Summary
该协议通过结合EV沉淀、密度梯度超离和颗粒捕获,将细胞外囊泡(EV)与高效和屈服的病毒分离,从而简化工作流程和减少启动体积要求,导致可重复的制剂用于所有EV研究。
Abstract
当今细胞外囊泡 (EV) 研究领域的主要障碍之一是在病毒感染环境中实现纯化 EV 制剂的能力。提出的方法旨在将EV与病毒分离(即HIV-1),与传统的超离心方法相比,具有更高的效率和产量。我们的协议包含三个步骤:EV沉淀、密度梯度分离和粒子捕获。下游测定(即西斑点和PCR)可以直接在颗粒捕获后运行。此方法比其他隔离方法(即超离心)更有利,因为它允许使用最小起始体积。此外,它比需要多个超离心步骤的替代 EV 隔离方法更便于用户使用。然而,由于很难从粒子中洗去完整的EV,因此所呈现的方法在功能EV测定的范围上受到限制。此外,这种方法是针对严格的基于研究的设定,在商业上不可行。
Introduction
研究围绕细胞外囊泡 (EV), 特别是外显体, 一种 EV 范围 30-120 nm , 其特点是存在三个四边形标记 CD81, CD9 和 CD63, 在很大程度上已经形成的方法, 分离和净化感兴趣的囊泡。解剖多层面机制的能力受到阻碍,因为复杂的和耗时的技术,生成样本组成由异质的囊泡群产生,通过不同的途径产生,内容广泛,大小,和密度。虽然这是几乎所有EV研究的问题,但在在病毒感染环境中研究EV时,它特别重要,因为病毒和病毒样颗粒(VLP)的直径可以与感兴趣的囊泡相似。例如,人类免疫缺陷病毒类型1(HIV-1)的直径约为100纳米,与许多类型的EV大致相同。因此,我们设计了一种新的 EV 隔离工作流来解决这些问题。
目前EV隔离的黄金标准是超离心。该技术利用各种囊泡密度,允许囊泡分离离心与差异沉积的高密度粒子与低密度粒子在每个阶段1,2。需要几个低速离心步骤来去除完整的细胞(300-400 x g 10 分钟)、细胞碎片(±2,000 x g 10 分钟)和凋亡体/大囊泡(10 分钟=10,000 x g)。这些初始纯化后,高速超离心(100,000-2000,000 x g,1.5-2 小时)到沉积物EV。 执行洗涤步骤以进一步确保 EV 纯度,但是,这会导致隔离 EV 的数量减少,从而降低总产量3,4。此方法的效用进一步受到需要大量单元(约 1 x 108)和大样本体积 (> 100 mL) 以达到足够的结果的限制。
为了解决人们日益关注的问题,近年来,用亲水性聚合物沉淀囊泡已成为一种有用的技术。聚乙烯乙二醇 (PEG) 或其他相关的沉淀试剂允许用户通过使用选择的试剂孵育样品,然后以单个低速孵育样品,提取样品中的囊泡、病毒和蛋白质或蛋白质-RNA聚合体离心1,2,5。我们以前曾报道过,使用PEG或相关方法沉淀EV与传统超离心相比,可产生更高的产量6。此策略快速、简单,不需要额外的昂贵设备,易于扩展,并保留了 EV 结构。然而,由于这种方法的混杂性,所得样品含有多种产品,包括游自由蛋白、蛋白质复合物、一系列EV和病毒,因此需要进一步纯化才能获得所需的种群1。 ,2,7,8.
