Summary
Denne protokollen isolerer ekstracellulære blemmer (EV-er) unna virions med høy effektivitet og utbytte ved å innlemme EV nedbør, tetthet gradient ultracentrifugation, og partikkel fangst for å muliggjøre en strømlinjeformet arbeidsflyt og en reduksjon av Start volum krav, noe som resulterer i reproduserbar forberedelser til bruk i all EV forskning.
Abstract
En av de store hekk innen ekstracellulære vesicle (EV) forskning i dag er evnen til å oppnå renset EV forberedelser i en viral infeksjon innstilling. Den presenterte metoden er ment å isolere EV ' r bort fra virions (dvs. HIV-1), noe som åpner for en høyere effektivitet og utbytte sammenlignet med konvensjonelle ultracentrifugation metoder. Vår protokoll inneholder tre trinn: EV nedbør, tetthet gradient separasjon, og partikkel fangst. Nedstrøms analyser (f.eks. Western Blot og PCR) kan kjøres direkte etter partikkel fangst. Denne metoden er fordelaktig fremfor andre isolasjons metoder (dvs. ultracentrifugation) som det gir mulighet for bruk av minimale Start volumer. Videre er det mer brukervennlig enn alternative EV isolasjons metoder som krever flere ultracentrifugation trinn. Den presenterte metoden er imidlertid begrenset i sitt omfang av funksjonelle EV-analyser, da det er vanskelig å eluere intakte el-biler fra våre partikler. Videre er denne metoden skreddersydd mot en strengt forskning-basert innstilling og ville ikke være kommersielt levedyktig.
Introduction
Forskning sentrert rundt ekstracellulære blemmer (EV), spesielt exosomes, en type EV spenner 30-120 NM og preget av tilstedeværelsen av tre tetraspanin markører CD81, CD9, og CD63, har i stor grad blitt formet av utviklingen av metoder for å isolere og rense blemmer av interesse. Evnen å analysere mangesidig mekanismer har blitt hindret på grunn av komplekse og tidkrevende teknikker som genererer prøver bestående av en heterogen befolkning av blemmer generert via ulike trasé med et bredt spekter av innhold, størrelser, og Tettheter. Selv om dette er et problem for nesten alle EV forskning, er det av særlig betydning når man studerer EV ' er i sammenheng med viral infeksjon, som virions og virus-lignende partikler (VLPs) kan være lik i diameter til blemmer av interesse. For eksempel, humant immunsvikt virus type 1 (HIV-1) er ca 100 NM i diameter, som er omtrent samme størrelse som mange typer av EV ' er. Derfor har vi utviklet en ny EV-isolasjons arbeidsflyt for å løse disse problemene.
Den nåværende gullstandarden for EV-isolering er ultracentrifugation. Denne teknikken gjør bruk av de ulike vesicle tettheten, som gjør at blemmer å bli separert av sentrifugering med differensial sedimentering av høyere tetthet partikler versus lavere tetthet partikler på hver etappe 1,2. Flere lav hastighet sentrifugering trinn er nødvendig for å fjerne intakte celler (300-400 x g i 10 min), celle rusk (~ 2 000 x g i 10 min), og apoptotisk organer/store blemmer (~ 10 000 x g i 10 min). Disse innledende renselser etterfølges av høyhastighets ultracentrifugation (100000-200000 x g for 1,5-2 h) til sediment EV-biler. Vasketrinn utføres for å ytterligere sikre EV renhet, men dette resulterer i reduksjon av antall isolerte el-biler, og dermed senke total yield 3,4. Denne metoden ' s nytte er ytterligere begrenset av kravet om et stort antall celler (ca 1 x 108) og et stort utvalg volum (≫ 100 ml) for å oppnå tilstrekkelige resultater.
For å møte de økende bekymringene, har utfelling av blemmer med hydrofile polymerer blitt en nyttig teknikk de siste årene. Polyetylen glykol (PEG), eller andre relaterte nedbør reagenser, gjør det mulig for brukeren å trekke ned blemmer, virus og protein eller protein-RNA-aggregater i en prøve ved å incubating prøven med reagens av valget, etterfulgt av en enkelt lav hastighet sentrifugering1,2,5. Vi har tidligere rapportert at bruk av PEG eller relaterte metoder for å fremskynde EV ' s i forhold til tradisjonelle ultracentrifugation resultater i en betydelig høyere avkastning6. Denne strategien er rask, enkel, krever ikke ekstra kostbart utstyr, er lett skalerbar, og beholder EV struktur. På grunn av den tilfeldige karakteren til denne metoden, inneholder de resulterende prøvene en rekke produkter, inkludert frie proteiner, protein komplekser, en rekke av EV ' r, og virions som dermed krever ytterligere rensing for å oppnå ønsket befolkning1 ,2,7,8.
