Presynapse गठन परख का उपयोग Presynapse आयोजक मोती और "न्यूरॉन बॉल" संस्कृति
Summary
Presynapse गठन उचित क्रम में synaptic प्रोटीन के संचय सहित एक गतिशील प्रक्रिया है. इस विधि में, presynapse गठन मोती द्वारा शुरू होता है “न्यूरॉन गेंद” संस्कृति के axonal शीट पर एक presynapse आयोजक प्रोटीन के साथ संयुग्मी, ताकि synaptic प्रोटीन का संचय presynapse गठन के दौरान विश्लेषण किया जा करने के लिए आसान है.
Abstract
न्यूरोनल विकास के दौरान, synapse गठन तंत्रिका सर्किट स्थापित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. synapses बनाने के लिए, synaptic प्रोटीन सेल निकायों से परिवहन द्वारा उचित क्रम में आपूर्ति की जानी चाहिए और / हालांकि, यह पूरी तरह से समझ में नहीं आता है कि कैसे synaptic प्रोटीन उचित क्रम में synapses में जमा. यहाँ, हम मोती के साथ न्यूरॉन गेंद संस्कृति के संयोजन का उपयोग करके presynaptic गठन का विश्लेषण करने के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तुत presynapse गठन प्रेरित करने के लिए. न्यूरॉन गेंदों कि न्यूरॉन सेल समुच्चय है सेल निकायों और dendrites से दूर axonal चादरें प्रदान करते हैं, ताकि presynapses के कमजोर फ्लोरोसेंट संकेतों सेल निकायों के भारी संकेतों से बचने के द्वारा पता लगाया जा सकता है. presynapse गठन को गति प्रदान करने के लिए मोती के रूप में, हम ल्यूकोइन समृद्ध दोहराने ट्रांसमेम्ब्रेन न्यूरोनल 2 (LRRTM2), एक उत्तेजक presynaptic आयोजक के साथ संयुग्मी मोती का उपयोग करें। इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने दिखा दिया कि vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 1 (vGlut1), एक synaptic vesicle प्रोटीन, munc18-1, एक सक्रिय क्षेत्र प्रोटीन की तुलना में तेजी से presynapses में जमा. Munc18-1 संचित अनुवाद-निर्भर रूप से presynapse में भी कोशिका निकायों को हटाने के बाद. यह निष्कर्ष एक्सॉन्स में स्थानीय अनुवाद द्वारा Munc18-1 संचय को इंगित करता है, कोशिका निकायों से परिवहन नहीं। अंत में, इस विधि presynapses और synaptic प्रोटीन के स्रोत में synaptic प्रोटीन के संचय का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है. न्यूरॉन गेंद संस्कृति सरल है और यह विशेष उपकरण का उपयोग करने के लिए आवश्यक नहीं है के रूप में, इस विधि अन्य प्रयोगात्मक प्लेटफार्मों के लिए लागू हो सकता है.
Introduction
सिनप्स गठन तंत्रिका परिपथ1,2,3के विकास के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम है . सिनैप्स का गठन जो पूर्व और बाद के सिनाप्स से बने विशेष डिब्बों के होते हैं, एक जटिल और बहुचरणी प्रक्रिया है जिसमें एक्सॉन और डेन्ड्राइट की उचित मान्यता, सक्रिय क्षेत्र और पोस्टीनैप्टिक घनत्व का गठन, और उचित संरेखण शामिल है। आयन चैनलों और न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स1,2. प्रत्येक प्रक्रिया में, synaptic प्रोटीन के कई प्रकार के सेल निकायों से synaptic प्रोटीन परिवहन द्वारा उचित समय में इन विशेष डिब्बों में जमा और / इन synaptic प्रोटीन कार्यात्मक synapses फार्म करने के लिए संगठित तरीके से व्यवस्थित किया जा करने के लिए माना जाता है. सिनेप्स गठन से जुड़े कुछ सिनाप्टिक प्रोटीनों के रोग मस्तिष्क संबंधी रोगों में परिणाम4,5. हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि कैसे synaptic प्रोटीन उचित समय में जमा.
कैसे synaptic प्रोटीन संगठित तरीके से जमा की जांच करने के लिए, यह कालानुक्रमिक क्रम में synaptic प्रोटीन के संचय की जांच करने के लिए आवश्यक है. कुछ रिपोर्टों में न्यूरॉन्स6,7की असंबद्ध संस्कृति में synapse गठन का निरीक्षण करने के लिए लाइव इमेजिंग का प्रदर्शन किया गया . हालांकि, यह सिर्फ माइक्रोस्कोपी के तहत synapse गठन शुरू न्यूरॉन्स खोजने के लिए समय लेने वाली है. synaptic प्रोटीन के संचय को कुशलता से निरीक्षण करने के लिए, synapse गठन समय पर शुरू करना चाहिए जब शोधकर्ताओं के गठन के लिए प्रेरित करना चाहते हैं. दूसरी चुनौती कोशिका निकायों या synapses में स्थानीय अनुवाद से परिवहन के कारण synaptic प्रोटीन के संचय भेद करने के लिए है. उस उद्देश्य के लिए, अनुवाद स्तर शर्त है कि कोशिका निकायों से synaptic प्रोटीन के परिवहन की अनुमति नहीं है के तहत मापा जा करने के लिए आवश्यक है.
