus in dichtere Fraktionen hindeutet. Ähnliche Ergebnisse wurden mit primären Makrophagen (unteres Panel) erzielt. Obwohl das beschriebene Protokoll zur Kosedimentation von Exo #2 und Exo #3 Populationen mit Virus führt, blieb die Exo-#1 Population (Fraktionen 10.8-12.0) virenfrei, was nachgelagerte Assays frei von Viruskontamination ermöglichte.
Diese Art der Trennung von Viren weg von Elektrofahrzeugen ermöglicht es uns, die Möglichkeit zu adressieren, dass Virusstücke in Elektrofahrzeuge gelangen oder als freies Protein aus infizierten Zellen abgesondert werden. Die Ergebnisse in Abbildung 3B deuten darauf hin, dass HIV-1 Nef-Protein in der Exo-#1 Population zusätzlich zu den Exo #2 und Exo #3 Populationen gefunden werden kann. Nef erscheint auch in der 6.0-Fraktion, was darauf hindeutet, dass Nef potenziell aus infizierten Zellen als freies Protein und innerhalb eines EV abgesondert werden kann. Zusätzlich findet sich HIV-1 Vpr-Protein in der 6,0-Fraktion, während HIV-1 Tat-Protein überwiegend in der 6,0-Fraktion vorkommt, aber auch in den Fraktionen 7.2-9.6. Wir testen derzeit alle Fraktionen auf das Vorhandensein von Tat-Protein durch ELISA. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl Tat als auch Vpr aus infizierten Zellen abgesondert werden können, wahrscheinlich als freie Proteine, während Tat auch in Elektrofahrzeuge integriert werden könnte. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass unsere Methode der EV-Isolierung Exosomen (Exo #1) erfolgreich von HIV-1-Virionen (Exo-#2 und #3) isolieren kann und dass EVs aus HIV-1-infizierten Zellen einige HIV-1-Proteine enthalten, die HIV-1-Pathogenese beeinflussen können.
Charakterisierung von Elektrofahrzeugen und Trennung von Elektrofahrzeugen weg von anderen Viren
Um dieses Protokoll auf andere Virusinfektionsmodelle anzuwenden, haben wir Vesikel aus Zellen charakterisiert, die mit verschiedenen Viren infiziert sind. Abbildung 3C zeigt eine Abbildung der zuvor erhaltenen Vesikel- und Virusverteilungen nach Ausfällung, Trennung und Anreicherung gemäß dem beschriebenen Protokoll. Wie bereits in Abbildung 3Adargestellt, sind Exosomen (CD9+CD63+CD81+) in drei verschiedenen Populationen vorhanden (Exo #1, Fraktionen 10.8-12.0; Exo #2, die Fraktionen 15,6-16,8 und das Exo-3- und das HIV-1-Virus und das HIV-1-Virus lokalisiert sich auf die höheren Dichte 16,8 und 18,0 Brüche (Bahnen 10-11). Es überrascht nicht, dass wir bei der Anwendung dieses Protokolls zur Charakterisierung von Elektrofahrzeugen, die vom humanen T-Lymphotropen Virus Typ 1 (HTLV-1), einem Retrovirus, das bekanntermaßen Krebs bei Erwachsenen verursacht, freigesetzte Elektrofahrzeuge charakterisieren, Ergebnisse beobachteten, die denen von HIV-1-bezogenen Elektrofahrzeugen ähneln. Das dritte Panel in Abb. 3C zeigt, dass das HTLV-1-Virus in erster Linie auf die höchste Dichte (18,0) und in geringerem Maße auf die Brüche 13.2-16.8 lokalisiert war, wie das Vorhandensein von HTLV-1-Matrixprotein (p19) belegt. Darüber hinaus haben wir zuvor festgestellt, dass das HTLV-1 transaktivierende Protein, Tax, das in der HTLV-1 Virion fehlt, in Exosomen vorhanden ist, die aus HTLV-1-infizierten Zellen15,23freigesetzt werden. Die Daten in Abbildung 3C zeigen, dass die Steuer in den Bruchteilen der unteren Dichte (6.0-12.0) vorhanden war, von denen zwei Exosomen (10.8 und 12.0) enthielten.