For å overvinne heterogenitet av EV ' er innhentet fra ulike utfelling metoder, er tetthet gradient ultracentrifugation (DG) benyttet for å bedre separate partikler basert på deres tetthet. Denne metoden utføres ved hjelp av en trinnvis gradering ved hjelp av en tetthet gradient medium, for eksempel iodixanol eller sukrose, som gjør det mulig for separasjon av EV ' r fra proteiner, protein komplekser, og virus eller virus-lignende partikler (VLPs). Det er viktig å merke seg at mens det en gang var antatt at DG tillot mer presis separasjon av EV-subpopulasjoner, er det nå kjent at størrelser og tetthet av ulike blemmer kan overlappe hverandre. For eksempel er exosomes kjent for å ha flyte tettheten av 1.08-1.22 g/mL9, mens blemmer isolert fra GOLGI (COPI+ or clathrin+) har tettheten av 1.05-1.12 g/ml og de fra endoplasmatiske retikulum (COPII+ ) sediment ved 1.18-1,25 g/ml1,2,3,4,9. I tillegg, hvis man ønsker å sammenligne exosomal fraksjoner mot fraksjoner som inneholder virale partikler, kan dette bli vanskeligere avhengig av tettheten av viruset av interesse-det er virus enn HIV-1 som trolig likevekt på samme tetthet som exosomal positive fraksjoner2.
Til slutt er berikelse av EV-forbereder for nedstrøms visualisering og funksjonelle analyser avgjørende for EV-forskning. Bruken av EV-berikende nanopartikler, spesielt, multi-funksjonelle hydrogel partikler som spenner 700-800 NM i diameter, er et kritisk skritt for å oppnå konsentrert EV forbereder. De har en høy affinitet aromatiske agn som innkapslet av en porøs ytre sikt skall å fremme selektivitet. Nanopartikler som benyttes i denne studien omfatter to forskjellige preparater med ulike kjerne agn (reaktiv rød 120 NT80; og Cibacron Blue F3GA NT82) som har vist å øke fangst av EV ' r fra ulike reagenser og biofluids (se tabell over materialer )6,10,11,12,13,14,15. Partiklene tilbyr enkel berikelse av EV ' r fra mange start materialer, inkludert iodixanol fraksjoner, cellekultur supernatanten, samt pasient biofluids som plasma, serum, cerebral spinal væsker (CSF) og urin6,13 .
Metoden som presenteres her forbedrer effektiviteten av dagens EV rensing teknikker ved å kombinere flere teknologier; EV nedbør, tetthet gradient ultracentrifugation, og partikkel fangst, for å effektivisere arbeidsflyten, redusere prøve krav, og øke avkastningen for å få en mer homogen EV prøve for bruk i all EV forskning. Denne metoden er spesielt nyttig i etterforskningen av EV ' r og deres innhold under viral infeksjon som inkluderer en 0,22 μm filtrerings trinn for å utelukke store, uønskede blemmer og VLPs og separasjon av den totale EV befolkningen basert på tetthet til effektivt isolere EV ' r fra virions.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. filtrering og utfelling av ekstracellulære blemmer (EV)
- For å forberede kulturen supernatanten fra infiserte eller transfekterte celler (dvs. cellelinjer og/eller primære celler), kultur ca 10 mL av sen-log celler i 5 dager ved 37 ° c og 5% CO2 i passende kultur medium (dvs. RPMI eller DMEM med 10% fosterets storfe serum [FBS]).
Merk: Alle kultur medium reagenser skal være fri for EV ' r, og kan enten kjøpes (se tabell over materialer) eller tilberedes internt ved ultracentrifugation av serum ved 100 000 x g for 90 min. Denne protokollen har vært vellykket for flere ofte brukte cellelinjer inkludert: CEM, Jurkat, 293T, U937 (infisert linjer), U1, J 1.1, ACH2, HUT102, MT-2 (HIV-1 og HTLV-1 infiserte linjer), flere transfekterte celler, og primære myelogen og T-celler (begge smittet og infisert); denne protokollen kan imidlertid brukes for en hvilken som helst celle type, inkludert de som krever spesialiserte medier eller kultur forhold. Tettheten av celler må kanskje optimaliseres for ulike celletyper. Det anbefales at den høyeste tettheten brukes med minimal celle død etter 5 dager. - Sentrifuger kulturen på 3 000 x g for 5 min til pellet celler og forkaste pellet.
