Summary
Burada, CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak , Trypanosoma cruzi 'nin ekstrellüler amastigote içine bir gen nakavt tanıtmak için bir protokol açıklanmaktadır. Büyüme fenotipi ya akenik amastigote kültürün hücre sayımı ya da ana hücre istilasından sonra hücreli formları proliferasyonu ile takip edilebilir.
Abstract
Tripanosoma cruzi bir patojenik protozoon paraziti neden Chagas ' hastalık Latin Amerika ağırlıklı olarak. T. cruzikarşı yeni bir ilaç hedefi tanımlamak için, parazitin memelinin aşamasında hedef geni esaslığını doğrulamak için önemlidir, amastigote. T. cruzi 'nin amastigotları ana hücre içinde çoğaltır; Böylece, diğer gelişimsel aşamalarında gitmeden bir nakavt deney yapmak zordur. Son zamanlarda grubumuz, amastigote 'nin amastigote benzeri özelliklerini kaybetmeden 10 güne kadar axenically çoğaltılacağı bir büyüme durumu bildirdi. Bu temporal akenik amastigote kültürünü kullanarak, gRNAs 'ı doğrudan Cas9-ifade amastigote 'ye, gen taklalarına neden olan ve fenotiplerini sadece amastigote aşamasında analiz etmeye başarıyla tanıttık. Bu raporda, in vitro türev ekstrasellüler amastigotes üretmek için ayrıntılı bir protokol tarif ve bir CRISPR/Cas9-aracılı nakavt deneyi akenik kültürü kullanmak. Nakavt amastigotlerin büyüme fenotipi, ya axenik kültürün hücre sayısıyla ya da ana hücre istilasından sonra hücreler arası amastigote çoğaltılması ile değerlendirilebilir. Bu yöntem, normalde bir transgenik veya nakavt amastigote üreten dahil parazit sahne farklılaşma atlar. Temporal akenik amastigote kültürünün kullanılması, T. cruzi 'de sahne özel çalışmaların deneysel özgürlüğünü genişletme potansiyeline sahiptir.
Introduction
Tripanosoma cruzi Chagas ' hastalığın nedensel Ajan, hangi Latin Amerika ağırlıklı olarak yaygındır1. T. cruzi bir böcek vektör ve bir memeli ev sahibi2arasında seyahat gibi ayırt edici yaşam döngüsü aşamaları vardır. T. cruzi bir kan-emme triatomin böcek midgut bir epimastigote olarak çoğaltır ve bir insan veya hayvan ev sahibi üzerine yatırılan önce onun hindgut bir bulaşıcı metacyclic tripomastigote ayırt. Tripomastigote, ısırık sitesi veya Mukoza zarı yoluyla ana gövdeye girdikten sonra, parazit bir ev sahibi hücresini işgal ediyor ve bir amastigote denilen flagella-Less yuvarlak bir forma dönüşür. Amastigote ana hücre içinde çoğaltır ve sonunda ana hücre dışarı patlamaları ve başka bir ana hücre bulaştırmak için kan akışını girer tripomastigote, ayırır.
Şu anda mevcut kemoterapötik ajanlar, benznidazol ve nifurtimox, olumsuz yan etkilere neden ve hastalığın kronik aşamasında etkisiz3, T. cruzi karşı yeni uyuşturucu hedefleri belirlemek için büyük bir ilgi olduğunu. Son yıllarda, CRISPR/Cas9 sistemi etkili bir şekilde T. cruzigen nakavt gerçekleştirmek için güçlü bir araç haline gelmiştir, ya ayrı veya tek plazmid nakli tarafından (s) Grna ve Cas94içeren, istikrarlı ifade tarafından Cas9 ve sonraki Grna5,6,7 veya transkripsiyon şablonuna giriş8, ya da önceden biçimlendirilmiş Grna/Cas9 RNP kompleksi7,9Elektroporasyon. Bu teknolojik gelişme Chagas hastalığında ilaç hedef araştırma hızlandırmak için son derece beklenen.
