Införa en gen knockout direkt i Amastigote skede av Trypanosoma cruzi med hjälp av CRISPR/Cas9 systemet
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att introducera en gen knockout i den extracellulära amastigote av Trypanosoma cruzi, med hjälp av CRISPR/Cas9 systemet. Tillväxten fenotyp kan följas upp antingen genom cellräkning av axenic amastigote kultur eller genom spridning av intracellulära amastigotes efter värd cell invasion.
Abstract
Trypanosoma cruzi är en patogena protozoer parasit som orsakar Chagas sjukdom främst i Latinamerika. För att identifiera ett nytt drog mål mot T. cruzi, är det viktigt att validera essentialitet av målgenen i däggdjurs stadiet av parasiten, amastigoten. Amastigotes av T. cruzi replikera inuti värdcellen; Därför är det svårt att genomföra ett knockout-experiment utan att gå igenom andra utvecklingsstadier. Nyligen rapporterade vår grupp en tillväxtvillkor där amastigote kan replikera axenically i upp till 10 dagar utan att förlora sina amastigote-liknande egenskaper. Genom att använda denna temporala axenic amastigote kultur, introducerade vi framgångsrikt gRNAs direkt i Cas9-uttrycker amastigote att orsaka Gene Knockouts och analyserade deras fenotyper uteslutande i amastigote skede. I denna rapport beskriver vi ett detaljerat protokoll för att producera in vitro-härledda extracellulära amastigotes, och att utnyttja axenic kulturen i ett CRISPR/Cas9-medierad knockout experiment. Den tillväxt fenotyp av knockout amastigotes kan utvärderas antingen av cell räkningar av axenic kulturen, eller genom replikering av intracellulära amastigote efter värd cell invasion. Denna metod kringgår parasiten skede differentiering normalt involverade i att producera en transgen eller en knockout amastigote. Utnyttjandet av den temporala axeniska amastigote kulturen har potential att utöka den experimentella friheten av scenspecifika studier i T. cruzi.
Introduction
Trypanosoma cruzi är smittämnet av Chagas sjukdom, som är förhärskande främst i Latinamerika1. T. cruzi har distinkta livscykelstadier som färdas mellan en insekt vektor och en däggdjurs värd2. T. cruzi replikerar som en epimastigote i midgut av en blodsugande triatomine bugg och skiljer sig till en smittsam metacyklisk trypomastigote i hindgut innan de deponeras på en människa eller djur värd. När trypomastigote hamnar i den mottagande kroppen genom bettet webbplats eller genom en slemhinna, invaderar parasiten en värd cell och förvandlas till en flagella-mindre runda form kallas en amastigote. Den amastigote replikat inom värdcellen och så småningom differentierar till trypomastigote, som spricker ut ur värdcellen och går in i blodet för att infektera en annan värd cell.
Eftersom för närvarande tillgängliga kemoterapeutiska medel, benznidazol och nifurtimox, orsaka negativa biverkningar och är ineffektiva i den kroniska fasen av sjukdomen3, det är av ett stort intresse att identifiera nya läkemedel mål mot T. cruzi. Under de senaste åren har CRISPR/Cas9-systemet blivit ett kraftfullt verktyg för att effektivt utföra genknockout i T. cruzi, antingen genom överföring av separata eller enstaka plasmid (s) som innehåller Grna och Cas94, genom ett stabilt uttryck av Cas9 och efterföljande införande av grna5,6,7 eller transkription mall av grna8, eller genom elektroporation av den redan bildade grna/Cas9 RNP Complex7,9. Denna tekniska avancemang är mycket förväntas påskynda drogen mål forskning i Chagas sjukdom.
För att fortsätta med läkemedelsutveckling, är det viktigt att validera essentialitet målgenen eller effekten av drogen kandidat föreningar i amastigote av T. cruzi, eftersom det är replikering skede av parasiten i däggdjurs värd. Detta är dock en utmanande uppgift, eftersom amastigotes inte kan manipuleras direkt på grund av närvaron av en obstruktiv värd cell. I Leishmania, en närbesläktad protozoer parasit till T. cruzi, en axenic amastigote odlingsmetod utvecklades och har utnyttjats i Drug screening analyser10,11,12, 13. även om det finns vissa skillnader i känslighet för föreningar mellan axenic amastigotes och intracellulära amastigotes14, förmågan att upprätthålla axenic kulturen ändå ger värdefulla experimentella verktyg för att studera grundläggande biologi av det kliniskt relevant arrangerar av Leishmania15,16. I fallet med T. cruzi, litteraturer om förekomsten av naturligt förekommande extracellulära amastigotes (EA)17 och in vitro-produktion av EA17,18,19 tillbaka till decennier sedan. Dessutom är EA känt för att ha en smittsam förmåga20, om än mindre än trypomastigote, och mekanismen för amastigote värd invasion har klargjorts under de senaste åren (granskad av Bonfim-Melo et al.21). Men till skillnad från Leishmaniahade EA inte utnyttjats som ett experimentellt verktyg i T. cruzi, främst därför att EA hade betraktats som en obligate intracellulär parasit, och därför inte hade ansetts vara “replikativ form” i en praktisk Känsla.