Als nächstes haben wir das Isolationsprotokoll im Zusammenhang mit größeren und kleineren Viren wie Ebola-Virus (EBOV) bzw. Zika-Virus (ZIKV) getestet, da HIV-1- und HTLV-1-Virionen sowohl Retroviren als auch sehr ähnliche Durchmesser aufweisen. Bei Verwendung von VLP als Ersatzmodell der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) der EBOV-Montage und -Ausfahrt fanden wir heraus, dass VLP, das etwa 1 m lang ist, in Abwesenheit einer 0,22-mm-Filtration (mittleres Panel, Abbildung 3C)auf die höchste Dichtefraktion (18,0) lokalisiert. Wenn VP40, das EBOV-Matrixprotein, auf hohem Niveau exprimiert wird, wird es aus der Zelle durch mehrere verschiedene Mechanismen abgesondert, was zu vp40 in jeder Dichtefraktion führt, einschließlich derjenigen, auf die Exosomen lokalisiert sind13 , 14. Im Gegensatz dazu sind die ZIKV-Virionen mit einem Durchmesser von etwa 40 nm deutlich kleiner als HIV-1-Virionen. Das repräsentative Diagramm in der unteren Gruppe von Abbildung 3C zeigt das Vorhandensein von ZIKV-Virionen sowohl in niedrigen Dichte (6.0-8.4) und hoher Dichte (15.6-18.0) Fraktionen, was auf das Vorhandensein von freiem Virus bzw. EV-verkapselten Viren hindeutet.
Abbildung 1: Konstruktion eines Odixanol-Dichtegradienten. (A) Relative Mengen an Iodixanol und PBS, die verwendet werden, um jede Dichtefraktion zu erstellen (Fraktion). Der Anteil der Fraktion bezeichnet den Prozentsatz des Indixanols, der in jeder Fraktion enthalten ist. Ihre relative Dichte und Platzierung im Gradienten werden von schwer bis am leichtesten dargestellt. (B) Die Platzierung der Dichtefraktionen (6,0-18) in ultrazentrifugenrohr wird (links) sowie die Lage der drei EV-Populationen (Exo #1, Exo #2, Exo #3), Exo-ähnliche Vesikel und Proteinkomplexe dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: PEG-Niederschlagsreagenz erhöht die EV-Ausbeute. (A) Zum Vergleich der EV-Rückgewinnung wurden Elektrofahrzeuge aus 5 d HIV-1-infiziertem Monozyten (U1)-Kulturüberstand (10 ml) mit traditioneller Ultrazentrifugation (100.000 x g)oder PEG-Fällungsreagenz (Inkubation im Verhältnis 1:1) isoliert. Elektrofahrzeuge aus beiden Anreicherungsverfahren wurden mittels Nanotracking-Analyse analysiert, um die in DeMarino, et al.6beschriebene resultierende EV-Konzentration zu bewerten. NTA wurde an 11 unabhängigen Positionen in technischer Dreifacharbeit gemessen. Die blauen Balken stellen einen Durchschnitt der 33 Messungen dar. Die statistische Signifikanz wurde mit einem zweischwänzigen Schüler-t-Testbestimmt; p < 0,001. B. EVs von 5-Tage CEM-Kulturüberstand mit Ultrazentrifugation (UC) oder PEG-Ausfällung gefolgt von Derixanol-Dichtetrennung. Die Ultrazentrifugation wurde mit 100 ml Kulturüberstand (Lane 1) durchgeführt, während PEG-Fällung und anschließende Iodixanol-Fraktionierung mit 10 ml Kulturüberstand (Lane 2) durchgeführt wurde. Das gesamte EV-Pellet, das aus der Ultrazentrifugation gewonnen wurde, und die 10,8-Fraktion aus PEG/Iodixanol-Trennung wurden durch Western Blot auf das Vorhandensein von exosomalen Markerproteinen (CD81, CD63 und CD9) mit Actin als Kontrolle analysiert. Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden ausgewählte Bahnen desselben Flecks mit identischen Belichtungen in Panel B angezeigt. Diese Zahl wurde von DeMarino, et al.6geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Isolierung von Elektrofahrzeugen weg von Viren. (A) Fünftägige Kulturüberstandstoffe aus nicht infizierten CEM-Zellen (obere Platte), HIV-1 (Ba-L; MOI: 0,01) infizierte U1-Zellen (PMA- und CART-Behandlung; Mittelpanel) oder HIV-1-infizierte primäre Makrophagen (untere Platte) wurden über Nacht mit PEG-Niederschlagsreagenz bei 4 °C inkubiert. Elektrofahrzeuge wurden mit