Summary
ここでは、CRISPR/Cas9システムを用いてトリパノノーマ・クルジの細胞外アマスティゴテに遺伝子ノックアウトを導入するプロトコルについて述べた。成長表現型は、アックスアンマスティゴテ培養の細胞カウントまたは宿主細胞侵入後の細胞内アマスティゴテスの増殖のいずれかによって追跡することができる。
Abstract
トリパノソマ・クルジは、主にラテンアメリカでシャーガス病を引き起こす病原性原虫寄生虫である。T.クルジに対する新しい薬物標的を同定するためには、寄生虫の哺乳動物期における標的遺伝子の本質性を検証することが重要である。T.クルジのアマスティゴットは、宿主細胞内で複製する。したがって、他の発達段階を経ずにノックアウト実験を行うのは困難です。最近、我々のグループは、アマスティゴテのような特性を失うことなく、最大10日間軸を複製することができる成長条件を報告した。この側軸アミスティゴテ培養を用いることで、遺伝子ノックアウトを引き起こすCas9発現アマスティゴテに直接gRNAを導入し、その表現型をアマスティゴテ段階でのみ解析することに成功した。本報告では、インビトロ由来細胞外アマティストを生成し、CRISPR/Cas9媒介ノックアウト実験で軸培養を利用するための詳細なプロトコルについて述べる。ノックアウト・アマスティゴテスの増殖表現型は、軸培養の細胞数、または宿主細胞侵入後の細胞内アマスティゴットの複製によって評価することができる。この方法は、通常、トランスジェニックまたはノックアウト・アマスティゴテの産生に関与する寄生虫段階の分化をバイパスする。時間的軸アマスティゴテ培養の利用は、T.クルジにおけるステージ特異的研究の実験的自由を拡大する可能性を有する。
Introduction
トリパノソマ・クルジは、主にラテンアメリカ1で流行しているシャーガス病の原因となる薬剤である。T. クルジは、昆虫ベクターと哺乳類の宿主2の間を移動する独特のライフサイクルステージを持っています。T.クルジは、血液を吸うトリアトミンバグの中腸内のエピマスチゴテとして複製し、ヒトまたは動物の宿主に沈着する前に、その後腸内の感染性形而上皮トリポマスティゴに分化する。トリポマスティゴテが咬傷部位または粘膜を通して宿主体内に入ると、寄生虫は宿主細胞に侵入し、アマスティゴテと呼ばれるフラゲラレス丸型に変形する。amastigoteは宿主細胞内で複製し、最終的にはトリポマスティゴテに分化し、宿主細胞から破裂し、別の宿主細胞に感染するために血流に入る。
現在利用可能な化学療法剤、ベンズニダゾールおよびニフルティモックスは、有害な副作用を引き起こし、疾患3の慢性相に効果がないため、T.クルジに対する新規な薬物標的を同定することは大きな関心事である。近年、CRISPR/Cas9システムは、GRNAとCas94を含む別個または単一プラスミドのトランスフェクションによって、Cas9およびその後の安定した発現によって、T.クルジで遺伝子ノックアウトを効果的に行う強力なツールとなっています。gRNA 5、6、7またはgRNA8の転写テンプレートの導入、または予形成されたgRNA/Cas9 RNP複合体7、9のエレクトロポレーションによる。この技術の進歩は、シャーガス病の薬物標的研究を加速することが非常に期待されています。
薬剤開発を進めるためには、哺乳類宿主における寄生虫の複製段階であるT.クルジのアマスティゴテにおける標的遺伝子または薬剤候補化合物の有効性を検証することが重要である。しかし、閉塞性宿主細胞が存在するため、アマスティゴットを直接操作することはできないため、これは困難な作業です。リーシュマニアでは、T.クルジに密接に関連する原虫寄生虫、アックスアンスアミゴット培養法が開発され、薬物スクリーニングアッセイ10、11、12、および、 13.アックスアマスティゴテスと細胞内アマスチゴテス14との間の化合物に対する感受性にはいくつかの不一致があるものの、それでもアックス培養を維持する能力は、リーシュマニア15、16の臨床的に関連する段階の基礎生物学。T.クルジの場合、自然発生する細胞外アマスティゴテス(EA)17の存在に関する文献とEA 17、18、19のインビトロ産生何十年も前のことださらに、EAは、トリポスチゴテのそれよりも少ないが、感染能力20を有することが知られており、近年、アマスティゴット宿主侵入のメカニズムが解明されている(Bonfim-Melo et al.21によるレビュー)。しかし、リーシュマニアとは異なり、EAはT.クルジの実験ツールとして利用されていなかった。意味。
