本方案通过结合细胞外囊泡（EV）沉淀、密度梯度超速离心和颗粒捕获技术，高效且高得率地将细胞外囊泡与病毒颗粒分离，从而实现简化的操作流程并降低起始样本体积需求，最终获得可重复的细胞外囊泡制备物，适用于所有细胞外囊泡相关研究。
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本文内容
摘要
摘要
目前细胞外囊泡（EV）研究领域的主要难题之一是在病毒感染环境下获得高纯度的EV制备物。本方法旨在将EV与病毒颗粒（如HIV-1）分离，相较于传统的超速离心法，具有更高的效率和得率。我们的实验流程包含三个步骤：EV沉淀、密度梯度分离和颗粒捕获。在完成颗粒捕获后，可直接进行后续检测分析（如蛋白质印迹和PCR）。与其他分离方法（如超速离心法）相比，该方法的优势在于仅需极小的起始样本体积。此外，相较于需要多次超速离心的其他EV分离方法，本方法操作更为简便。然而，该方法在功能性EV检测方面的应用存在一定局限，因为从颗粒上洗脱出完整EV较为困难。此外，该方法主要适用于基础科研环境，尚不具备商业化应用的可行性。
引言
以外泌体（exosome）为代表的细胞外囊泡（EV）研究，主要聚焦于直径在30–120 nm之间、并具有三种四跨膜蛋白标志物CD81、CD9和CD63的EV亚群，其发展在很大程度上依赖于分离和纯化目标囊泡的方法学进步。由于现有技术复杂且耗时，所获得的样本通常包含通过不同途径产生、在内容物、大小和密度上具有高度异质性的囊泡群体，从而限制了对多层面机制的深入解析。尽管这一问题几乎影响所有EV研究，但在病毒感染背景下研究EV时尤为关键，因为病毒颗粒（virion）和病毒样颗粒（VLP）的直径可能与目标囊泡相近。例如，人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的直径约为100 nm，与多种EV的尺寸大致相同。鉴于此，我们设计了一种新型的EV分离流程，以解决上述问题。
目前细胞外囊泡（EV）分离的金标准是超速离心法。该技术利用不同囊泡的密度差异，通过差速离心使高密度颗粒与低密度颗粒在各阶段发生差异性沉降，从而实现分离1,2。该方法需要经过多个低速离心步骤，以去除完整细胞（300–400 × g，10 分钟）、细胞碎片（约 2,000 × g，10 分钟）以及凋亡小体/大囊泡（约 10,000 × g，10 分钟）。初步纯化后，再通过高速超速离心（100,000–200,000 × g，1.5–2 小时）使E....
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方案
1. 细胞外囊泡（EVs）的过滤与沉淀
- 为制备感染或转染细胞（即细胞系和/或原代细胞）的培养上清液，将约10 mL处于对数生长后期的细胞在适当的培养基（如含10%胎牛血清[FBS]的RPMI或DMEM）中，于37 °C、5% CO2条件下培养5天。
注意：所有培养基试剂应无细胞外囊泡（EV）污染，可直接购买（参见材料表），或通过在100,000 × g条件下预先超速离心血清90分钟自制。本方案已成功应用于多种常用细胞系，包括：CEM、Jurkat、293T、U937（未感染细胞系），U1、J1.1、ACH2、HUT102、MT-2（HIV-1和HTLV-1感染细胞系），多种转染细胞，以及原代髓系细胞和T细胞（感染与未感染状态）；然而，该方案亦可用于任何细胞类型，包括需要特殊培养基或培养条件的细胞。不同细胞类型的细胞密度可能需要优化。建议在培养5天后使用尽可能高的细胞密度，同时保持最低程度的细胞死亡。 - 将培养物在3,000 × g条件下离心5分钟以沉淀细胞，并弃去细胞沉淀。
- 使用无菌0.22 µm滤器过滤培养上清液，并将滤液收集至洁净离心管中。
- 向滤过的上清液中加入等体积的聚乙二醇（PEG）沉淀试剂（1:1比例），反复倒置离心管数次以确保混合均匀。
注意：切勿....
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结果
PEG 沉淀可提高细胞外囊泡（EV）的得率
与传统的超速离心法相比，我们采用的联合分离方法在EV回收效率方面显著更高，这一点从所需起始材料体积减少了90%即可明显看出。目前EV分离的金标准——超速离心法，通常需要约100 mL的培养上清液才能制备出足够用于下游检测的EV样品，而我们的新方案仅需10 mL。这一显著减少得以实现，主要得益于使用了PEG EV沉淀试剂，通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）测定，该试剂可显著提高EV的产量。如图2A所示的结果（此前已发表6）表明，使用10 mL培养上清液时，PEG沉淀法可回收7.27 × 1010个EV，约为使用相同起始材料进行超速离心法所回收EV数量（1.45 × 108）的500倍。在特定EV亚型——外泌体（exosome）的分离效率方面也观察到了提升，表现为特征明确的外泌体标志蛋白CD81、CD63和CD9的水平显著升高。采用Western.......
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讨论
本方案通过联合分离方法，可提高细胞外囊泡（EV）的得率，并实现病毒与EV的有效分离。在进行沉淀法EV分离、密度梯度（DG）分离及纳米颗粒富集之前，可对相对大量的起始材料（即细胞上清液）进行过滤处理，最终获得约30 µL的浓缩体积，便于直接用于多种下游检测。采用纳米颗粒富集步骤至关重要，因为与传统的超速离心法相比，这些EV富集型纳米颗粒已被证明能更高效地捕获囊泡，从1 mL培养上清液中获得的囊泡数量至少相当于10 mL经超速离心处理的培养上清液所得囊泡量15。总体而言，本方案整合了多种成熟技术，因此操作难度较低。然而，引入EV富集纳米颗粒属于较新的技术，可能需要根据具体的下游检测或研究的生物学靶标进行故障排查和/或方法优化。我们建议将纳米颗粒与过滤后的细胞培养上清液在4℃孵育过夜。若目标蛋白或RNA在模型系统中丰度较低，可适当延长孵育时间以确保充分捕获目标分子。在下游检测中使用纳米颗粒时，通常可通过将沉淀重悬于各检测所需的样品缓冲液中实现。例如，纳米颗粒可直接重悬于Laemmli缓冲液中用于Western blot分析。为更有效地将捕获物质从纳米颗粒中洗脱出来，建议通过加热和涡旋震荡循环促进.......
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披露
B.L. 与中国台湾的 Ceres Nanosciences 公司有关联，该公司生产本文所使用的试剂和/或仪器。其他所有作者均声明不存在潜在的利益冲突。
致谢
我们感谢Kashanchi实验室的所有成员，特别是Gwen Cox。本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金（项目编号：AI078859、AI074410、AI127351-01、AI043894和NS099029，授予F.K.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CEM CD4+ 细胞 | NIH 艾滋病试剂计划 | 117 | CEM |
| 不含 Ca 和 Mg 的 DPBS (1x) | Quality Biological | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG 沉淀试剂 |
| 外泌体耗竭型胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
| 胎牛血清 | Peak Serum | PS-FB3 | 血清 |
| HIV-1 感染的 U937 细胞 | NIH 艾滋病试剂计划 | 165 | U1 |
| Nalgene 注射器滤器 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 核心 |
| Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA 核心 |
| Optima XE-980 超速离心机 | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep 密度梯度介质 | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | 碘克沙醇 |
| SW 41 Ti 摆桶转子 | Beckman Coulter | 331362 | |
| 超透明离心管，14 mm × 89 mm | Beckman Coulter | 344059 |
参考文献
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P.
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重印与许可