为了克服从各种沉淀方法中获得的EV的异质性,利用密度梯度超离心(DG)来更好地根据粒子的密度分离粒子。此方法使用密度梯度介质(如碘醇或蔗糖)进行逐步梯度,允许将 EV 与蛋白质、蛋白质复合体以及病毒或病毒样颗粒 (VLP) 分离。需要注意的是,虽然人们曾经认为DG允许更精确地分离EV亚群,但现在人们知道,各种囊泡的大小和密度可以重叠。例如,已知外体具有1.08-1.22 g/mL9的浮选密度,而从Golgi(COPI+或克拉林*)分离的囊泡的密度为1.05-1.12 g/mL,而来自内质的色囊密度(COPII=) 沉积物在 1.18-1.25 g/mL1,2,3,4,9.此外,如果希望将外索分数与含有病毒颗粒的馏分进行比较,这可能变得更加困难,具体取决于感兴趣的病毒的密度 - 除了HIV-1之外,还有其他病毒可能同时均衡密度作为外体正分数2。
最后,富集用于下游可视化和功能测定的EV制备对EV研究至关重要。使用EV富集纳米颗粒,特别是直径为700-800nm的多功能水凝胶颗粒,是实现集中式EV制备的关键步骤。它们具有高亲和力芳香诱饵,由多孔外筛壳封装,以促进选择性。本研究中使用的纳米粒子包括两种不同核心诱饵的显性制剂(反应红120 NT80;和Cibacron蓝色F3GA NT82),它们表明可以增加从各种试剂和生物流体中捕获EV(参见材料表))6,10,11,12,13,14,15。这些颗粒从多种起始材料(包括碘化醇馏分、细胞培养上清液以及患者生物流体(如血浆、血清、脑脊髓液 (CSF)和尿液6、13)中轻松浓缩 EV.
本文介绍的方法结合多种技术,提高了现有EV纯化技术的效率;EV 沉淀、密度梯度超离心和颗粒捕获,可简化工作流程、降低样品要求并提高产量,以获得更均匀的 EV 样本,用于所有 EV 研究。该方法在病毒感染期间对EV及其含量的调查特别有用,因为它包括0.22 μm过滤步骤,以排除大、不需要的囊泡和VLP,并根据密度分离总EV人群,以有效将 EV 与病毒隔离开来。
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Protocol
1. 细胞外囊泡(EV)的过滤和沉淀
- 为了从受感染或转染的细胞(即细胞系和/或原细胞)制备培养上清液,在37°C下培养约10 mL的晚日志细胞,在适当的培养培养基(即,RPMI或DMEM,胎儿牛)中培养5天,培养5%的CO2 血清 [FBS])。
注:所有培养介质试剂应不含EV,并可购买(见材料表),或由100,000 x g的血清超前离心在内部制备,90分钟。该协议已经成功地用于几种常用的细胞系,包括:CEM、Jurkat、293T、U937(未感染线)、U1、J1.1、ACH2、HUT102、MT-2(HIV-1和HTLV-1感染线)、多个转粪细胞以及原发性骨髓和T细胞(两者感染和未感染);但是,此协议可用于任何单元格类型,包括需要专用介质或培养条件的单元格类型。细胞密度可能需要针对不同的细胞类型进行优化。建议在5天后使用密度最高的细胞死亡。 - 在 3,000 x g下将培养物离心 5 分钟,以颗粒细胞和丢弃颗粒。
- 使用无菌 0.22 μm 过滤器过滤培养液上清液,并在清洁管中收集滤液。
- 将相同体积的PEG沉淀试剂(1:1比)添加到过滤的上清液中。多次反转管,以确保均匀的混合物。
注:不要涡旋。 - 在4°C过夜(O/N)孵育混合物。
- 在室温 (RT) 下,在 1,500 x g下使用离心混合物 30 分钟,以产生异构 EV 颗粒。
注:EV 颗粒应呈现白色或非白色。 - 丢弃 EV 耗尽区域性上清液。
- 在150~300μL的1倍磷酸盐缓冲盐水中重新悬浮EV颗粒,不含钙和镁(PBS),并保持在冰上。
2. 密度梯度的构造
- 将碘二醇密度梯度介质与1x PBS混合,在单独的微离心管中以1.2%的增量创建11个不同的1mL密度分数,如图1A所示。
