Presynapse formasjon analysen bruke Presynapse Organizer perler og "Nevron ball" kultur
Summary
Presynapse formasjon er en dynamisk prosess inkludert akkumulering av Synaptic proteiner i riktig rekkefølge. I denne metoden, presynapse formasjon utløses av perler bøyd med en presynapse arrangør protein på axonal ark av “Nevron ball” kultur, slik at opphopning av Synaptic proteiner er lett å bli analysert under presynapse formasjon.
Abstract
Under neuronal utvikling, er synapse formasjon et viktig skritt for å etablere nevrale kretser. For å danne synapser, må Synaptic proteiner leveres i riktig rekkefølge ved transport fra celle organer og/eller lokal oversettelse i umodne synapser. Det er imidlertid ikke fullt ut forstått hvordan Synaptic proteiner akkumuleres i synapser i riktig rekkefølge. Her presenterer vi en ny metode for å analysere presynaptiske nerve formasjon ved hjelp av kombinasjonen av Nevron ball kultur med perler å indusere presynapse formasjon. Nevron baller som er neuronal celle aggregater gir axonal ark langt fra celle organer og dendrites, slik at svake fluorescerende signaler av presynapses kan oppdages ved å unngå overveldende signaler av celle organer. Som perler å utløse presynapse formasjon, bruker vi perler bøyd med leucine-rik gjenta transmembrane neuronal 2 (LRRTM2), en eksitatoriske presynaptiske nerve arrangør. Ved hjelp av denne metoden viste vi at flytande glutamat transporter 1 (vGlut1), en Synaptic vesicle protein, akkumulert i presynapses raskere enn Munc18-1, et aktivt sone protein. Munc18-1 akkumulert oversettelse-sortert i presynapse selv etter fjerning av celle organer. Dette funnet indikerer Munc18-1 akkumulering av lokal oversettelse i axons, ikke transport fra celle organer. Som konklusjon, denne metoden er egnet til å analysere opphopning av Synaptic proteiner i presynapses og kilde til Synaptic proteiner. Som Nevron ball kulturen er enkel og det er ikke nødvendig å bruke spesielle apparater, kan denne metoden være gjeldende for andre eksperimentelle plattformer.
Introduction
Synapse formasjon er en av kritiske skritt under utviklingen av Neural kretser1,2,3. Dannelse av synapser som er spesialiserte rom sammensatt av pre-og post-synapser er en kompleks og flertrinnsprosess som involverer hensiktsmessig anerkjennelse av axons og dendrites, dannelse av aktiv sone og postsynaptic tetthet, og riktig justering av ion-kanaler og signal-reseptorer1,2. I hver prosess, mange typer Synaptic proteiner akkumuleres til disse spesialiserte rom i riktig timing ved å transportere Synaptic proteiner fra celle organer og/eller av lokal oversettelse i avdelingene. Disse Synaptic proteinene anses å være arrangert på organisert måte for å danne funksjonelle synapser. Dysfunksjon av noen Synaptic proteiner som involverer synapse formasjon resulterer i nevrologiske sykdommer4,5. Men det er fortsatt uklart hvordan Synaptic proteiner akkumuleres i riktig timing.
For å undersøke hvordan Synaptic proteiner akkumuleres på organisert måte, er det nødvendig å undersøke akkumulering av Synaptic proteiner i kronologisk rekkefølge. Noen rapporter demonstrerte Live Imaging å observere synapse formasjon i dissosiert kultur av neurons6,7. Det er imidlertid tidkrevende å finne neurons som bare begynner synapse formasjon under mikroskopi. For å observere akkumulering av Synaptic proteiner effektivt, må synapse formasjon starte på den tiden da forskerne ønsker å indusere dannelsen. Den andre utfordringen er å skille akkumulering av Synaptic proteiner på grunn av transport fra celle organer eller lokal oversettelse i synapser. For dette formålet, er oversettelse nivå nødvendig for å bli målt under forutsetning som ikke tillater transport av Synaptic proteiner fra celle organer.