einem Odixanol-Dichtegradienten in Fraktionen getrennt. Elektrofahrzeuge aller Fraktionen wurden über Nacht bei 4 °C mit NT80/82-Partikeln angereichert. CEM-Nanopellets wurden mit Western Blot auf das Vorhandensein von exosomalen Markerproteinen CD81, CD63 und CD9 analysiert. U1 (-PMA- und CART-Behandlung) und HIV-1-infizierte primäre Makrophagen wurden auf das Vorhandensein von HIV-1-Gag-Protein (p24 und Pr55; gespaltetes bzw. uncleaved HIV-1 Gag Polyprotein) sowie CD63 analysiert. Blots wurden auf Actin als Kontrolle untersucht. Wahre Exosomenpopulationen (CD81+CD63+CD9+) sind rot umrandet. Diese Zahl wurde von DeMarino, et al.6 (B) Fünftägige Kulturüberstand aus infizierten U1-Zellen modifiziert und über Nacht mit PEG-Niederschlagsreagenz bei 4 °C inkubiert. Elektrofahrzeuge wurden mit einem Odixanol-Dichtegradienten in Fraktionen getrennt. Elektrofahrzeuge aller Fraktionen wurden über Nacht bei 4 °C mit NT80/82-Partikeln angereichert. Für die Anwesenheit von HIV-1 Nef, Vpr und Tat wurden Fraktionen auf einem westlichen Fleck ausgeführt. Actin wurde als Kontrolle verwendet. Wahre Exosomenpopulationen (CD81+CD63+CD9+) sind rot umrissen, wie zuvor in DeMarino definiert, et al.6 (C) Repräsentative Abbildung von zuvor charakterisierten EV-Trennungsprofilen von vier verschiedene Viren: HIV-1, HTLV-1, EBOV und ZIKV. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Protokollworkflow. Der neuartige Workflow kombiniert verschiedene Techniken, darunter Filtration, EV-Fällung mit PEG-Niederschlagsreagenz, Iodixanol-Dichtegradiententrennung und Nanopartikelanreicherung von Elektrofahrzeugen. Die Nutzung dieses Protokolls trennt Elektrofahrzeuge von verschiedenen Viren und liefert eine kleine Volumenprobe für nachgeschaltete Assays, einschließlich qPCR, Western Blot, Massenspektrometrie, RNA-Sequenzierung, Zytokinanalyse, ELISA und zellbasierte Assays. Diese Zahl wurde von DeMarino, et al.6geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die skizzierte Methode ermöglicht eine verbesserte EEV-Ausbeute und die Trennung von Viren von Elektrofahrzeugen mit einem Kombinationsansatz zur Isolierung. Relativ große Mengen an Ausgangsmaterial (d. h. Zellüberstand) können vor der EV-Isolierung durch Niederschlag, DG-Trennung und Nanopartikelanreicherung gefiltert werden, was zu einem Endvolumen von 30 nachgeschaltete Assays. Die Verwendung der Nanopartikelanreicherung ist unerlässlich, da diese EV-anreichernden Nanopartikel im Vergleich zur herkömmlichen Ultrazentrifugation nachweislich Vesikel effizienter erfassen und eine Menge Vesikel aus 1 ml Kultur menge ergeben. Überstand im Vergleich zu 10 ml ultrazentrifugierter Kulturüberstand15. Insgesamt enthält das beschriebene Protokoll die Kombination mehrerer bekannter Techniken und dürfte daher nur begrenzte Schwierigkeiten mit sich bringen. Die Einbeziehung von EV-anreichernden Nanopartikeln führt jedoch zu einer neuen Technik, die eine Fehlerbehebung und/oder Modifikationen erfordern kann, um je nach dem nachgelagerten Assay oder dem biologischen Ziel von Interesse wünschenswerte Ergebnisse zu erzielen. Wir empfehlen, Nanopartikel über Nacht mit gefilterten Zellkulturüberstandzufeinern zu inkubieren. Wenn das Zielprotein oder die RNA von geringem Umfang im Modellsystem ist, kann das Protokoll angepasst werden, um die Inkubationszeit zu erhöhen, um die Erfassung des Ziels zu gewährleisten. Die Verwendung von Nanopartikeln in nachgeschalteten Assays kann in der Regel durch Wiederaussetzung des Pellets im gewünschten Probenpuffer für jeden Assay erreicht werden. Nanopartikel können beispielsweise direkt im Laemmli-Puffer für die Western-Blot-Analyse resuspendiert werden. Das eingefangene Material sollte dann durch