- 漩涡每个管混合。
- 层密度分数进入预清洁和干摆动桶超离心管,从分数#18开始,以分数#6结束,如图1B所示。
注:所有管子应使用10%漂白喷雾进行消毒,然后用去离子水冲洗3x,并在装载梯度分数之前最后清洗无菌去离子水。 - 在超离心管的分层梯度顶部添加悬浮的EV颗粒(300 μL)。
- 在 4°C 下 100,00 x g下超离心 90 分钟。
- 小心地从超离心管中取出 1 mL 分数,并将每个分数转移到新的微离心管中。
3. 利用纳米粒子进行EV分数的富集
- 使用等量 NT80、NT82 和 1x PBS 创建 30% 的纳米颗粒浆料。
注:混合物在使用前应涡旋,以确保均匀性。 - 将 30 μL 的浆料添加到每个含有密度分数的微离心管中,并多次移液/反转以混合。
- 在大约 20 rpm 的转速下,在 4°C 下旋转富含 EV 的含纳米颗粒密度分数微离心管 O/N。
- 离心密度微离心管在20,000 x g下,在RT下5分钟。
- 丢弃液体,用 1x PBS 洗洗 EV 颗粒两次。
注:纳米颗粒颗粒可在-20°C冷冻或立即用于各种下游测定(即PCR、西体斑点、质谱和其他测定)。
4. 推荐制备用于下游检测的纳米粒子颗粒
-
用于RNA分离
- 在50 μL的灭菌水中重新悬浮颗粒,用0.001%二乙酰热盐(DEPC)处理,通过0.2 μm过滤器过滤,并根据试剂盒制造商的协议分离RNA。
-
用于凝胶电泳
- 直接在15 μL的莱姆利缓冲液中重新悬浮颗粒。
- 在 95°C 下加热样品 3 倍 3 分钟,在每次热循环之间轻轻旋转涡旋。
- 在 20,000 x g下使用 15 s 的离心样品,将所有洗脱材料直接加载到凝胶上。
注:为获得最佳效果,应限制凝胶上加载的颗粒量,并将凝胶以 100 V 的速度运行,以确保将剩余的颗粒包含在井中。
-
用于胰蛋白酶消化
- 在烷基化和样品胰蛋白化之前,将颗粒重新悬浮在20μL尿素中。纳米粒子可在RT处通过14,000 x g离心进行10分钟的造粒。含有胰蛋白酶化肽的样品可转移到干净的收集管中。
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Representative Results
PEG 降水增加 EV 产量
与传统超离心相比,我们的 EV 隔离组合方法在 EV 回收方面的效率要高得多,所需起始材料体积减少 90%就可见一斑。超中光是EV隔离的现行黄金标准,需要大约100 mL的培养上清液才能为下游检测提供充足的EV准备,而我们的新型协议只需要10 mL。通过使用 PEG EV 沉淀试剂,通过纳米跟踪分析 (NTA) 测量,可显著提高 EV 产量,从而实现这种降低。图2A(先前已经发表于6)中表明,当使用10 mL的培养上上一个定液PEG降水时,可回收7.27 x 1010 EV,比这个数字高出约500倍。使用超离心(1.45 x 108) 从同一起始材料中回收的 EV。外体分离(一种特定的EV亚型)的分离效率提高,也通过特征良好的外体标记蛋白、CD81、CD63和CD9的升高而显现出来。使用PEG沉淀试剂比较超离心或EV沉淀产生的EV预塞的西方污点分析如图2B所示。这些结果表明,CD81 增加了 3,000 倍,CD63 增加了 4 倍,CD9 增加了 40 倍,通过密度测定分析测量。综合起来,这些结果表明,与超离心相比,所述方案不仅提高了总EV产量,而且增强了外用体回收。
EV的特征和EV与HIV-1病毒的分离