İlaç gelişimi ile devam etmek için, bu meme ev sahibi parazitin çoğaltma aşaması olduğu gibi, T. cruziamastigote içinde uyuşturucu aday bileşiklerin hedef geni veya etkinliğini geçerliliğini doğrulamak için çok önemlidir. Ancak, bu zorlu bir görevdir, çünkü formları bir obstrüktif konak hücresinin varlığı nedeniyle doğrudan manipüle edilemez. Leishmania'da, T. cruzi'ye yakından ilgili protozoon paraziti, aksiyenik amastigote kültür yöntemi geliştirilmiştir ve ilaç taramasında10,11,12, 13. axenik formları ve hücre içi formları14arasındaki bileşiklere duyarsızlık bazı uyuşmazlıklar olmasına rağmen, axenik kültürü korumak için yeteneği yine de çalışma için değerli deneysel araçlar sağlar Leishmania'nın klinik olarak alakalı aşamasının temel biyolojisi15,16. T. cruzidurumunda, doğal olarak ortaya çıkan ekstrasellüler formları (EA)17 ve in vitro üretim EA17,18,19 varlığı ile ilgili literatür geri onlarca yıl önce. Buna ek olarak, EA, tripomastigote daha az olsa da, bulaşıcı bir yetenek20olduğu bilinmektedir ve amastigote ev sahibi istilası mekanizması son yıllarda (Bonfim-Melo ve al.21tarafından gözden geçirilmiş) aydınlatılamamıştır olmuştur. Ancak, Leishmaniaaksine, EA T. cruzideneysel bir araç olarak kullanılmadı, öncelikle çünkü EA bir zorunlu hücre içi paraziti olarak kabul edilmişti, ve bu nedenle pratik olarak "çoğaltıcı formu" olarak kabul edilmedi Anlamda.
Son zamanlarda, grubumuz bir temporal akenik kültür olarak T. cruzi EA kullanmak için önerilen22. T. cruzi tulahuen strain 'in amastigotları 37 °c ' de ışık ortamında ana hücrelerden ücretsiz olarak, büyük bozulma veya amastigote benzeri özelliklerin kaybı olmaksızın 10 güne kadar çoğalabilir. Ev sahibi-serbest büyüme döneminde, EA başarıyla geleneksel Elektroporasyon tarafından eksojen gen ifadesi için kullanılmıştır, tripanokidal bileşikler ile ilaç titrasyon tahlil, ve CRISPR/Cas9-aracılı nakavt büyüme fenotip izleme izledi. Bu raporda, In vitro türevi EA üretmek ve nakavt deneylerinde aksiyenik amastigote kullanmak için ayrıntılı protokol açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Tüm deneysel akışa genel bakış Şekil 1' de tasvir edilir.
Şekil 1: EA kullanarak nakavt denemeye genel bakış. Doku kültürü-türevi tripomastigotes hasat ve EA. Grna içine ayrıştırılır içine Cas9-ifade formları Elektroporasyon tarafından transfekte, ve nakavt amastigote büyüme fenotipi ya axenik çoğaltma veya tarafından değerlendirilir Ana hücre istilasından sonra hücreler arası çoğaltma. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
1. parazite kültür preparatları
- Trypanosoma cruzi tulahuen strain Bu rapor boyunca kullanılır. T. cruzi 'nin epimastigotes 'ini ışık ortamında koruyun (% 10 FCS, bkz. ek tablo 1). Kapağı güvenli bir şekilde kapatın ve kültür Flask 28 °C ' de tutun.
- Cas9 endonuclease limanları T. cruzi bir transgenik gerinim oluşturun. Cas9 kodlama dizisi ve G418 (neor) seçim işaretçisi içeren ifade plazmidlerin örnekleri Lander ve al.4 ve Peng ve al.5 ' te bulunabilir.