Nyligen föreslog vår grupp att utnyttja EA av T. cruzi som en temporal axenic kultur22. Amastigotes av T. cruzi tulahuen stam kan replikera fria från värdceller i lit medium vid 37 ° c i upp till 10 dagar utan större försämring eller förlust av amastigote-liknande egenskaper. Under värd-fri tillväxtperiod, EA var framgångsrikt utnyttjas för exogena genuttryck genom konventionell elektroporation, drog titrering analys med trypanocidal föreningar, och CRISPR/Cas9-medierad knockout följt av tillväxt fenotyp övervakning. I denna rapport beskriver vi det detaljerade protokollet för att producera in vitro-härledda EA och för att utnyttja axenic amastigote i knockout-experiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi visade att axenic kulturen av T. cruzi amastigotes kan utnyttjas i CRISPR/Cas9-medierad Gene knockout, genom att elektroporating grna direkt i Cas9-uttrycker EA. Detta sätt, den essentialitet av målgenen specifikt i amastigote skede kan utvärderas utan att gå genom andra utvecklingsstadier.
En annan gynnsam aspekt av amastigote transfection är bekvämligheten med att testa för ett stort antal målgener. När Co-kulturen i Cas9-uttrycker T. cruzi och värd däggdjursc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av JSPS KAKENHI Grant Number 18K15141 till Y.T.
Materials
| 20% formalin solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 068-03863 | fixing cells |
| 25 cm2 double seal cap culture flask | AGC Techno Glass | 3100-025 | |
| 75 cm2 double seal cap culture flask | AGC Techno Glass | 3110-075 | |
| All-in One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 | |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for Control) | IDT | custom made | target sequence = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcCGM1) | IDT | custom made | target sequence = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcPAR1) | IDT | custom made | target sequence = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA | IDT | 1072532 | to anneal with crRNA |
| Amaxa Nucleofector device | LONZA | AAN-1001 | electroporation |
| Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | LONZA | VMI-1021 | electroporation |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | component of the medium for in-vitro amastigogenesis |
| Burker-Turk disposable hemocytometer | Watson | 177-212C | cell counting |
| Coster 12-well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3513 | |
| DMEM | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 044-29765 | culture medium |
| Fetal bovine serum, Defined | Hyclone | SH30070.03 | heat-inactivate before use |
| G-418 Sulfate Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 077-06433 | selection of transformant |
| Hemin chloride | Sigma-Aldrich | H-5533 | component of LIT medium |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | staining of nuclei |
| Liver infusion broth, Difco | Becton Dickinson | 226920 | component of LIT medium |
| MES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 349-01623 | component of the medium for in-vitro amastigogenesis |
| PBS (–) | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 166-23555 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | staining of dead cells |
| RPMI 1646 | Sigma-Aldrich | R8758 | medium for metacyclogenesis |
References
- World Health Organization. . (WHO) Fact sheet: Chagas disease (American trypanosomiasis). , (2017).
- Clayton, J. Chagas disease 101. Nature. 465 (n7301_supp), S4-S5 (2010).
- Apt, W. Current and developing therapeutic agents in the treatment of Chagas disease. Drug Design, Development and Therapy. 4, 243-253 (2010).
- Lander, N., Li, Z. H. H., Niyogi, S., Docampo, R. CRISPR/Cas9-induced disruption of paraflagellar rod protein 1 and 2 genes in Trypanosoma cruzi reveals their role in flagellar attachment. mBio. 6 (4), e01012 (2015).
- Peng, D., Kurup, S. P., Yao, P. Y., Minning, T. A., Tarleton, R. L. CRISPR-Cas9-mediated single-gene and gene family disruption in Trypanosoma cruzi. mBio. 6 (1), e02097-e02114 (2015).
- Romagnoli, B. A. A., Picchi, G. F. A., Hiraiwa, P. M., Borges, B. S., Alves, L. R., Goldenberg, S. Improvements in the CRISPR/Cas9 system for high efficiency gene disruption in Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 178, 190-195 (2018).
- Burle-Caldas, G. A., Soares-Simões, M., Lemos-Pechnicki, L., DaRocha, W. D., Teixeira, S. M. R. Assessment of two CRISPR-Cas9 genome editing protocols for rapid generation of Trypanosoma cruzi gene knockout mutants. International Journal for Parasitology. 48 (8), 591-596 (2018).
- Costa, F. C. Expanding the toolbox for Trypanosoma cruzi: A parasite line incorporating a bioluminescence-fluorescence dual reporter and streamlined CRISPR/Cas9 functionality for rapid in vivo localisation and phenotyping. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), e0006388 (2018).
- Soares Medeiros, L. C. High-Efficiency Genome Editing in Protozoan Parasites Using CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins. mBio. 8 (6), (2017).
- Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An axenic amastigote system for drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (4), 818-822 (1997).
- Bates, P. A. Axenic culture of Leishmania amastigotes. Parasitology Today. 9 (4), 143-146 (1993).
- Ravinder, R., Bhaskar, B., Gangwar, S., Goyal, N. Development of luciferase expressing Leishmania donovani axenic amastigotes as primary model for in vitro screening of antileishmanial compounds. Current Microbiology. 65 (6), 696-700 (2012).
- Nühs, A. Development and Validation of a Novel Leishmania donovani Screening Cascade for High-Throughput Screening Using a Novel Axenic Assay with High Predictivity of Leishmanicidal Intracellular Activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), 1-17 (2015).
- De Rycker, M. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
- Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
- Pescher, P., Blisnick, T., Bastin, P., Späth, G. F. Quantitative proteome profiling informs on phenotypic traits that adapt Leishmania donovani for axenic and intracellular proliferation. Cellular Microbiology. 13 (7), 978-991 (2011).
- Andrews, N. W., Hong, K. S. U., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Stage-specific surface antigens expressed during the morphogenesis of vertebrate forms of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 64 (3), 474-484 (1987).
- Pan, S. C. Trypanosoma cruzi: intracellular stages grown in a cell-free medium at 37 C. Experimental Parasitology. 45 (2), 215-224 (1978).
- Tomlinson, S., Vandekerckhove, F., Frevert, U., Nussenzweig, V. The induction of Trypanosoma cruzi trypomastigote to amastigote transformation by low pH. Parasitology. 110 (05), 547 (1995).
- Ley, V., Andrews, N. W., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Amastigotes of Trypanosoma cruzi sustain an infective cycle in mammalian cells. Journal of Experimental Medicine. 168 (0022-1007 (Print)), 649-659 (1988).
- Bonfim-Melo, A., Ferreira, E. R., Florentino, P. T. V., Mortara, R. A. Amastigote Synapse: The Tricks of Trypanosoma cruzi Extracellular Amastigotes. Frontiers in Microbiology. 9, 1341 (2018).
- Takagi, Y., Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K. Utilization of proliferable extracellular amastigotes for transient gene expression, drug sensitivity assay, and CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in Trypanosoma cruzi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 13 (1), e0007088 (2019).
- Fernandes, J. F., Castellani, O. Growth characteristics and chemical composition of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 18 (2), 195-202 (1966).
- Oberholzer, M., Lopez, M. A., Ralston, K. S., Hill, K. L. Approaches for Functional Analysis of Flagellar Proteins in African Trypanosomes. Methods in Cell Biology. 93, 21-57 (2009).
- van den Hoff, M. J. B., Moorman, A. F. M., Lamers, W. H. Electroporation in ‘intracellular’ buffer increases cell survival. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2902-2902 (1992).
- Pacheco-Lugo, L., Díaz-Olmos, Y., Sáenz-García, J., Probst, C. M., DaRocha, W. D. Effective gene delivery to Trypanosoma cruzi epimastigotes through nucleofection. Parasitology International. 66 (3), 236-239 (2017).
- Coughlin, B. C., Teixeira, S. M., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Amastin mRNA abundance in Trypanosoma cruzi is controlled by a 3’-untranslated region position-dependent cis-element and an untranslated region-binding protein. The Journal of Biological Chemistry. 275 (16), 12051-1260 (2000).
- Shaw, A. K., Kalem, M. C., Zimmer, S. L. Mitochondrial Gene Expression Is Responsive to Starvation Stress and Developmental Transition in Trypanosoma cruzi. mSphere. 1 (2), (2016).
- Chao, D., Dusanic, D. G. Comparative studies of the isolation of metacyclic trypomastigotes of Trypanosoma cruzi by DEAE ion exchange chromatography. Zhonghua Minguo wei sheng wu ji mian yi xue za zhi (Chinese Journal of Microbiology and Immunology). 17 (3), 146-152 (1984).
- Nogueira, N., Bianco, C., Cohn, Z. Studies on the selective lysis and purification of Trypanosoma cruzi. The Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 224-229 (1975).
- Minning, T. A., Weatherly, D. B., Atwood, J., Orlando, R., Tarleton, R. L., Tarleton, R. L. The steady-state transcriptome of the four major life-cycle stages of Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 10, 370 (2009).
- Rico, E., Jeacock, L., Kovářová, J., Horn, D. Inducible high-efficiency CRISPR-Cas9-targeted gene editing and precision base editing in African trypanosomes. Scientific Reports. 8 (1), 7960 (2018).
- Fu, Y. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chiurillo, M. A., Lander, N., Bertolini, M. S., Storey, M., Vercesi, A. E., Docampo, R. Different roles of mitochondrial calcium uniporter complex subunits in growth and infectivity of Trypanosoma cruzi. mBio. 8 (3), e00574-e00617 (2017).