Erhitzungs- und Wirbelzyklen effizienter aus den Nanopartikeln in SDS eluiert werden. Um eine angemessene Proteintrennung zu erreichen, sollte darauf geachtet werden, die Menge der in das Gel geladenen Nanopartikel zu begrenzen, und das Gel sollte bei etwa 100 V laufen, um sicherzustellen, dass alle verbleibenden Partikel in den Brunnen enthalten sind. Darüber hinaus erzielt ein über Nacht nasser Transfer für die Visualisierung von niedermolekularen Proteinen optimale Ergebnisse. Obwohl die Verwendung von Nanopartikeln zu einer signifikanten Anreicherung von Vesikelpopulationen führt, müssen zusätzliche Schritte unternommen werden, um das eingefangene Material aus den Partikeln zu lösen. Darüber hinaus kann die Elution des Materials den Nutzen von Elektrofahrzeugen in nachgeschalteten Funktionstests potenziell einschränken, da viele Elutionspuffer die Integrität der EV-Membran beschädigen können. Zusätzliche Forschung ist notwendig, um eine Strategie zu entwickeln, um die Entfernung intakter Vesikel aus Nanopartikeln nach der Inkubation zu ermöglichen. Ein weiterer Nachteil dieser Teilchen ist der derzeitige Mangel an Charakterisierung. Die äußere Hülle des Teilchens wurde entwickelt, um moleküle mit hohem Molekulargewicht auszuschließen. Eine spezifische Ausrichtung der Partikel auf Elektrofahrzeuge findet jedoch nicht statt, und infolgedessen können viele verwirrende Faktoren und Hintergrundsignale möglicherweise in nachgelagerten Assays vorhanden sein.
Das beschriebene Verfahren ist in erster Linie für Laborzwecke zu verwenden. Wir haben vor kurzem alternative Methoden entwickelt, um die Möglichkeiten unseres Kombinationsansatzes auf zusätzliche Techniken zur Isolierung von Elektrofahrzeugen aus kleinen, geduldigen Biofluiden wie Plasma und CSF sowie der kommerziellen Elektrofahrzeugproduktion im großen Maßstab zu erweitern. Für die Isolierung von Elektrofahrzeugen weg von Viren in Patientenmaterial haben wir die Verwendung von Größenausschlusschromatographie (SEC)-Säulen integriert, die anstelle eines Dichtegradienten verwendet werden. Diese Säulen sind insofern vorteilhaft, als sie Einweg sind und daher ideal in Laboren mit hohem Containment sind. SEC-Säulen trennen jedoch Partikel je nach Größe, daher ist diese Art der Trennung nur für die Trennung von großen oder sehr kleinen Viren, wie EBOV (1 m) bzw. ZIKV (ca. 40 nm), von Elektrofahrzeugen bzw. freies Protein. In Bezug auf die großflächige EV-Produktion haben die jüngsten Fortschritte bei filtrationsbasierten Methoden, nämlich tangentiale Strömungsfiltration (TFF), eine effiziente Isolierung von Elektrofahrzeugen von großen Probenvolumina ermöglicht. TFF wurde in der Vergangenheit für die Reinigung von nanoskanischen Biomolekülen, einschließlich Viren, verwendet, und durch die Optimierung von Protokollen wurde dieses System erfolgreich für die Isolierung von Elektrofahrzeugen24,25angepasst. Kurz gesagt, während des TFF-Prozesses fließt Probenflüssigkeit tangential über die Oberfläche einer halbdurchlässigen Membran, die selektiv Vesikel auf der Grundlage von Größe und Molekulargewicht zurückhält, wodurch die Trennung von Elektrofahrzeugen weg von freien Proteinen und anderen kontaminierende Biomoleküle26. Im Vergleich zur Ultrazentrifugation wurde berichtet, dass TFF zu höheren Erträgen, weniger Aggregation führt und die Los-zu-Los-Variabilität von Elektrofahrzeugen27reduziert. Darüber hinaus wurde die Verwendung von TFF für die Good Manufacturing Practice (GMP)-Grade-Isolierung von Elektrofahrzeugen für die therapeutische Anwendung28berichtet. Aufgrund ihrer Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit bietet diese Technologie ein großes Potenzial für die zukünftige EV-Forschung.