最近、我々のグループは、T.クルジのEAを一時的な軸文化22として利用することを提案した。T.クルシトゥラフエン株のアマスティゴテスは、アマスティゴット様特性の大きな劣化または損失なしに最大10日間、37°CでLIT培地中の宿主細胞を含まない複製が可能です。宿主フリー成長期間中、EAは、従来のエレクトロポレーション、トリパノシダル化合物による薬物滴定アッセイ、およびCRISPR/Cas9媒介ノックアウトに続いて成長表現型モニタリングを行い、外因性遺伝子発現に成功しました。本報告では、インビトロ由来EAを生成し、ノックアウト実験でアックスアンマスタゴテを利用するための詳細なプロトコルについて述べた。
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Protocol
注:実験フロー全体の概要を図 1に示します。
図1:EAを用いたノックアウト実験の概要組織培養由来トリポスチゴテスは、EAに収穫され、EAに分化される. gRNAは、エレクトロポレーションによってCas9発現のアマスティゴテスにトランスフェクトされ、ノックアウトアマスティゴテスの成長表現型は、アックスレプリケーションまたはによって評価される宿主細胞侵入後の細胞内複製。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
1. 寄生虫培養製剤
- トリパノソマクルシのトゥラフエン株は、このレポート全体を通じて使用されます。LIT培地におけるT.クルジのエピマスチゴテスを維持する(10%FCS、補足表1参照)。キャップをしっかりと閉じ、培養フラスコを28°Cに保ちます。
- Cas9エンドヌクレアーゼを保有するT.クルジのトランスジェニック株を生成します。Cas9コードシーケンスとG418(ネオr)選択マーカーを含む発現プラスミドの例は、Lander et al.4およびPeng et al.5で見つけることができます。
- 上記のプラスミドをエレクトロポレーションによってエピマスチゴットにトランスフェクトし、材料表に記載のキットを使用する。1キュベットの場合は、2 x 107細胞をスピンダウンし、上清を廃棄し、提供されたサプリメント溶液を含む100μLのエレクトロポレーションバッファーで再懸濁する。
注:エレクトロポレーションバッファーは、EMバッファー24(細胞ミックス25およびリン酸スクロースバッファーの3:1混合物)で置換することができる。 - プラスミドの20-40 μgを追加し、2ミリメートルのギャップエレクトロポレーションキュベットに混合物を転送します。X-14プログラム26を使用して、エレクトロポレーション装置(材料の表を参照)でパルスを適用します。
- キュベットの内容物をLIT培地の5mL(10%FCS)を含むT-25フラスコに移します。フラスコを28°Cで24時間インキュベートします。
- G418を250 μg/mLの最終濃度に加え、28°Cでインキュベーションを続けます。非トランスフェクトされたエピマスチゴを殺すのに約1週間かかります。G418耐性集団が回復し始めたら、飽和を避け、死んだ細胞を希釈するために週に1~2回培養を行う。安定した細胞株の確立は、通常、合計4週間かかります。
注:Cas9の構成的発現が細胞5の負担である場合、Cas9オープンリーディングフレーム27の直下流のアマスティン遺伝子の3'-UTRを結合することにより、アマスティゴット期に特異的な発現を行う。アマスティゴット特異的Cas9発現プラスミドの詳細な説明は、高木ら22で見つけることができます
- 上記のプラスミドをエレクトロポレーションによってエピマスチゴットにトランスフェクトし、材料表に記載のキットを使用する。1キュベットの場合は、2 x 107細胞をスピンダウンし、上清を廃棄し、提供されたサプリメント溶液を含む100μLのエレクトロポレーションバッファーで再懸濁する。
- Cas9発現T.クルジおよび哺乳動物宿主細胞の宿主寄生虫共培養を確立する。このレポートでは、宿主として3T3-スイスアルビノ線維芽細胞を使用する。
- T. クルジエピマスチゴテスをメタ環型トリポマスティゴに区別する。血球計を用いてエピマスチゴテス培養の細胞密度を決定し、2,100 x gで15分間遠心分離により5 x 107細胞を集集める。上清を廃棄し、RPMI培地の10mLで細胞を再懸濁する。寄生虫を28°Cで1週間28°Cでインキュベートする。
- RPMI培地でメタ環型トリポスチゴテスを収集する。フラスコを慎重に傾け、底面に付着した寄生虫を邪魔することなく、溶液をピペトアウトします。2,100 x gで15分間円錐形の管と遠心分離機に媒体を移します。上清を廃棄し、DMEMの5 mL(10%FCS)で寄生虫を再懸濁させる。