- Malzeme tablosundalistelenen kiti kullanarak, Elektroporasyon tarafından epimastigote içine yukarıdaki Plasmid transfect. 1 küvet için, 2 x 107 hücre aşağı spin, supernatant atın ve 100 μL ile pelletini Elektroporasyon tampon sağlanan ek çözüm içeren.
Not: Elektroporasyon tamponu, EM tampon24 (3:1 cytomix25 ve fosfat-sucrose tamponunun karışımı) ile değiştirilebilir. - 20-40 μg Plasmid ekleyin ve karışımı 2 mm 'lik boşluk Elektroporasyon küvetine aktarın. X-14 programı26kullanarak bir Elektroporasyon cihazı (bkz. malzeme tablosu) ile nabız uygulayın.
- Küvet içeriğini 5 mL LIT Orta (% 10 FCS) içeren bir T-25 Flask içine aktarın. 28 °C ' de 24 saat boyunca Flask 'i kuluçsa.
- 250 son konsantrasyonuna G418 μg/mL ekleyin ve 28 °C ' de inkübasyon işlemine devam edin. Bu yaklaşık 1 hafta non-transfected epimastigotes öldürmek için alır. G418 dirençli nüfus iyileşmeye başladıktan sonra, doygunluk önlemek ve ölü hücreleri seyreltmek için kültürü haftada bir veya iki kez geçiş yapın. İstikrarlı bir hücre hattının kurulması genellikle toplam 4 hafta sürer.
Not: Cas9 'nin kurucu ifadesi hücre5için bir yüktür Ise, Cas9 açık okuma çerçevesinin27' sinin hemen altında bulunan 3 '-UTR ' ı nastin geni ile konjugating ederek amastigote aşamasına özgü ifadeyi yapın. Amastigote özel Cas9 ifade Plasmid ayrıntılı açıklaması Takagi et al.22 bulunabilir
- Malzeme tablosundalistelenen kiti kullanarak, Elektroporasyon tarafından epimastigote içine yukarıdaki Plasmid transfect. 1 küvet için, 2 x 107 hücre aşağı spin, supernatant atın ve 100 μL ile pelletini Elektroporasyon tampon sağlanan ek çözüm içeren.
- Cas9-ifade T. cruzi ve memelinin konak hücrelerinin bir ev sahibi-parazit Co-Culture kurmak. Bu raporda, bir ev sahibi olarak 3T3-Swiss albino fibroblast hücresi kullanın.
- Ayırt T. cruzi epimastigotes metacyclic tripomastigotes içine. Hemasitometre kullanarak epimastigote kültürün hücre yoğunluğunu belirlemek ve 2.100 x g 'de 15 dakika santrifüjleme ile 5 x 107 hücreleri toplayın . Süpernatant atın ve 10 ml rpmi orta ile hücreleri pelletini. Paraziti 28 °C ' de 1 hafta28' de inküat.
- RPMI orta metacyclic tripomastigotes toplayın. Alt yüzeye yapışmış olan parazitleri rahatsız etmeden, Flask ve pipet 'i dikkatlice eğin. Orta bir konik tüp transfer ve Santrifüjü 15 dakika 2.100 x g. Süpernatant atın ve 5 ml dmem (% 10 FCS) ile paraziti pelletini.
Not: Parazit nüfus metacyclic tripomastigotes, epimastigotes ve bazı ara formları bir karışımıdır. Gerekli olmasa da, trypomastigote 'yi DEAE iyon değişimi Kromatografi29ile yalıtabilirsiniz. Alternatif olarak, epimastigotes lizis30tamamlamak için onlara bağlı aktif serum ile parazitler inkükleme tarafından ortadan kaldırılabilir. - Seed 3T3-Swiss albino fibroblast hücre için 60-70% konfluency, ya da yaklaşık 1.7-2.0 x 106 hücreler 5 ml dmem (10% FCS) T-25 kültür Flask. Büyüme ortamını kaldırın ve adım 1.3.2 parazit karışımı uygulayın. Enfeksiyon kurmak için 37 °C ' de% 5 CO2 altında, nemlendirici bir kuluçk içinde 24 saat inküye yapın.