为了在纳米粒子富集后每个分数中呈现囊泡,使用概述的议定书从未感染的CEM或HIV-1感染的U1细胞培养上清液中分离出EV,并使用每个成分的西斑进行特征纳米颗粒富集碘二醇部分。图 3A中的数据显示了我们以前发布的结果,这些结果显示每个分数(CEM 单元;顶部面板)中是否存在三个外体四分之一苯二甲苯(CD81、CD63 和 CD9)。结果表明,由分数内所有三个四分之一体的存在所定义的外在体群中,有三种不同的种群:exo #1包括分数10.8-12.0,Exo#2包括分数15.6-16.8,Exo_3包括只有 18.0 分数。尽管存在三个不同的人群,但议定书不能排除在每一部分内存在其他类型的电动汽车的可能性。此外,这些结果没有明确排除这些人群中有囊泡对测试四巴辛标记组合呈阳性的可能性。然后,这些电动汽车可以通过额外的纯化策略进一步分离。
EV/外体研究的迅速发展领域自发现以来呈爆炸式增长,并由此为这些囊泡提供了许多新发现的功能和应用。特别是,它们作为细胞内信使不仅在正常生理学中,而且在疾病中的作用,已导致使用大量资源来解剖细胞外囊,特别是外体体对受体细胞的影响和效用16,17,18.许多研究将EV与各种感染的发病机制有关,包括HIV-16、10、12、19、20、21,22.然而,EV和病毒之间的大小相似性在定义这些EV介导机制方面构成了一个潜在的障碍。为了解决这一问题,我们设计了一个协议来实现密度梯度,以有效地将EV种群与病毒分离。为此,HIV-1感染细胞的细胞培养上清液受到提出的协议,并由西方污点分析HIV-1 Gag p24的存在,以确定哪些分数或分数含有HIV-1病毒。图3A(中面板)所示的结果显示了p24在三个独立条件下的定位:在没有诱导剂的情况下,在诱导剂存在的情况下(Phorbol 12-myristate 13-醋酸盐;PMA),并在PMA和联合抗逆转录病毒疗法(cART)的存在,艾滋病毒-1的标准治疗。这些数据表明,HIV-1病毒局部化为16.8分,以p24及其不洁的多蛋白Pr55的存在来衡量。此外,当细胞受到cART,包括Indinavir,一种蛋白酶抑制剂,防止Pr55到p24的裂解,没有p24在任何分数检测。相反,只检测到Pr55,并且存在于16.8-18.0的馏分中,这表明病毒转移到更密集的分数中。使用主巨噬细胞(下面板)获得类似的结果。虽然上述协议导致Exo#2和Exo#3群病毒的共同沉积,但Exo#1种群(分数10.8-12.0)仍然无病毒,允许下游检测不受病毒污染。
这种类型的病毒分离远离EV使我们能够解决病毒碎片进入EV或从受感染细胞分泌为自由蛋白质的可能性。图3B的结果表明,除了Exo#2和Exo#3种群外,在Exo#1种群中可以找到HIV-1 Nef蛋白。Nef 也出现在 6.0 分数中,表明 Nef 可能从受感染的细胞中作为自由蛋白质和 EV 内分泌。此外,HIV-1 Vpr蛋白在6.0分馏中被发现,而HIV-1 Tat蛋白主要在6.0分馏中,但也以7.2-9.6分分出现。我们目前正在测试ELISA的所有分数是否存在Tat蛋白。这些结果表明,Tat和Vpr都可以从受感染的细胞中分泌,可能是自由蛋白,而Tat也可以被纳入EV。总体而言,这些数据表明,我们的EV分离方法可以成功地分离出外泌体(exo #1)与HIV-1病毒(Exo #2和#3),并且HIV-1感染细胞的EV含有一些HIV-1蛋白质,可能影响HIV-1的发病机制。
EV的特征和EV与其他病毒的分离
为了将该协议应用于其他病毒感染模型,我们从感染了几种不同病毒的细胞中进行了囊泡特征。图3C显示了以前根据所述协议在沉淀、分离和浓缩后获得的囊泡和病毒分布的图示。如上图3A所示,外体体(CD9+ CD63+CD81+)存在于三个不同的种群中(Exo#1,分数10.8-12.0;Exo #2,分数 15.6-16.8,Exo=3,18.0 分数)和 HIV-1 病毒本地化为高密度 16.8 和 18.0 分数(通道 10-11)。毫不奇怪,当应用此协议来描述从人类 T-淋巴病毒类型 1 (HTLV-1) 释放的 EV 时,我们观察到的结果与 HIV-1 相关的 EV 相似,该病毒已知会导致成人癌症。图3C中的第三个面板显示,HTLV-1病毒主要被局部化为密度最高的分数(18.0),在较小程度上,该分数为13.2-16.8,HTLV-1基质蛋白的存在证明了这一点(p19)。此外,我们之前已经发现,HTLV-1转活蛋白,税,这是不存在的HTLV-1病毒,存在于从HTLV-1受感染细胞15,23释放的外体体中。图 3C中的数据显示,Tax 存在于较低密度分数(6.0-12.0)中,其中两个分数已显示包含外体(10.8 和 12.0)。