注:寄生虫集団は、メタ環型トリポスチゴテス、エピマスチゴット、およびいくつかの中間形態の混合物である。必要ではないが、DEAEイオン交換クロマトグラフィー29によりトリポスチゴテを分離することができる。あるいは、エピマスチゴットは、活性血清で寄生虫をインキュベートして、それらを補体するリシス30を補和することによって排除することができる。 - 種子3T3-スイスアルビノ線維芽細胞は60〜70%合流、またはT-25培養フラスコにおけるDMEMの5 mL(10%FCS)で約1.7-2.0 x 106細胞に。成長培地を除去し、ステップ1.3.2から寄生虫混合物を適用します。加湿インキュベーターで37°C以下で24時間インキュベートし、感染を確立します。
- DMEM(10%FCS)で共培養を2回洗浄することにより、宿主3T3細胞の外側に残った寄生虫を除去する。
- 共培養が飽和したら、トリプシン化によりアマスティゴット感染宿主細胞を通過させる。培地を吸引し、PBSで一度培養をすすいでくす。0.05%トリプシン溶液の1mLを塗布し、培養面全体を覆い、付着した宿主細胞が緩むまで室温で数分間インキュベートする。セル上に DMEM (10% FCS) の 3 mL をフラッシュしてフラスコ表面からセルを取り外します。
- 離れた宿主細胞を円錐形のチューブに移し、遠心分離機を300xgで3分間遠心分離する。上清を吸引し、新鮮なDMEM(10%FCS)の3 mLで細胞を再中断します。このステップは、残りのエピマスチゴットを排除するのに役立ちます。DMEM(10%FCS)の9 mLを含むきれいなT-75フラスコにすべてを移す。トリポマスティゴテが培養上清に放出されるまで培養を続ける。
- 週に2回、トリプシン化で受け継ぐことで共培養を維持します。宿主集団の70~80%が感染すると、培養の悪化を避けるために、感染していない宿主3T3細胞を5:1(持ち越し:フレッシュ)の割合で定期的に追加します。宿主細胞とT.クルジの間のバランスが適切に維持されている場合、トリポスチゴテは連続的に出口を出る。
2. トリポマスティゴットをEAに分化
- この実験の前日に、宿主寄生虫共培養の増殖培地を取り除き、新鮮なDMEM(10%FCS)を加えて、前日に宿主細胞から既に放出されていたEAとトリポマスティゴットを洗い流す。定期的な実験は、コンフルエント共培養の少なくとも2つのT-75フラスコを必要とします。
-
培養上清を円錐管に集め、新鮮なトリポマスティゴットを収穫します。顕微鏡(10倍または20倍の対物レンズ)でサンプルを確認して品質を確認してください。宿主細胞の破片がある場合は、サンプルを簡単に遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。EA の数が多い場合は、次のスイムアウト手順でトリポスティクスを分離します。
- 2,100 x gで15分間、トリポスチゴットとアマスティゴットの混合物をスピンダウンします。上清のほとんどを廃棄し、チューブ内に0.5〜1.0 mLの培地を残します。
注: 音量を減らすことは任意ですが、次の手順を簡単にします。 - ペレットを37°Cで1~2時間インキュベートし、活性トリポスチゴテスがペレットから泳ぎ出せるようにします(図2)。
- トリポスチゴットを含む上清を1.5mLマイクロ遠心管に移します。
- 2,100 x gで15分間、トリポスチゴットとアマスティゴットの混合物をスピンダウンします。上清のほとんどを廃棄し、チューブ内に0.5〜1.0 mLの培地を残します。
- 2,100 x gで15分間円錐管を遠心分離し、トリポスチゴットを収集します。上記のスイムアウト手順を行った場合は、1.5mLチューブを4,000 x gで2分間遠心分離し、トリポスチゴテをペレットする。上清を捨てます。
- 20 mM MES(pH 5.0)でバッファリングされたDMEMの5 mLでペレットを再中断し、0.4%BSA19を補充した。寄生虫をT-25培養フラスコに移す。キャップを緩めたままにしておきます。細胞密度は、過飽和が細胞死の可能性を増加させるので、1 x 107細胞/mLの周りまたは以下でなければなりません。
注:DMEM の色はオレンジではなく黄色でなければなりません。元の DMEM のバッファリング容量が高い場合、20 mM MES (pH 5.0) は pH を下げるには不十分です。その場合、培地のpHはHClを添加して調整しなければならない。酸性培地は4°Cに保つことができるが、1ヶ月以下である。 - 加湿インキュベーターで培養フラスコを37°C以下で5%CO2でインキュベートします。寄生虫の約95%は24時間後にアマスティゴットに分化する。
3. EAのエレクトロポレーション
- エレクトロポレーション用のgRNAを準備します。これは、インビトロ転写によって、または単にメーカーから合成RNAオリゴヌクレオチドを購入することによって行うことができます。本報告では、統合DNAテクノロジーズ社のcrRNAおよびtracrRNAを用いる。