- Ortak kültürü DMEM (% 10 FCS) ile iki kez yıkayarak ev sahibi 3T3 hücrelerinin dışında kalan parazitleri çıkarın.
- Bir kez Co-kültür doymuş, Passage amastigote-enfekte ev sahibi hücreler tripsinization tarafından. Orta aspirate ve PBS ile bir kez kültürü durulayın. Tüm kültür yüzeyini kapsayacak şekilde 1 mL 0,05% tripsin solüsyonu uygulayın ve ekli ana bilgisayar hücreleri gevşek olana kadar oda sıcaklığında birkaç dakika boyunca inküye yapın. Hücreler üzerinde 3 mL DMEM (% 10 FCS) temizleyerek hücreleri Flask yüzeyinden ayırın.
- Müstakil konak hücrelerini konik bir tüpün içine aktarın ve 300 x g 'de 3 dakika santrifüj yapın . Süpernatant aspirate ve 3 ml taze dmem (10% FCS) ile hücreleri pelletini. Bu adım, kalan epimastigotes ortadan kaldırmak için yardımcı olur. 9 mL DMEM (% 10 FCS) içeren temiz bir T-75 Flask içine tüm aktarın. Trypomastigote kadar kültür supernatant içine serbest bırakılana kadar kültürü devam.
- Haftada iki kez tripsinizasyon ile geçiş yaparak ortak kültürü koruyun. Bir kez 70-80% ev sahibi nüfus enfekte olur, düzenli olarak 5:1 (yerine: taze), kültür bozulması önlemek için oranında enfekte olmayan ana 3T3 hücreleri ekleyin. Trypomastigote karayoluna sürekli Eğer konak hücreleri ve T. cruzi arasındaki denge düzgün korunur.
2. Tripomastigotların EA 'ya farklılaşması
- Bu denemeden önceki gün, ana bilgisayar paraziti ortak kültürünün büyüme ortamını kaldırın ve önceki günlerde ana bilgisayar hücrelerinden serbest bırakıldı EA ve tripomastigotları yıkamak için taze DMEM (% 10 FCS) ekleyin. Düzenli deneyler en az iki T-75 confluent Co-kültür şişeler gerektirir.
-
Taze ortaya trypomastigotes hasat için bir konik tüp içine kültür süpernatant toplayın. Kalite için bir mikroskop (10X veya 20X objektif lens) altında örnek kontrol edin. Ana hücre enkaz varsa, kısaca numune Santrifüjü ve yeni bir tüp içine süpernatant transfer. Önemli sayıda EAs varsa, trypomastigotes aşağıdaki Swim-out prosedürü ile yalıtın.
- 2.100 x g 'de 15 dakika boyunca tripomastigotlar ve amastigotların karışımı aşağı döndürün . Tüp içinde orta 0.5-1.0 mL bırakarak, supernatant en atın.
Not: birim azaltma isteğe bağlıdır, ancak aşağıdaki adımı kolaylaştırır. - 1-2 h için 37 °c ' de Pelet, aktif tripomastigotların Pelet dışında yüzmesine izin verir (Şekil 2).
- Trypomastigotes içeren süpernatant 1,5 ml mikrosantrifüjler tüpüne aktarın.
- 2.100 x g 'de 15 dakika boyunca tripomastigotlar ve amastigotların karışımı aşağı döndürün . Tüp içinde orta 0.5-1.0 mL bırakarak, supernatant en atın.
- Trypomastigotes toplamak için 2.100 x g 'de 15 dk için konik tüp Santrifüjlü. Eğer Swim-out prosedürü yukarıda gerçekleştirildiğinde, 1,5 mL tüpünü, 4.000 x g 'de 2 dk. trypomastigote Pelet için Santrifüjüne çıkarın. Süpernatant atın.