- Filtrer kultur supernatanten ved hjelp av et sterilt 0,22 μm filter og samle Filtrer i et rent rør.
- Legg like volum av PEG nedbør reagens (1:1 ratio) til filtrert supernatanten. Inverter rør flere ganger for å sikre en homogen blanding.
Merk: Ikke Vortex. - Ruge blanding ved 4 ° c over natten (O/N).
- Sentrifuge blandingen ved 1 500 x g i 30 min ved romtemperatur (RT) for å gi en heterogen EV-pellet.
Merk: EV pellet skal vises hvit eller off-White i fargen. - Kast den EV-utarmet kultur supernatanten.
- Resuspend EV pellet i 150 – 300 μL av 1x fosfat-bufret saltvann uten kalsium og magnesium (PBS) og holde på isen.
2. bygging av en tetthet gradient
- Bland iodixanol tetthet gradient medium med 1x PBS å lage 11 forskjellige 1 mL tetthet fraksjoner 6 til 18% iodixanol i 1,2% trinn i separate mikrosentrifugen rør som vist i figur 1a.
- Vortex hvert rør å blande.
- Lagtetthet fraksjoner i en pre-rengjort og tørr svingende bøtte ultracentrifuge tube starter med brøk #18 og slutter med brøk #6 som indikert i figur 1B.
Merk: Alle rør skal bli renovert ved hjelp av en 10% blekemiddel spray etterfulgt av etterfulgt av skylling 3x med deionisert vann og en endelig vask av sterilt deionisert vann før lasting av gradient fraksjoner. - Tilsett resuspendert EV-pellet (300 μL) til toppen av den lagdelte graderingen i ultracentrifuge røret.
- Ultracentrifuge ved 100, 00 x g ved 4 ° c i 90 min.
- Fjern forsiktig 1 mL fraksjoner fra ultracentrifuge røret og overføre hver brøk i nye mikrosentrifugen rør.
3. berikelse av EV fraksjoner Bbruke nanopartikler
- Lag en 30% slurry av nanopartikler ved hjelp av like volumer på NT80, NT82 og 1x PBS.
Merk: Blandingen skal blåste før bruk for å sikre homogenitet. - Tilsett 30 μL av slurry til hvert mikrosentrifugen rør som inneholder tettheten fraksjoner og pipette/invertere dem flere ganger for å blande.
- Roter EV-berikende nanopartikkel som inneholder tetthet brøk mikrosentrifugen rør O/N ved 4 ° c ved ca 20 RPM.
- Sentrifuge tetthet brøk mikrosentrifugen rør på 20 000 x g i 5 min ved RT.
- Kast væsken og vask EV-pellet to ganger med 1x PBS.
Merk: Nanopartikkel pellets kan fryses ved-20 ° c eller umiddelbart brukes til ulike nedstrøms analyser (dvs. PCR, Western Blot, masse massespektrometri, og andre analyser).
4. anbefalt tilberedning av Nanopartikkel pellet for nedstrøms analyser
-
For RNA-isolasjon
- Resuspend pellet i 50, μL av autoklaveres deionisert vann behandlet med 0,001% dietyl pyrocarbonate (DEPC) filtrert gjennom et 0,2 μm filter og isolere RNA i henhold til Kit produsentens protokoll.
-
For gel-elektroforese
- Resuspend pellet direkte i 15 μL av Laemmli buffer.
- Varme prøve 3x ved 95 ° c i 3 min. Vortex forsiktig og spinn ned mellom hver varme syklus.
- Sentrifuger prøve for 15 s ved 20 000 x g og Last alt eluert materiale direkte på gelen.
Merk: for best resultat, Begrens mengden partikler som er lastet på gelen og Kjør gelen på 100 V for å sikre at eventuelle gjenværende partikler er inneholdt til brønnene.