- 2,100 x gで15分間EAの培養を遠心分離します。上清を捨てる。
- 1 x 108細胞/mLの最終細胞密度に対する補足溶液を含むエレクトロポレーションバッファーでペレットを再中断する。
注:EMバッファは、材料の表に記載されているエレクトロポレーションバッファと比較して、より多くの細胞死を引き起こします。したがって、アマスティゴットトランスフェクションにはお勧めしません(補足図1)。 - アリコット100 μLの再懸濁寄生虫(1 x 107細胞)を1.5mLマイクロ遠心管に入れる。gRNAの5-10 μgを追加し、ピペッティングによって穏やかに混合します。
- 混合物を2mmのギャップエレクトロポレーションキュベットに移します。X-14プログラムを使用して、エレクトロポレーションデバイスでパルスを適用します。
- キュベットの内容物を、5mLの予め温められたLIT培地(10%FCS)を含むT-25フラスコに移します。キャップを緩めたままにし、5%CO2以下でフラスコを37°Cでインキュベートします。
- アックス培養の継続(セクション4)または宿主細胞感染後の細胞内アマスチゴットとして細胞増殖を監視する(セクション5)。
4. アクセニック・アマスティゴテスとしてのノックアウト細胞の増殖をモニタリングする
- EAは培養培地の底に落ち着くので、フラスコをゆっくりと振って溶液中に再び振ります。一部の細胞がフラスコに付着しているので、ピペッティングによってフラスコ表面を洗浄するのに役立ちます。
- ヨウ化プロピジウム(PI)溶液(20 μg/mL)を20μLのアマスティゴテ培養と混合します。
注:培養フラスコを必要以上に長くインキュベーターの外に放置しないでください。温度は、軸増殖22を可能にする要因の一つである。 - サンプルをヘモサイトメーターに適用し、蛍光顕微鏡下で観察します。PIは損傷した細胞膜に対してパーセされているが、生細胞から除外される。PI(例/em 570 nm/602 nm)によって染色されていない生存可能なアマスティゴットの数を数えます。
5. 細胞内アマスティゴテスとしてのノックアウト細胞の増殖をモニタリングする
- シードホスト3T3細胞をDMEM(10%FCS)を用した12ウェルプレート内に入れる。細胞密度を70~80%の合流性、またはウェルあたり約3 x 105細胞に調整します。
注:アマスティゴットはモチルではないため、宿主細胞による増殖表面の大部分を覆うことで感染効率が向上する。 - エレクトロポレーションの1日後に遠心分離によってステップ3.6からノックアウトアマスティゴテスを収集します。上清を廃棄し、DMEMの2 mL(10%FCS)で寄生虫を再懸濁させる。
- 宿主細胞培養から培地を取り出し、再懸濁したアマスティゴットを適用する。感染の多重性は20以上である必要があります。37°Cでプレートを5%CO2以下で2日間インキュベートし、アマスティゴットが感染を起こした。
注:感染期間は、目的に応じて1日することができます。 - DMEM(10%FCS)で2回、宿主細胞の外に残ったEAを洗い流します。
- 宿主寄生虫共培養に新鮮なDMEM(10%FCS)を加え、さらに2日間37°Cでインキュベーションを続けます。
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感染効率を評価するために、宿主細胞および細胞内アマスティゴテの核を可視化する。
注:核は飽和共培養で重なり合う傾向がある。固定および染色の前に、より低い細胞密度(1:5希釈など)で細胞を再めっきすることは、核をより簡単に数えるのに役立ちます。- 培地を取り出し、10%ホルマリン溶液の1mLをPBSに塗布し、細胞を固定する。室温で10分間インキュベートします。
- ホルマリン溶液を1 μg/mLのホエヒト33342と0.1%トリトンX-100を含むPBSの1 mLに置き換えます。室温で5分間インキュベートします。
- Hoechst溶液を取り出し、PBSで細胞を一度すすいで下す。新鮮なPBSの1 mLを追加します。
- 蛍光顕微鏡下で観察し、より小さな寄生虫核に関連する宿主細胞核を同定する(図4)。2以上のアマスティゴットを含む宿主細胞は、非生産的な初期感染または洗浄されていないEAを含まない、感染していると考えるべきである。
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Representative Results
スイムアウト手順によるトリポマスティゴットの分離
