Presynapse vorming assay met Presynapse Organizer kralen en "neuron Ball" cultuur
Summary
Presynapse vorming is een dynamisch proces, met inbegrip van accumulatie van synaptische eiwitten in de juiste volgorde. Bij deze methode wordt presynapse vorming geactiveerd door kralen geconjugeerd met een presynapse Organizer eiwit op axonale vellen van “neuron Ball” cultuur, zodat accumulatie van synaptische eiwitten gemakkelijk kan worden geanalyseerd tijdens presynapse vorming.
Abstract
Tijdens neuronale ontwikkeling, Synapse vorming is een belangrijke stap voor het vaststellen van neurale circuits. Om synapsen vormen, synaptische eiwitten moeten worden geleverd in de juiste volgorde door transport van cellichamen en/of lokale vertaling in onrijpe synapsen. Echter, het is niet volledig begrepen hoe synaptische eiwitten accumuleren in de synapsen in de juiste volgorde. Hier presenteren we een nieuwe methode om presynaptische vorming te analyseren door gebruik te maken van de combinatie van neuron balcultuur met kralen om presynapse vorming te induceren. Neuron ballen die neuronale celgranulaten bieden axonale vellen ver van cellichamen en dendrites, zodat zwakke fluorescerende signalen van presynapses kunnen worden gedetecteerd door het vermijden van overweldigende signalen van cellichamen. Als kralen om presynapse vorming te triggeren, gebruiken we kralen die worden geconjugeerd met Leucine-rijke herhalings transmembraan neuronale 2 (LRRTM2), een excitatory presynaptische organisator. Met deze methode hebben we aangetoond dat vesiculaire glutamaat Transporter 1 (vGlut1), een Synaptisch blaasje eiwit, dat in presynapses sneller is opgebouwd dan Munc18-1, een actief zone-eiwit. Munc18-1 geaccumuleerde vertaling-afhankelijk van presynapse zelfs na het verwijderen van cellichamen. Deze bevinding geeft de Munc18-1 accumulatie door lokale vertaling in axonen, niet transport van cellichamen. Concluderend, deze methode is geschikt voor het analyseren van accumulatie van synaptische eiwitten in presynapses en de bron van synaptische eiwitten. Als neuron bal cultuur is eenvoudig en het is niet nodig om speciale apparatuur te gebruiken, deze methode kan worden toegepast op andere experimentele platforms.
Introduction
Synapse vorming is een van de kritische stappen tijdens de ontwikkeling van neurale circuits1,2,3. Vorming van synapsen die gespecialiseerde compartimenten zijn samengesteld uit pre-en post synapsen is een complex en meerstaps proces waarbij de juiste herkenning van axonen en dendrites, vorming van actieve zone en postsynaptisch dichtheid, en juiste uitlijning van ion kanalen en neurotransmitter receptoren1,2. In elk proces, vele soorten synaptische eiwitten accumuleren tot deze gespecialiseerde compartimenten in de juiste timing door het vervoeren van synaptische eiwitten uit cellichamen en/of door lokale vertaling in de compartimenten. Deze synaptische eiwitten worden beschouwd als georganiseerd op georganiseerde wijze te vormen functionele synapsen. Dysfunctie van sommige synaptische eiwitten met betrekking tot Synapse vorming resulteert in neurologische aandoeningen4,5. Echter, het blijft onduidelijk hoe synaptische eiwitten accumuleren in de juiste timing.
Om te onderzoeken hoe synaptische eiwitten zich op georganiseerde wijze ophopen, is het noodzakelijk om accumulatie van synaptische eiwitten in chronologische volgorde te onderzoeken. Sommige rapporten toonden Live beeldvorming aan Synapse vorming in de gezien cultuur van neuronen6,7observeren. Het is echter tijdrovend om neuronen te vinden die net Synapse vorming onder microscopie starten. Om accumulatie van synaptische eiwitten efficiënt observeren, Synapse vorming moet beginnen op het moment dat de onderzoekers willen de vorming te induceren. De tweede uitdaging is het onderscheiden van de accumulatie van synaptische eiwitten als gevolg van het transport van cellichamen of lokale vertaling in synapsen. Daartoe moet het Vertaal niveau worden gemeten onder de voorwaarde dat het transport van synaptische eiwitten uit cellichamen niet mogelijk is.