-
For Trypsin fordøyelsen
- Resuspend pellet i 20 μL av urea før alkylation og trypsinization av prøven. Nanopartikler kan pelleted med en 14 000 x g SENTRIFUGERING ved RT i 10 min. eksempel inneholder trypsinized peptid kan overføres til en ren samling tube.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PEG nedbør øker EV yield
Vår kombinasjon tilnærming til EV isolasjon er betydelig mer effektiv i forhold til EV utvinning i forhold til tradisjonelle ultracentrifugation, som tydelig av 90% reduksjon i volumet av Start materialet som kreves. Ultracentrifugation, den nåværende gullstandarden i EV-isolasjon, krever omtrent 100 mL kultur supernatanten for å produsere en tilstrekkelig EV-prep for nedstrøms analyser, mens vår nye protokoll bare krever 10 mL. Denne reduksjonen er gjort mulig gjennom bruk av PEG EV utfelling reagens som gir en betydelig økning i EV yield målt ved nanotracking analyse (NTA). Resultatene i figur 2a, som tidligere har blitt utgitt6, tyder på at når du bruker 10 ml kultur supernatanten Peg nedbør resulterte i utvinningen av 7,27 x 1010 EV ' r, som var ca 500-fold mer enn antall fra det samme Start materialet ved hjelp av ultracentrifugation (1,45 x 108). Økt effektivitet av isolering av exosomes, en bestemt EV under type, ble også observert som tydelig av økte nivåer av godt preget exosome markør proteiner, CD81, CD63 og CD9. Western Blot-analyse som sammenligner EV-forbereder produsert enten fra ultracentrifugation eller EV-utfelling ved bruk av en PEG-utfelling reagens, vises i figur 2b. Disse resultatene viser en 3 000-fold økning i CD81, en 4-fold økning i CD63, og en 40-fold økning i CD9 målt ved densitometri analyse. Til sammen tyder disse resultatene på at den skisserte protokollen ikke bare øker den totale EV-avkastningen, men også øker utvinningen av exosomes sammenlignet med ultracentrifugation.
Karakterisering av EV-er og separasjon av EV ' r bort fra HIV-1-viruset
For å karakterisere blemmer til stede i hver brøkdel etter nanopartikkel berikelse, var EV-er isolert fra infisert CEM eller HIV-1 smittet U1 cellekultur supernatanten bruker skissert protokollen og preget ved hjelp av Western Blot av hver nanopartikkel-beriket iodixanol brøkdel. Dataene i figur 3a viser våre tidligere publiserte resultater som viser tilstedeværelse eller fravær av tre exosomal TETRASPANINS (CD81, CD63, og CD9) i hver brøk (Cem celler; øverste panel). Resultatene tyder på at exosomes, som definert av tilstedeværelsen av alle tre tetraspanins innenfor fraksjonen, finnes i tre forskjellige populasjoner: EXO #1 som inkluderer fraksjoner 10.8-12.0, EXO #2 som inkluderer fraksjoner 15.6-16.8, og EXO # 3 som inkluderer bare 18,0 brøkdel. Til tross for tilstedeværelsen av tre forskjellige populasjoner, kan ikke protokollen utelukke muligheten for tilstedeværelsen av flere typer av EV ' r innenfor hver brøkdel. Videre, disse resultatene ikke definitivt utelukke muligheten for at det er blemmer i disse populasjoner som er positive for en kombinasjon av de testede tetraspanin markører. Disse EV ' r kan deretter skilles ytterligere ved ytterligere rensing strategier.
Den raskt voksende feltet EV/exosome forskning har eksplodert siden oppdagelsen deres og har resultert i mange nye funksjoner og programmer for disse blemmer. Spesielt deres rolle som intracellulære budbringere i ikke bare normal fysiologi, men også i sykdom har ført til bruk av betydelige ressurser til å analysere effekter og nytten av ekstracellulære blemmer, spesielt exosomes, på mottaker celler16 , 17 i , 18. Tallrike studier har innblandet EV-er i patogenesen av en rekke infeksjoner, inkludert HIV-16,10,12,19,20,21 , 22. men størrelsen likheten mellom EV-er og virions presenterer en potensiell hindring i å definere disse EV-mediert mekanismer. For å møte denne bekymringen, har vi designet vår protokoll for å implementere en tetthet gradient å effektivt skille EV populasjoner fra virions. For dette formål, cellekultur supernatanten fra HIV-1 infiserte celler ble utsatt for den presenterte protokollen og analysert av Western Blot for tilstedeværelsen av HIV-1 gag p24 å avgjøre hvilke brøkdeler eller fraksjoner inneholdt HIV-1 virions. Resultatene vist i figur 3a (midtre panel) viser lokalisering av p24 i tre selvstendige forhold: i fravær av en induser, i nærvær av en induser (Phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetate; PMA), og i nærvær av PMA og kombinasjons antiretroviral behandling (cART), standard behandling for HIV-1. Disse dataene tyder på at HIV-1-viruset er lokalisert til brøk 16,8 målt ved tilstedeværelsen av p24 og dens uncleaved polyprotein Pr55. Videre, når cellene er utsatt for cART, som inkluderer Indinavir, en protease inhibitor som hindrer kløften av Pr55 til p24, ingen p24 ble oppdaget i noen brøk. I stedet bare Pr55 ble oppdaget og var til stede i 16.8-18.0 fraksjoner, noe som indikerer et skifte av virus i mer tette fraksjoner. Lignende resultater ble innhentet ved hjelp av primære makrofager (nedre panel). Selv om den beskrevne protokollen resulterer i sedimentering av EXO #2 og EXO #3 populasjoner med virus, forble EXO #1 befolkning (fraksjoner 10.8-12.0) virus-fri, noe som åpner for nedstrøms analyser uten virus forurensning.