Vi utviklet romanen presynapse formasjon analysen ved hjelp av kombinasjon av Nevron ball kultur med perler å indusere presynapse formasjon8. Nevron ball kultur er utviklet for å undersøke axonal fenotype, på grunn av dannelsen av axonal ark rundt celle organer9,10. Vi brukte magnetiske perler bøyd med leucine-rik gjenta transmembrane neuronal 2 (LRRTM2) som er en presynaptiske nerve arrangør for å indusere eksitatoriske presynapses (figur 1a)11,12,13. Ved å bruke LRRTM2 perler, presynapse formasjon starter på den tiden da perlene påføres. Dette betyr at presynapse formasjon starter i tusenvis av axons av en Nevron ball på samme tid, og dermed gjør det mulig å undersøke presis tid løpet av opphopning av Synaptic proteiner effektivt. I tillegg er Nevron ball kultur lett å blokkere transport Synaptic proteiner fra Soma ved å fjerne celle organer (figur 1B)8. Vi har allerede bekreftet at axons uten celle organer kan overleve og er friske minst 4 h etter fjerning av celle organer. Dermed er denne protokollen egnet til å undersøke hvor Synaptic proteiner er avledet (celle kroppen eller axon), og hvordan Synaptic proteiner akkumuleres på organisert måte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi utviklet romanen metode for å undersøke presynapse formasjon stimulert med LRRTM2-perler bruker Nevron ball kultur. Tiden, de fleste av presynapse formasjon analysen inkluderer Poly-D-lysin (PDL)-belagte perler og dissosiert kultur/mikrovæskebasert kammer20,21,22. En av fordelene med denne metoden er LRRTM2-perler. Mens LRRTM2 samhandler med neurexin å danne eksitatoriske presynapses spesifikt11<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet støttes delvis av JSP Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) (nr. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Vi takker Dr. Terukazu Nogi og MS Hyunmin Neyazaki (Yokohama City University) for vennlig gi biotinylated LRRTM2 protein. Vi takker også Honami Uechi og Rite Ishii for teknisk assistanse.
Materials
| Antibody diluent | DAKO | S2022 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-585-151 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| mouse anti-Munc18-1 | BD Biosciences | 610336 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Alubumin (BSA) | Nacalai Tesque | 01863-48 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) | Nunc | 176740 | |
| Complete EDTA-free | Roche | 11873580001 | |
| cooled CCD camera | Andor Technology | iXON3 | |
| Coverslip | Matsunami | C015001 | Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Nacalai Tesque | 11034-56 | |
| Deoxyribonuclease 1 (DNase I) | Wako pure chemicals | 047-26771 | |
| Expi293 Expression System | Thermo Fisher Scientific | A14635 | |
| Horse serum | Sigma-Aldrich | H1270 | |
| image acquisition software | Nikon | NIS-element AR | |
| Image analysis software | NIH | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Inverted fluorecent microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Neurobasal media | Thermo Fisher Scientific | #21103-049 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Thermo Fisher Scientific | #143-06561 | |
| N-propyl gallate | Nacalai Tesque | 29303-92 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Paraplast Plus |
Sigma-Aldrich | P3558 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) | Nacalai Tesque | 28359-54 | |
| poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| Prepacked Disposable PD-10 Columns | GE healthcare | 17085101 | |
| rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 | Synaptic Systems | 135-302 | |
| SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) | Nacalai Tesque | 41506-04 | |
| Streptavidin-coated magnetic particles | Spherotech Inc | SVM-40-10 | diameter: 4-5 µm |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Trypsin | Nacalai Tesque | 18172-94 |
References
- Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).
- Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).
- Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).
- Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).
- Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).
- Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. , (2018).
- Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).
- Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. , (2017).
- Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).
- Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).
- Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).
- Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).
- Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).