接下来,我们分别在埃博拉病毒(EBOV)和寨卡病毒(ZIKV)等较大和较小的病毒范围内测试了分离方案,因为HIV-1和HTLV-1病毒都是逆转录病毒,直径非常相似。使用 VLP 作为 EBOV 组装和出口的代理生物安全级别 2 (BSL-2) 模型,我们发现 VLP 长度约为 1 μm,在没有 0.22 μm 过滤(中间面板,图 3C) 的情况下,将 VLP 本地化为最高密度分数 (18.0)。此外,当VP40,EBOV基质蛋白,在高水平表达,它通过几个不同的机制从细胞分泌,导致在每个密度分数中存在VP40,包括那些外泌体被本地化13,14.相比之下,ZIKV病毒比HIV-1病毒小得多,直径约为40nm。图3C底部面板中的代表性图显示了低密度(6.0-8.4)和高密度(15.6-18.0)分数中ZIKV病毒的存在,分别表明存在自由病毒和EV封装病毒。
图 1:构造碘二醇密度梯度。(A) 用于创建每个密度分数(分数 +)的碘二醇和 PBS 的相对量。分数 = 表示每个分数中包含的异丙二醇的百分比。它们的相对密度和在梯度中的放置从最重到最轻。(B) 在超离心管中显示密度分数(6.0-18)的位置(左侧)以及三个EV种群(Exo #1、Exo #2、Exo #3)、Exo样囊泡和蛋白质复合物的位置。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:PEG沉淀试剂提高EV产量。(A) 比较EV回收,EV使用传统的超离心(100,000 x g)或PEG沉淀试剂(孵化比例为1:1)从5 d HIV-1感染单核细胞(U1)培养上清液(10 mL)中分离出来。使用纳米跟踪分析对两种浓缩过程的EV进行分析,以评估德马里诺等人所描述的产生的EV浓度。NTA在技术三重的11个独立位置被测量。蓝色条代表 33 个测量值的平均值 - S.D. 统计显著性是使用双尾学生t-测试确定的;p < 0.001.B. 5天CEM培养上清液的EV使用超离心(UC)或PEG沉淀,然后进行碘酚密度分离。使用 100 mL 的培养上清(Lane 1)进行超中心化,而 PEG 沉淀和随后的碘酚分馏使用 10 mL 的培养上清液(通道 2)。从超离心化中获得的总EV颗粒和PEG/iodixanol分离的10.8个分数被西方污点分析为外体标记蛋白(CD81、CD63和CD9)的存在,以Actin作为对照。为清楚起见,面板 B 中显示了具有相同曝光的相同污点的选定通道。这个数字已由德马里诺等人修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:隔离EV远离病毒。(A) 来自未感染的CEM细胞(顶面板)、HIV-1(Ba-L;MOI:0.01)受感染的U1细胞(+PMA和+cART治疗;中面板)或HIV-1感染的原生巨噬细胞(底面板)在4°C过夜用PEG沉淀试剂孵育。使用碘醇密度梯度将EV分成分数。所有馏分的EV在4°C下使用NT80/82粒子在一夜之间富集。使用西方斑点对CEM纳米颗粒进行了分析,以分析存在外显物标记蛋白CD81、CD63和CD9。U1(PMA和+cART治疗)和HIV-1感染的原发性巨噬细胞分析了HIV-1Gag蛋白(p24和Pr55;分别被克和未结的HIV-1加格多蛋白)和CD63的存在。对布洛特进行探测,寻找作为控件的actin。