Denne typen separasjon av virus fra EV ' r gir oss mulighet til å ta opp muligheten for at virus biter kommer inn i EV ' r eller utskilles fra infiserte celler som gratis protein. Resultater i figur 3b tyder på at HIV-1 NEF protein kan bli funnet i EXO #1 befolkning i tillegg til EXO #2 og EXO #3 populasjoner. NEF vises også i 6,0 brøkdel, noe som indikerer at NEF kan potensielt skilles ut fra infiserte celler som et fritt protein og innenfor en EV. I tillegg HIV-1 Vpr protein er funnet i 6,0 brøkdel mens HIV-1 TAT protein er overveiende funnet i 6,0 brøkdel, men også vises i fraksjoner 7.2-9.6. Vi tester for tiden alle fraksjoner for tilstedeværelsen av TAT protein av ELISA. Disse resultatene tyder på at både TAT og Vpr kan skilles ut fra infiserte celler, sannsynligvis som frie proteiner, mens TAT kan også innlemmes i EV ' r. Disse dataene tyder samlet på at vår metode for EV-isolasjon kan isolere exosomes (EXO #1) bort fra HIV-1-virions (EXO #2 og #3), og at el-biler fra HIV-1-infiserte celler inneholder noen HIV-1-proteiner, som kan påvirke HIV-1-patogenesen.
Karakteristikk av EV-er og separasjon av EV ' r bort fra andre virus
For å bruke denne protokollen til andre viral infeksjon modeller, har vi preget blemmer fra celler infisert med flere forskjellige virus. Figur 3c viser en illustrasjon av tidligere innhentet vesicle og virus distribusjoner følgende nedbør, separasjon, og berikelse i henhold til den beskrevne protokollen. Som tidligere vist i figur 3a, EXOSOMES (CD9+CD63+CD81+) er til stede i tre forskjellige populasjoner (EXO #1, fraksjoner 10.8-12.0; EXO #2, fraksjoner 15.6-16.8, og EXO # 3, 18,0 brøkdel) og HIV-1 virus lokaliseres til høyere tetthet 16,8 og 18,0 fraksjoner (baner 10-11). Ikke overraskende, når du bruker denne protokollen til å karakterisere EV-er utgitt av Human T-lymfotropt virus type 1 (HTLV-1), en retrovirus som er kjent for å forårsake kreft hos voksne, observerte vi resultater som ligner på HIV-1-relaterte EV ' s. Den tredje panel i fig. 3c viser at HTLV-1-viruset var primært lokalisert til den høyeste tettheten brøkdel (18,0) og, i mindre grad, fraksjoner 13.2-16.8 som dokumentert av tilstedeværelsen av HTLV-1 matrise protein (P19). Videre har vi tidligere funnet at HTLV-1 transactivating protein, skatt, som er fraværende fra HTLV-1 virionet, er til stede i exosomes løslatt fra HTLV-1 infiserte celler15,23. Dataene i figur 3c viser at skatt var til stede i den nedre tettheten fraksjoner (6.0-12.0), hvorav to har vi vist å inneholde exosomes (10,8 og 12,0).
Deretter testet vi isolasjons protokollen i sammenheng med større og mindre virus som Ebola virus (EBOV) og Zika virus (ZIKV), henholdsvis som HIV-1 og HTLV-1 virions er både retroviruses og svært lik i diameter. Bruke VLP som en surrogat biosafety nivå 2 (BSL-2) modell av EBOV montering og exit, fant vi ut at VLP, som er ca 1 μm i lengde, lokaliseres til den høyeste tettheten brøkdel (18,0) i fravær av 0,22 μm filtrering (midtre panel, figur 3c). Videre, når VP40, den EBOV matrise protein, uttrykkes ved høye nivåer, er det skilles ut fra cellen gjennom flere ulike mekanismer som resulterer i nærvær av VP40 i hver tetthet brøkdel, inkludert de som exosomes er lokalisert13 , 14. i kontrast, ZIKV virions er betydelig mindre enn HIV-1 virions, som måler ca 40 nm i diameter. Det representative diagrammet i det nederste panelet i figur 3c viser tilstedeværelsen av ZIKV virions i både lav tetthet (6,0-8.4) og høy tetthet (15,6-18.0) fraksjoner, noe som tyder på tilstedeværelsen av både gratis virus og EV-Encapsulated virus, henholdsvis.