Viren gibt es in unterschiedlichen Größen und Dichten, daher kann je nach Virus eine Optimierung dieses Protokolls erforderlich sein. Bei sehr großen Viren wie Ebola (1 m oder größer in der Länge) kann eine einfache Filtration verwendet werden, um die überwiegende Mehrheit der Virionen und großen kontaminierenden Körper wie VLPs und apoptotische Körper14zu entfernen. Dadurch kann der größte Teil der Trennung von Viren von Elektrofahrzeugen am vorderen Ende der Reinigung ausführbar sein. Bei kleineren Viren wie Enterovirus (30 nm), Zika-Virus (40 nm), Hepatitis-B-Virus (42 nm), Hepatitis-C-Virus (55 nm) und anderen muss jedoch die Fraktion bestimmt werden, in der Virionssedimente bestimmt werden müssen, bevor weitere nachgelagerte Analysen. Man kann nicht immer den wahrscheinlichen Sedimentationsanteil allein auf der Grundlage des Partikeldurchmessers annähern. Zum Beispiel ist Poliovirus, das 30 nm im Durchmesser hat, auch bekannt, in sekretoleten Autophagosomen29,30,31,32,33, eingekapselt zu sein und daher wahrscheinlich auf die rechte Seite des Farbverlaufs (dichtere Brüche) und nicht die linke (weniger dichte Brüche). Während wir dieses Protokoll bei HIV-1-, HTLV-1- und EBOV-VLPs optimiert haben, müssen zusätzliche Viren charakterisiert werden, um das Protokoll für ihre spezifische Reinigung afern von Elektrofahrzeugen zu optimieren.
Das hier skizzierte Protokoll (Abbildung 4) ermöglicht es dem Anwender erstmals, Elektrofahrzeuge mit verbesserter Effizienz und kleineren Mengen an Ausgangsmaterial im Vergleich zum Goldstandard der EV-Isolierung, Ultrazentrifugation, von Viren zu trennen. Diese Methode kann leicht an die vorliegenden Bedingungen angepasst werden, einschließlich unterschiedlicher Probengrößen, erforderlicher Erträge, Ausgangsmaterialtyp (d. h. Kulturüberstand im Vergleich zu Patientenmaterial) und verschiedenen Viren unterschiedlicher Größe.
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Disclosures
B.L. ist mit Ceres Nanosciences inc. verbunden, die Reagenzien und/oder Instrumente herstellt, die in diesem Artikel verwendet werden. Alle anderen Autoren erklären keine potenziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir möchten uns bei allen Mitgliedern des Kashanchi-Labors bedanken, insbesondere bei Gwen Cox. Diese Arbeit wurde von national Institutes of Health (NIH) Grants (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 und NS099029 an F.K.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CEM CD4+ Cells | NIH AIDS Reagent Program | 117 | CEM |
| DPBS without Ca and Mg (1x) | Quality Biological | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG precipitation reagent |
| Exosome-Depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
| Fetal Bovine Serum | Peak Serum | PS-FB3 | Serum |
| HIV-1 infected U937 Cells | NIH AIDS Reagent Program | 165 | U1 |
| Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
| Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
| Optima XE-980 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 |
References
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