スイムアウト手順によって古いEAを汚染から新鮮なトリポスチゴテスを収穫するには、細胞ペレットを少なくとも1時間インキュベートする必要があります。図2B)。この特定の実験では、最初の混合物におけるトリポマスティゴテの割合は38%であり、泳ぎ後の割合は任意の時点で98%を超えていた。コンフルエント共培養の2つのT-75フラスコから、このスイムアウトプロトコルにより、純粋なトリポマスティゴテの3-4 x 107細胞を日常的に得る。
アックス培養としてのノックアウト・アマスティゴットの成長モニタリング
T.クルジの他の発達段階とは異なり、フラペラレスのアマスティゴットは実質的に静的である。したがって、PIを使用して染色すると、生きているアマスティゴットと死んだものを区別するのに役立ちます。PIは無傷の細胞膜に対して不透過性であるが、死細胞に容易に浸透する(図3A)。必須遺伝子に対してgRNAをトランスフェクトしたAmastigotesは、TcCGM1(TcCLB.511807.80)、T.クルジゲノムに相同性のないgRNAを受けた対照群と比較して有意な増殖欠陥を示した(図3B)。
細胞内アマスティゴテスとしてのノックアウト寄生虫の成長モニタリング
アマスティゴット期における標的遺伝子の本質性は、細胞内アマスティゴテとしてのノックアウトT.クルジの成長表現型の評価によっても実証することができる(図4)。より小さいT.クルシ核に関連する宿主核の割合は、対照群と比較してTcCGM1-KO群において有意に低かった。
ステージ特異的遺伝子のノックアウトは、アマスティゴットとトリポマスティゴット段階における見型的差を引き起こす
パラフラグラーロッド成分PAR1は、トリポスチゴット段階で高度に発現されるが、T.クルジ22、31のアマスティゴット段階で下方制御される。実際、TcPAR1に対するgRNAのトランスフェクション(TcCLB.506755.20)は、アックス培養の4日後のEAの成長に有意な影響を及ぼさなかった(図5B)。宿主細胞侵襲に続くgRNAトランスフェクションは、TcPAR1-KOが感染後4日目における感染宿主細胞の分画に関して、細胞内アマスティゴテスの増殖を阻害しないことも示した(図5C)。個々の宿主細胞内の寄生虫の数は、ノックアウトの影響を受けていないようでした(補足図2)。これらの結果は、TcPAR1がT.クルジのアマティスト段階において必須ではないことを示している。
しかし、感染後5日目に宿主細胞から出現したトリポマスティゴの数は、TcPAR1-KO共培養において有意に低く、対照共培養と比較した(図5D)。また、エグレッション前の宿主3T3細胞内での分化トリポマスティゴテスは対照群(補足ムービー1)でかなり活発に見えたが、TcPAR1-KO群では低迷しているように見えた(補足ムービー2)。これらの結果は、TcPAR1がT.クルジのトリポスティゴテ段階において重要な役割を果たしていることを示唆している。
図2:スイムアウト手順によるトリポマスティゴットの分離。(A) プロトコルの概略表現。赤 = トリポマスティゴテの存在。(B) 示された時点でペレットからスワットアウトしたトリポマスティゴの数。初期ペレットには合計3 x 107寄生虫が含まれ、そのうち38%がトリポスチゴットであり、残りはアマスティゴットであった。実験は三分三で行い、平均値(±SD)をプロットした。溶液中のトリポスチゴテスの純度は、任意の時点で98%を超えていた。(C) 泳ぐ前の寄生虫の顕微鏡画像(左)、ペレットから泳ぎ出したトリポスチゴット(中央)、およびインキュベーションの1時間後にペレットに残る寄生虫(右)。スケールバー = 10 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:アックスアンスタチゴットの成長モニタリング(A) ヨウ化プロピジウム(PI)除外アッセイ。明視野(左)、蛍光チャネル(中央)、オーバーレイ画像(右)におけるEAの顕微鏡画像。黄色の矢印は、PI染色された死細胞を示します。スケールバー = 20 μm. (B) TcCGM1(オープンサークル)に対するgRNAとのトランスフェクション後のCas9発現アマスティゴテスの細胞数と、T.クルジゲノム(閉じた円)に相同性のないgRNAを制御する。エレクトロポレーションは三つ三度で行い、平均値(±SD)をプロットする。(**p < 0.01 ウェルチのt検定)この図は高木ら22から変更されています。