Figur 1: Bygging av en iodixanol tetthet gradient. (A) relative mengder IODIXANOL og PBS benyttet for å skape hver tetthet brøkdel (brøk #). Brøk # betegner prosentandelen av iodixanol som er inkludert i hver brøk. Deres relative tetthet og plassering i graderingen er avbildet fra tyngste til letteste. (B) plassering av tettheten fraksjoner (6.0-18) i ultracentrifuge tube vises (venstre side), samt plasseringen av de tre EV populasjoner (EXO #1, EXO #2, EXO #3), EXO-lignende blemmer, og protein komplekser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Peg nedbør reagens øker EV yield. (A) for å sammenligne EV-gjenoppretting ble EV-er isolert fra 5 d HIV-1-smittet monocytt (U1) Culture supernatanten (10 ml) ved hjelp av tradisjonell ultracentrifugation (100 000 x g) eller Peg nedbør reagens (inkubasjons i et 1:1-forhold). EV ' r fra begge berikelse prosedyrene ble analysert ved hjelp av nanotracking analyse for å vurdere resulterende EV konsentrasjon som beskrevet i DeMarino, et al.6. NTA ble målt ved 11 uavhengige stillinger i teknisk tre eksemplarer. De blå stolpene representerer et gjennomsnitt av de 33 målingene ± S.D. statistisk betydning ble bestemt ved hjelp av en tosidig student t-test; p < 0,001. B. EV ' er fra 5-dagers Cem kultur supernatanten ved hjelp av enten ULTRACENTRIFUGATION (UC) eller Peg nedbør etterfulgt av iodixanol tetthet separasjon. Ultracentrifugation ble utført med 100 mL kultur supernatanten (Lane 1) mens PEG nedbør og påfølgende iodixanol fraksjonering ble utført ved hjelp av 10 mL kultur supernatanten (Lane 2). Den totale EV pellets innhentet fra ultracentrifugation og 10,8 brøkdel fra PEG/iodixanol separasjon ble analysert av Western Blot for tilstedeværelsen av exosomal markør proteiner (CD81, CD63, og CD9) med utgangen som en kontroll. For klarhet, er utvalgte baner fra samme blot med identiske eksponeringer vist i panel B. Dette tallet er endret fra DeMarino, et al.6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: isolering av EV ' r bort fra virus. (A) fem-dagers kultur supernatanter fra infisert Cem celler (top panel), HIV-1 (ba-L; MOI: 0,01) infiserte U1-celler (± PMA og ± cART behandling, midtre panel) eller HIV-1 smittet primære makrofager (nederste panel) ble inkubert med PEG nedbør reagens ved 4 ° c over natten. EV ' r ble delt inn i fraksjoner ved hjelp av en iodixanol tetthets gradering. EV ' r fra alle fraksjoner ble beriket med NT80/82 partikler over natten ved 4 ° c. CEM nanopellets ble analysert ved hjelp av Western Blot for tilstedeværelsen av exosomal markør proteiner CD81, CD63, og CD9. U1 (± PMA og ± cART behandling) og HIV-1 infiserte primære makrofager ble analysert for tilstedeværelsen av HIV-1 gag protein (p24 og Pr55; kløyvde og uncleaved HIV-1 gag polyprotein, henholdsvis), samt CD63. Blots var analysert for utgangen som en kontroll. Sanne exosome populasjoner (CD81+CD63+CD9+) er markert med rødt. Dette tallet er endret fra DeMarino, et al.6 (B) fem-dagers kultur supernatanter fra infiserte U1 celler ble inkubert med Peg nedbør reagens ved 4 ° c over natten. EV ' r ble delt inn i fraksjoner ved hjelp av en iodixanol tetthets gradering. EV ' r fra alle fraksjoner ble beriket med NT80/82 partikler over natten ved 4 ° c. Fraksjoner ble kjørt på en vestlig blot for tilstedeværelsen av HIV-1 NEF, Vpr, og TAT. Utgangen ble brukt som en kontroll. Sanne exosome populasjoner (CD81+CD63+CD9+) er skissert i rødt som tidligere definert i DeMarino, et al.6 (C) representative illustrasjon av tidligere karakterisert EV separasjon profiler fra fire ulike virus: HIV-1, HTLV-1, EBOV og ZIKV. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: protokoll arbeidsflyt. Romanen arbeidsflyten kombinerer flere teknikker inkludert filtrering, EV nedbør ved hjelp av PEG nedbør reagens, iodixanol tetthet gradient separasjon, og nanopartikkel berikelse av EV ' er. Bruken av denne protokollen skiller EV-er fra ulike virus og gir en liten volum prøve for nedstrøms analyser, inkludert qPCR, Western Blot, masse massespektrometri, RNA-sekvenser, cytokin-analyser, ELISA og celle-baserte analyser. Dette tallet er endret fra DeMarino, et al.6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den skisserte metoden gir forbedret EV-utbytte og separasjon av virus fra EV ' r ved hjelp av en kombinasjon tilnærming til isolasjon. Relativt store mengder Start materiale (dvs. celle supernatanten) kan filtreres før EV-isolering av nedbør, DG-separasjon og nanopartikkel berikelse, noe som resulterer i et endelig volum på ~ 30 μL, noe som åpner for umiddelbar bruk i en rekke nedstrøms analyser. Bruken av nanopartikkel berikelse er viktig som, sammenlignet med tradisjonelle ultracentrifugation, disse EV-berikende nanopartikler har vist å fange blemmer mer effektivt, noe som gir en større enn eller lik mengden blemmer fra 1 mL kultur supernatanten sammenlignet med 10 mL ultracentrifuged kultur supernatanten15. Overall, den beskrevne protokollen inkluderer kombinasjonen av flere velkjente teknikker og derfor bør presentere begrensede vanskeligheter. Imidlertid introduserer inkorporering av EV-berikende nanopartikler en ny teknikk som kan kreve feilsøking og/eller modifikasjoner for å oppnå ønskelig resultater avhengig av nedstrøms analysen eller biologisk mål av interesse. Vi anbefaler at nanopartikler blir inkubert med filtrert cellekultur supernatanter over natten. Hvis målet protein eller RNA av interesse er av lav overflod i modell systemet, kan protokollen tilpasses for å øke inkubasjonsperioden for å sikre fangst av målet. Utnyttelse av nanopartikler i nedstrøms analyser kan vanligvis oppnås ved blanding pellet i ønsket prøve buffer for hver analyse. Nanopartikler kan for eksempel resuspendert direkte i Laemmli buffer for Western Blot-analyse. Det innspilte materialet skal da være mer effektivt eluert fra nanopartikler i SDS via oppvarming og virvlingen sykluser. For å oppnå tilstrekkelig separasjon av protein, bør forsiktighet tas for å begrense mengden nanopartikler lastet inn i gelen, og gelen skal kjøres på ca 100 V for å sikre at eventuelle gjenværende partikler er inneholdt til brønnene. Videre, for visualisering av lav molekylvekt proteiner, oppnår en overnatting våt overføring optimale resultater. Selv om bruken av nanopartikler resulterer i betydelig berikelse av vesicle populasjoner, må ytterligere tiltak tas for å eluere fanget materiale fra partiklene. Videre kan eluering av materialet potensielt begrense nytten av EV ' r i nedstrøms funksjonelle analyser, ettersom mange eluering buffere kan skade integriteten til EV-membranen. Ytterligere forskning er nødvendig for å konstruere en strategi for å tillate fjerning av intakt blemmer fra nanopartikler post inkubasjons. En annen ulempe med disse partiklene er den nåværende mangelen på karakterisering. Den ytre skallet av partikkel er designet for å utelukke høy molekylvekt molekyler. Spesifikk målretting av partiklene til EV ' r finner imidlertid ikke sted, og derfor kan mange forvirrende faktorer og bakgrunns signaler potensielt være til stede i nedstrøms analyser.