真正的外体种群(CD81+CD63+CD9=)以红色勾勒。这个数字已被修改从DeMarino,等人6 (B) 五天培养超生从受感染的U1细胞孵育与PEG沉淀试剂在4°C过夜。使用碘醇密度梯度将EV分成分数。所有馏分的EV在4°C下使用NT80/82粒子在一夜之间富集。分数在西方的污点上运行,因为HIV-1 Nef,Vpr和Tat的存在。Actin 被用作控件。真正的外体种群(CD81+CD63+CD9 + CD9+) 以红色勾勒出如先前在 DeMarino 中定义的,等人6 (C) 从四个中具有代表性的 EV 分离配置文件不同的病毒:HIV-1、HTLV-1、EBOV和ZIKV。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:协议工作流。新型工作流程结合了过滤、使用PEG沉淀试剂的EV沉淀、碘醇密度梯度分离和电动汽车纳米颗粒富集等多种技术。该协议的利用将EV与各种病毒分离开来,并为下游检测提供小体积样本,包括qPCR、西斑、质谱法、RNA测序、细胞因子分析、ELISA和基于细胞的检测。这个数字已由德马里诺等人修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
概述的方法允许提高EV产量,并使用联合方法分离病毒从EV中分离出来。相对大量的起始材料(即细胞上清液)可以通过沉淀、DG分离和纳米颗粒富集在EV分离前进行过滤,最终体积为±30 μL,可立即在各种下游测定。纳米粒子富集的使用至关重要,因为与传统超离心相比,这些EV富集纳米粒子已被证明能更有效地捕获囊泡,产生大于或等于1mL培养的囊泡量上清比10 mL的超离心培养上清15。总体而言,所述协议包括几种众所周知的技术的组合,因此应该带来有限的困难。然而,结合EV富集纳米粒子引入了一种新技术,可能需要故障排除和/或修改,以达到理想的结果,这取决于下游的测定或感兴趣的生物目标。我们建议用过滤细胞培养物在一夜之间孵育纳米粒子。如果目标蛋白或相关RNA在模型系统中丰度较低,则可以调整该方案以增加潜伏期,以确保捕获目标。在下游检测中,纳米粒子的利用通常可以通过在每个测定的所需样品缓冲液中重新悬浮颗粒来实现。例如,纳米粒子可以直接悬浮在莱姆利缓冲液中,用于西方斑点分析。然后,捕获的材料应通过加热和涡旋循环更有效地从 SDS 中的纳米粒子中洗脱。为了实现蛋白质的充分分离,应注意限制加入凝胶的纳米颗粒的含量,并且凝胶应运行在大约 100 V 的位,以确保任何剩余的颗粒都包含在孔中。此外,对于低分子量蛋白质的可视化,一夜湿转移可实现最佳结果。虽然使用纳米粒子会导致囊泡种群显著富集,但必须采取额外步骤从颗粒中洗取捕获的材料。此外,材料的洗脱可能会限制 EV 在下游功能检测中的效用,因为许多洗脱缓冲液可能会损害 EV 膜的完整性。还需要进行更多的研究,以设计一种策略,允许在孵化后从纳米粒子中去除完整的囊泡。这些粒子的另一个缺点是目前缺乏表征。该粒子的外壳被设计成排除高分子量分子。但是,粒子对 EV 的特定定位并未发生,因此,下游检测中可能存在许多混淆因素和背景信号。
所述方法主要用于实验室目的。我们最近开发了替代方法,以扩展我们组合方法的能力,以将EV与小规模患者生物流体(如血浆和CSF)分离出来,并大规模进行商业性EV生产。为了在患者材料中分离 EV 免受病毒感染,我们采用了尺寸排除色谱 (SEC) 柱,用于代替密度梯度。这些柱子是有利的,因为它们是一次性的,因此在高密封实验室中是理想的。但是,SEC 列根据大小分离粒子,因此,此类分离仅适用于大型或非常小的病毒,如 EBOV (±1 μm) 或 ZIKV (+40 nm),分别与 EV 分离或分离自由蛋白质。在大规模EV生产方面,基于过滤的方法(即切向流过滤(TFF)的最新进展使得EV能够有效地从大样本量中分离出来。TFF历来用于纯化纳米大小的生物分子,包括病毒,并通过协议的优化,该系统已经成功地适应EV24,25的分离。简单地说,在TFF过程中,样品流体在半渗透膜表面相切地流动,这种膜根据大小和分子量选择性地保留囊泡,从而允许将EV从自由蛋白和其他污染生物分子26。与超离心相比,据报道,TFF能产生更高的产量,更少的聚合,并减少EV27的批次到批次的可变性。此外,28日还报道了将TFF用于治疗性电动汽车的良好制造实践(GMP)级隔离。由于其可扩展性和可重复性,该技术为未来的电动汽车研究提供了巨大的潜力。