図4:宿主侵入後のノックアウト・アマスティゴットの成長。(A) TcCGM1および対照gRNAに対してgRNAをトランスフェクトしたアマスティゴテスの細胞内複製後の宿主寄生虫共培養の核染色。gRNAトランスフェクトEAをエレクトロポレーションの1日後に3T3細胞に塗布し、2日間宿主細胞に感染させた。宿主細胞の外に残ったアマスティゴットを洗い流し、宿主寄生虫共培養をさらに2日間インキュベートした。スケールバー = 20 μm.この図は、高木ら22(B)対照アマスティゴット(黒い棒)とTcCGM1-KOアマスティゴテス(灰色のバー)によって感染した宿主3T3細胞の割合から改変された。3つの感染実験の平均(±SD)がプロットされる(**p < 0.01、ウェルチのt検定)。この図は高木ら22から変更されています。
図5:ノックアウト・アマスティゴットと分化トリポマスティゴテの間のフェオティピックの違い。(A) 実験時間線の概略表現。(B) コントロールアマスティゴテス(黒い棒)およびTcPAR1-KOアマスティゴテス(灰色のバー)のための4日後トランスフェクションにおけるアックスアンマスティゴテスの細胞数。3つのエレクトロポレーション実験の平均値(±SD)がプロットされる(n.s.:有意ではない、マン・ホイットニーU試験)。(C) コントロールアマスティゴテ(黒い棒)およびTcPAR1-KOアマスティゴテ(灰色のバー)による感染後4日間の感染後における感染宿主3T3細胞の割合。3つの培養ウェルの平均値(±SD)がプロットされる(n.s.:有意ではない、マン・ホイットニーU試験)。(D) 対照共培養(ブラックバー)及びTcPAR1-KO共培養(灰色バー)に対する感染後5日で培養培地に放出されたトリポマスティゴテの数。3つの培養井戸の平均値(±SD)がプロットされます(*p < 0.05、マンホイットニーU検定)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足表1:LIT培地の組成。LIT培地は、リン酸水素二ナトリウムの量を除いてATCC1029に従って調製した。テーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図1:アミスティゴット細胞生存率に対するエレクトロポレーションバッファーの効果EAは、エレクトロポレーションバッファまたはEMバッファ内のいずれかにエレクトロポレートされた。アマスティゴットは、生きていると死んだアマスティゴットの数を数えるために24時間後にPIで染色されました。各グループおよび非パルス群における死細胞のパーセンテージがプロットされます。3つのエレクトロポレーション実験の平均(±SD)が示されている(*p < 0.05,n.s.:有意ではない、クルスカル・ウォリス試験)。図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:核染色されたTcPAR1-KOの顕微鏡画像および細胞内無菌を制御する。宿主3T3細胞とトランスフェクトされたアマスティゴットの共培養を、感染後4日目に固定し染色した。スケールバー: 20 μm.図をダウンロードするにはここをクリックしてください。
補足図3:Cas9発現エピマスチゴテの成長表現型。野生型エピマスチゴテス(WT)の細胞数、Cas9-EGFP(Cas9-EGFP)を構成的に発現するエピマスチゴテス、およびアマスティゴテ特異的3'-UTR(Cas9-EGFP-AmaUTR)の調節下でCas9-EGFPを発現するエピマスチゴテスが対数スケールでプロットされる。エピマスチゴットは、28°CでLIT培地(10%FCS)で栽培した。寄生虫細胞密度を0日目に1 x 106細胞/mLに調整した。累積セル数は、セル密度に総希釈係数を掛けたものとして計算されます。3つの培養フラスコの平均(±SD)が示されている(*p<0.05、n.s.:有意ではない、クルスカル・ウォリス試験)。図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー1:対照共培養の顕微鏡検査ビデオ画像。コントロールのアマスティゴと区別されたトリポスチゴテスの数と活性性。感染後5日目の動画画像を表示します。 ムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー2:TcPAR1-KO共培養の顕微鏡検査ビデオ画像。TcPAR1-KOアマスティゴテスと区別したトリポスチゴテスの数と活性性感染後5日目の動画画像を表示します。ムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々は、T.クルジアマスティゴテスのアックスカルバチカルが、GRNAをCas9発現EAに直接エレクトロポレートすることにより、CRISPR/Cas9媒介遺伝子ノックアウトで利用できることを実証した。このようにして、amastigote期に特異的に標的遺伝子の本質性は、他の発達段階を経ることなく評価することができる。