Den beskrevne metoden er først og fremst brukes til laboratorie formål. Vi har nylig utviklet alternative metoder for å utvide mulighetene i vår kombinasjons tilnærming til ytterligere teknikker for å isolere el-biler fra småskala pasient biofluids som plasma og CSF og kommersiell EV-produksjon i stor skala. For isolering av EV ' r bort fra virus i pasient materiale har vi innarbeidet bruk av størrelse utelukkelse kromatografi (SEC) kolonner, som benyttes i stedet for en tetthet gradient. Disse søylene er nyttige ved at de er disponibel og derfor er ideelle i laboratorier med høy oppsamling. SEC kolonner separate partikler i henhold til størrelse, derfor følger det at denne typen separasjon bare gjelder for separasjon av store eller svært små virus, for eksempel EBOV (~ 1 μm) eller ZIKV (~ 40 nm), henholdsvis fra EV ' r eller separasjon bort fra Gratis protein. Når det gjelder stor skala EV-produksjon, har nylige fremskritt i filtrerings BAS ert metoder, nemlig tangential flyt filtrering (TFF), vært tillatt for effektiv isolering av el-biler fra store prøve volumer. TFF har historisk vært brukt for rensing av nanosized biomolekyler, inkludert virus, og gjennom optimalisering av protokoller dette systemet har blitt tilpasset for isolering av EV24,25. Kort sagt, under TFF prosessen, flyter prøvevæsken tangentially over overflaten av en halvgjennomtrengelig membran som selektivt beholder blemmer basert på størrelse og molekylvekt, og dermed gir for separasjon av EV ' r bort fra frie proteiner og andre forurensende biomolekyler26. Sammenlignet med ultracentrifugation har det blitt rapportert at TFF resulterer i høyere avkastning, mindre aggregering, og reduserer parti-til-parti-variasjon av EV ' r27. I tillegg er bruken av TFF for den gode produksjons praksisen (GMP)-grad isolering av EV ' r for terapeutisk anvendelse også rapportert28. På grunn av sin skalerbarhet og reproduserbarhet, tilbyr denne teknologien et stort potensial for fremtidig EV-forskning.
Virus kommer i forskjellige størrelser og tetthet, derfor avhengig av viruset i spørsmålet, kan optimalisering av denne protokollen være nødvendig. For svært store virus som Ebola (~ 1 μm eller større i lengde), enkel filtrering kan utnyttes til å fjerne de aller fleste virions og store forurensende organer som VLPs og apoptotisk organer14. Dette gjør det mulig for de fleste av separasjon av virus bort fra EV ' r å være kjørbar på fronten av rensing. Men i tilfelle av mindre virus som enterovirus (~ 30 NM), Zika virus (~ 40 nm), hepatitt B-viruset (~ 42 NM), hepatitt C-viruset (~ 55 NM), og andre, fraksjonen der virions sediment må fastsettes før videre nedstrøms funksjonell Analyser. Man kan ikke alltid anslå den sannsynlige brøkdelen av sedimentering basert på partikkel diameter alene. For eksempel, polio virus, som er 30 NM i diameter, er også kjent for å være innkapslet i sekretoriske autophagosomes29,30,31,32,33, og derfor er sannsynlig å bli funnet på høyre side av gradient (tettere fraksjoner) i stedet for venstre (mindre tette fraksjoner). Selv om vi har optimalisert denne protokollen når det gjelder HIV-1, HTLV-1 og EBOV VLPs, vil ytterligere virus trenge karakterisering for å finjustere protokollen for deres spesifikke rensing bort fra EV ' r.
Protokollen skissert her (Figur 4) tillater for første gang brukeren å skille EV ' er fra virus med forbedret effektivitet og mindre volumer av Start materiale i forhold til gullstandarden av EV-isolasjon, ultracentrifugation. Denne metoden kan enkelt tilpasses forholdene på hånden, inkludert varierende utvalgsstørrelser, nødvendige avlinger, start materiale type (dvs. kultur supernatanten versus pasient materiale), og ulike ulike virus av forskjellige størrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bl er tilknyttet Ceres Nanosciences Inc. som produserer reagenser og/eller instrumenter som brukes i denne artikkelen. Alle andre forfattere erklærer ingen potensielle interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke alle medlemmer av Kashanchi Lab, spesielt Gwen Cox. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) Grants (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894, og NS099029 til F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CEM CD4+ Cells | NIH AIDS Reagent Program | 117 | CEM |
| DPBS without Ca and Mg (1x) | Quality Biological | 114-057-101 | |
| ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG precipitation reagent |
| Exosome-Depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
| Fetal Bovine Serum | Peak Serum | PS-FB3 | Serum |
| HIV-1 infected U937 Cells | NIH AIDS Reagent Program | 165 | U1 |
| Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
| Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
| Optima XE-980 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Ultra-Clear Tube, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
- Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
- DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
- Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).
- Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
- Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).
- Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).
- Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
- Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542 (2017).
- Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
- Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).
- Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
- Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
- McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
- Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, Clifton, N.J. 33-41 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).
- Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).
- Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
- Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
- Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).
- Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).