We ontwikkelden nieuwe presynapse formatie assay met behulp van een combinatie van neuron bal cultuur met kralen voor het opwekken van presynapse vorming8. Neuron Ball Culture is ontwikkeld om axonale fenotype te onderzoeken, als gevolg van de vorming van axonale vellen rondom cellichamen9,10. We gebruikten magnetische kralen geconjugeerd met Leucine-rijke herhaalde transmembraan neuronale 2 (LRRTM2) dat is een presynaptische organisator voor het opwekken van excitatory presynapses (Figuur 1a)11,12,13. Door gebruik te maken van de LRRTM2 Beads beginnen presynapse formatie op het moment dat de kralen worden aangebracht. Dit betekent dat presynapse vorming begint in duizenden axonen van een neuron bal op dezelfde tijden, dus het maakt het mogelijk om te onderzoeken precieze tijdsverloop van accumulatie van synaptische eiwitten efficiënt. Bovendien, neuron bal cultuur is gemakkelijk te blokkeren transport synaptische eiwitten uit Soma door het verwijderen van cellichamen (Figuur 1b)8. We hebben al bevestigd dat axonen zonder cellichamen kunnen overleven en ten minste 4 uur gezond zijn na verwijdering van cellichamen. Dus, dit protocol is geschikt om te onderzoeken van waar synaptische eiwitten zijn afgeleid (cel lichaam of Axon), en hoe synaptische eiwitten accumuleren op georganiseerde wijze.
Protocol
Representative Results
Discussion
We ontwikkelden een nieuwe methode om presynapse vorming te onderzoeken gestimuleerd met LRRTM2-kralen met behulp van neuron bal cultuur. Momenteel omvat de meeste presynapse formatie assay poly-D-Lysine (PDL)-gecoate kralen en gezien Culture/microfluïdische kamer20,21,22. Een van de voordelen van deze methode is LRRTM2-Beads. Terwijl LRRTM2 samenwerkt met neurexin te vormen excitatory presynapses specifiek11<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt deels ondersteund door JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) (nr. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). We danken Dr. terukazu Nogi en MS. Makiko neyazaki (Yokohama City University) voor de vriendelijke verstrekking van biotinyleerd LRRTM2 eiwitten. We bedanken ook Honami Uechi en Rie Ishii voor technische assistentie.
Materials
| Antibody diluent | DAKO | S2022 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-585-151 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| mouse anti-Munc18-1 | BD Biosciences | 610336 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Alubumin (BSA) | Nacalai Tesque | 01863-48 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) | Nunc | 176740 | |
| Complete EDTA-free | Roche | 11873580001 | |
| cooled CCD camera | Andor Technology | iXON3 | |
| Coverslip | Matsunami | C015001 | Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Nacalai Tesque | 11034-56 | |
| Deoxyribonuclease 1 (DNase I) | Wako pure chemicals | 047-26771 | |
| Expi293 Expression System | Thermo Fisher Scientific | A14635 | |
| Horse serum | Sigma-Aldrich | H1270 | |
| image acquisition software | Nikon | NIS-element AR | |
| Image analysis software | NIH | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Inverted fluorecent microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Neurobasal media | Thermo Fisher Scientific | #21103-049 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Thermo Fisher Scientific | #143-06561 | |
| N-propyl gallate | Nacalai Tesque | 29303-92 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Paraplast Plus |
Sigma-Aldrich | P3558 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) | Nacalai Tesque | 28359-54 | |
| poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| Prepacked Disposable PD-10 Columns | GE healthcare | 17085101 | |
| rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 | Synaptic Systems | 135-302 | |
| SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) | Nacalai Tesque | 41506-04 | |
| Streptavidin-coated magnetic particles | Spherotech Inc | SVM-40-10 | diameter: 4-5 µm |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Trypsin | Nacalai Tesque | 18172-94 |
References
- Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).
- Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).
- Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).
- Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).
- Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).
- Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. , (2018).
- Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).
- Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. , (2017).
- Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).
- Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).
- Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).
- Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).
- Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).