アマスティゴットトランスフェクションのもう一つの有益な側面は、多数の標的遺伝子の試験における利便性である。Cas9発現T.クルジと宿主哺乳動物細胞の共培養が確立されると、組織由来トリポマチゴテスをEAに変換し、gRNAをトランスフェクトしてノックアウト・アマスティゴテスを得るのに数日しかかからない。gRNAは、各標的遺伝子に合わせて調整する必要がある唯一の材料ですが、合成gRNAは多くのメーカーから入手可能ですので、単に購入することができます。標的遺伝子のステージ特異的本質を分析する別の方法は、誘導性ノックアウトシステム32を確立するであろう。その場合、プラスミドのトランスフェクション効率はgRNA(<15%)よりもはるかに低いため、標的遺伝子ごとに構築し、エピマスチゴテ段階で寄生虫にトランスフェクトする必要があります。gRNA 22の場合は 96% と思われる 26)選択されたトランスフェクタントは、最終的に細胞内アマスチゴテでノックアウトを誘導するために宿主細胞に感染するためにメタ環型トリポスチゴテスに分化する必要があります。このプロセス全体は1-2ヶ月かかります。
本報告では、PIを用いて、アキシゴチン培養中の死細胞をヘモサイトメーターで細胞密度を定量化した。あるいは、レサズリン生存率アッセイなどの代謝アッセイを用いて、高スループットフォーマットに適した生体アマスティゴットの数を推定することができる。我々の手の中で、1x 105 amasstigotesは、インキュベーションの5時間後にレサズリンアッセイによって検出される十分な酸化還元活性を得る。
Cas9発現細胞株を確立することの欠点の1つは、Cas9過剰発現5、33による潜在的な細胞負荷および非特異的切断である。Cas9の構成的発現がT.cruzi4、6、7、8の成長率に影響を及ぼさないことを示すいくつかの報告がある。しかし、1つのインスタンス5と我々の手の中でも、Cas9発現寄生虫は野生型と比較してゆっくりと成長を示した。この問題を克服するために、我々は、Cas9の表現をアマスティゴテステージ22に制限するために、アマスティゴテ特有の3'-UTRを採用した。Cas9オープンリーディングフレームへのアマスティン3'-UTRの結合は、トランスジェニック寄生虫の複製速度を回復させ(補足図3)、それによってインビトロのトリポマチゴを継続的に供給する堅牢な宿主寄生虫共培養物を産生するアマスティゴジェネシス。最近、他のグループは、野生型寄生虫にgRNA/Cas9 RNP複合体の導入がT.cruzi7,9でゲノム編集を引き起こす可能性があることを実証している。哺乳動物細胞の研究は、RNPの使用がCas9タンパク質34の短い半減期のために、望ましくないオフターゲットゲノム編集を減少させることを示唆しているので、この方法は、寄生虫9に対するストレスの少ないアプローチとして探索されるべきである。
プロトコルに対するもう一つの任意修飾は、相同組換えのためのテンプレートとしてのドナーDNAの共トランスフェクションであろう。切断部位の上流および下流に相同配列を含むドナーDNAは、二本鎖DNA4、5、8、35または一本鎖のいずれかの形態で報告されている。オリゴヌクレオチド7,9は、Cas9ヌクレアーゼによって引き起こされる二本鎖破断の修復プロセスを容易にする。一部の報告では、ドナーテンプレートなしでマイクロ相始結合が切断を修復し、欠失変異5を導入できることを示しているが、それでも変異部位への定義された配列の導入は、確認するのに役立つゲノム編集に成功し、場合によっては遺伝子ノックアウトのDNA証拠を示すのは難しいため、標的タンパク質の減少および先実性の結果は標的遺伝子が変異した4を示唆している。
このレポートでは、ドナーDNAのCas9/gRNA RNPトランスフェクションおよび共トランスフェクションは、プロトコルの記述を簡素化し、EAの調製およびその後の軸培養の使用に焦点を当てることを実証していない。これらの実験を行いたい場合は、単にエレクトロポレーションの成分を交換することによって行うことができます。
T.cruziのEAを実験ツールとして利用する我々の方法は、プラスミドトランスフェクションおよび薬物有効性試験22による過渡的遺伝子発現を含む様々なステージ特異的研究を可能にする可能性がある。しかし、このアプローチの有効性は、これまでトゥラフエン株でのみテストされている。T.クルジの株は非常に多様であるため、他の株に対するこのプロトコルの適用性を調査する必要があります。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていない。
Acknowledgments