हमने न्यूरॉन बॉल कल्चर के संयोजन का उपयोग करते हुए न्यूरॉन बॉल कल्चर के संयोजन का उपयोग करते हुए उपन्यास प्रेसिनेप्स गठन परख विकसित की ताकि प्रेसिनाप्स गठन 8 को प्रेरित कियाजासके . कोशिका पिंडोंकेचारों ओर के एक्सोनल शीटों के निर्माण के कारण नौनबाल-संलक्षणी की जांच करने के लिए तंत्रिका बाल संवर्धन विकसित किया गयाहै। हम ल्यूकोइन समृद्ध दोहराने ट्रांसमेम्ब्रेन न्यूरोनल 2 (LRRTM2) के साथ संयुग्मी चुंबकीय मोती का उपयोग किया है कि उत्तेजक presynapses प्रेरित करने के लिए एक presynaptic आयोजक है (चित्र 1A)11,12,13. LRRTM2 मोती का उपयोग करके, presynapse गठन समय पर शुरू जब मोती लागू कर रहे हैं. इसका मतलब यह है कि presynapse गठन एक ही समय में एक न्यूरॉन गेंद के axons के हजारों में शुरू होता है, इस प्रकार यह synaptic प्रोटीन के संचय के सटीक समय पाठ्यक्रम कुशलता से जांच करने के लिए अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त, न्यूरॉन बॉल कल्चर कोशिका निकायों को हटाकर सोमा से परिवहन synaptic प्रोटीन को अवरोधित करना आसान है (चित्र 1B)8. हम पहले से ही पुष्टि की है कि सेल निकायों के बिना axons जीवित रह सकते हैं और सेल निकायों को हटाने के बाद कम से कम 4 एच स्वस्थ हैं. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल जहां synaptic प्रोटीन प्राप्त कर रहे हैं से जांच करने के लिए उपयुक्त है (सेल शरीर या एक्सॉन), और कैसे synaptic प्रोटीन संगठित तरीके से जमा.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम न्यूरॉन गेंद संस्कृति का उपयोग कर LRRTM2-beads के साथ प्रेरित presynapse गठन की जांच करने के लिए उपन्यास विधि विकसित की है। वर्तमान में, अधिकांश presynapse गठन परख में पॉली-डी-लाइसिन (पीडीएल)-कोटित मोती और<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम आंशिक रूप से जेपीएस अनुदान-इन-एड फॉर साइंटिफिक रिसर्च (KAKENHI) (C) (संख्या 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki) द्वारा समर्थित है। हम कृपया biotinylated LRRTM2 प्रोटीन प्रदान करने के लिए डॉ Terukazu Nogi और सुश्री Makiko Neyazaki (योकोहामा सिटी विश्वविद्यालय) धन्यवाद. हम भी तकनीकी सहायता के लिए Honami Uechi और री Ishii धन्यवाद.
Materials
| Antibody diluent | DAKO | S2022 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-585-151 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| mouse anti-Munc18-1 | BD Biosciences | 610336 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Alubumin (BSA) | Nacalai Tesque | 01863-48 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) | Nunc | 176740 | |
| Complete EDTA-free | Roche | 11873580001 | |
| cooled CCD camera | Andor Technology | iXON3 | |
| Coverslip | Matsunami | C015001 | Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Nacalai Tesque | 11034-56 | |
| Deoxyribonuclease 1 (DNase I) | Wako pure chemicals | 047-26771 | |
| Expi293 Expression System | Thermo Fisher Scientific | A14635 | |
| Horse serum | Sigma-Aldrich | H1270 | |
| image acquisition software | Nikon | NIS-element AR | |
| Image analysis software | NIH | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Inverted fluorecent microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Neurobasal media | Thermo Fisher Scientific | #21103-049 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Thermo Fisher Scientific | #143-06561 | |
| N-propyl gallate | Nacalai Tesque | 29303-92 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Paraplast Plus |
Sigma-Aldrich | P3558 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) | Nacalai Tesque | 28359-54 | |
| poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| Prepacked Disposable PD-10 Columns | GE healthcare | 17085101 | |
| rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 | Synaptic Systems | 135-302 | |
| SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) | Nacalai Tesque | 41506-04 | |
| Streptavidin-coated magnetic particles | Spherotech Inc | SVM-40-10 | diameter: 4-5 µm |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Trypsin | Nacalai Tesque | 18172-94 |
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