病毒有不同的大小和密度,因此,根据相关病毒,可能需要优化此协议。对于埃博拉等非常大的病毒(长度为±1 μm或更大),可以使用简单的过滤来去除绝大多数病毒和大型污染体,如VLP和凋亡体14。这允许在纯化前端将病毒从 EV 中分离出来的大部分可执行。然而,对于较小的病毒,如肠病毒(+30纳米)、寨卡病毒(+40纳米)、乙型肝炎病毒(+42纳米)、丙型肝炎病毒(+55纳米)等,在进一步下游功能之前,需要确定病毒沉积物的成分分析。人们不能总是仅仅根据颗粒直径来估计沉积的可能分数。例如,直径为30纳米的脊髓灰质炎病毒,也已知被封装在分泌的自噬体29、30、31、32、33中,因此很可能在渐变的右侧(密集分数)而不是左侧(密度较小分数)。虽然我们在 HIV-1、HTLV-1 和 EbOV VLP 的情况下优化了该协议,但其他病毒将需要表征来微调协议,以便从 EV 中对其进行特定纯化。
此处概述的协议(图4) 首次允许用户将 EV 与病毒分离,与 EV 隔离、超离心的黄金标准相比,具有更高的效率和更小的起始材料体积。这种方法可以很容易地适应目前的情况,包括不同的样品尺寸、所需产量、起始材料类型(即培养上清液与患者材料)和不同尺寸的各种病毒。
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Disclosures
B.L. 隶属于 Ceres 纳米科学公司,生产本文中使用的试剂和/或仪器。所有其他作者声明没有潜在的利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢卡山奇实验室的所有成员,特别是格温·考克斯。这项工作得到了国家卫生研究院 (NIH) 赠款 (AI078859、 AI074410、 AI127351-01、 AI043894 和 NS099029 到 F.K.) 的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CEM CD4+ Cells | NIH AIDS Reagent Program | 117 | CEM |
DPBS without Ca and Mg (1x) | Quality Biological | 114-057-101 | |
ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG precipitation reagent |
Exosome-Depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
Fetal Bovine Serum | Peak Serum | PS-FB3 | Serum |
HIV-1 infected U937 Cells | NIH AIDS Reagent Program | 165 | U1 |
Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
Optima XE-980 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 |
References
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