この作品は、JSPS KAKENHI助成金番号18K15141からY.Tまで一部サポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20% formalin solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 068-03863 | fixing cells |
| 25 cm2 double seal cap culture flask | AGC Techno Glass | 3100-025 | |
| 75 cm2 double seal cap culture flask | AGC Techno Glass | 3110-075 | |
| All-in One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 | |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for Control) | IDT | custom made | target sequence = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcCGM1) | IDT | custom made | target sequence = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcPAR1) | IDT | custom made | target sequence = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA | IDT | 1072532 | to anneal with crRNA |
| Amaxa Nucleofector device | LONZA | AAN-1001 | electroporation |
| Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | LONZA | VMI-1021 | electroporation |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | component of the medium for in vitro amastigogenesis |
| Burker-Turk disposable hemocytometer | Watson | 177-212C | cell counting |
| Coster 12-well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3513 | |
| DMEM | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 044-29765 | culture medium |
| Fetal bovine serum, Defined | Hyclone | SH30070.03 | heat-inactivate before use |
| G-418 Sulfate Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 077-06433 | selection of transformant |
| Hemin chloride | Sigma-Aldrich | H-5533 | component of LIT medium |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | staining of nuclei |
| Liver infusion broth, Difco | Becton Dickinson | 226920 | component of LIT medium |
| MES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 349-01623 | component of the medium for in vitro amastigogenesis |
| PBS (–) | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 166-23555 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | staining of dead cells |
| RPMI 1646 | Sigma-Aldrich | R8758 | medium for metacyclogenesis |
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