- % 0,4 BSA19ile tamamlayıcı 20 mm MES (pH 5,0) ile tamponlu dmem 5 ml ile Pelet resuspend. Paraziti T-25 kültür şişine aktar. Kapağı serbest bırakın. Aşırı doygunluk hücre ölümü olasılığını artırır çünkü hücre yoğunluğu 1 x 107 hücreler/ml etrafında veya altında olmalıdır.
Not: DMEM rengi turuncu değil, sarı olmalıdır. Orijinal DMEM yüksek tampon kapasitesine sahipse, 20 mM MES (pH 5,0) pH azaltmak için yeterli değildir. Orta pH bu durumda HCl eklenmesi ile ayarlanması gerekir. Asidik ortam 4 °C ' de tutulabilir, ancak 1 aydan fazla değildir. - 37 °C ' de,% 5 CO2 ' nin altında, nemlendirici bir inkükote kültür Flask kuluçat. % 95 civarında parazitlerin 24 saat sonra amastigotlar arasında farklılaştırır.
3. EA elektroporasyonu
- GRNA 'yı Electroporation için hazırlayın. Bu, in vitro transkripsiyon veya sadece bir üreticiden sentetik RNA oligonükleotidler satın alarak yapılabilir. Bu raporda, Integrated DNA Technologies, Inc. ' den crRNA ve tracrRNA kullanılmaktadır.
- 2.100 x g 'de 15 dakika boyunca EAs kültürünü santrifüjle . Süpernatant atın.
- 1 x 108 hücreli/ml son hücre yoğunluğuna sağlanan ek çözüm içeren Elektroporasyon tampon ile Pelet resuspend.
Not: em tampon malzeme tablosundalistelenen Elektroporasyon tampona kıyasla daha fazla hücre ölümlerine neden olur; Bu nedenle, amastigote transfeksiyon için tavsiye edilmez (ek Şekil 1). - Aliquot 100 μL resuspended parazitler (1 x 107 hücreler) Içine 1,5 ml mikrosantrifüjü tüpler. 5-10 μg gRNA ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın.
- Karışımı 2 mm 'lik boşluk Elektroporasyon küvetine aktarın. X-14 programı kullanarak, Elektroporasyon cihazı ile nabız uygulayın.
- Küvet içeriğini, 5 mL 'Lik ön ısıtılmış ışık orta (% 10 FCS) içeren bir T-25 Flask içine aktarın. Kapağı gevşek bırakın ve 37 °C ' de 5% CO 2 ' nin altında flask ' ı inkoyun.
- Hücre büyümesini (Bölüm 4) veya ana hücre enfeksiyonuna (Bölüm 5) sonra hücreler arası amastigotlar olarak izleyin.
4. nakavt hücrelerinin büyümesini Axenic amastigotes olarak izleme
- EAS kültür ortamının altına yerleşmek, bu yüzden yavaşça çözüm içine pelletini için Flask sallamak. Pipetleme ile Flask yüzeyini yıkamak, bazı hücreler Flask 'a yapışması gibi yardımcı olur.
- 20 μL amastigote kültürü ile 1 μL propidium iyodide (PI) solüsyonu (20 μg/mL) karıştırın.
Not: Kültürü daha uzun süre inkükalörün dışında bırakmayın. Sıcaklık, axenik proliferasyonu sağlayan faktörlerden biridir22. - Numuneyi hemokytometer üzerine uygulayın ve floresan mikroskobu altında gözlemleyin. PI hasar görmüş hücre membranı ile ilgilidir, ancak canlı hücrelerden hariç tutulur. PI (ex/em 570 nm/602 Nm) tarafından lekelenmez uygun formları sayısını saymak.
5. Inhücre amastigotes olarak nakavt hücrelerinin büyümesini izleme
- DMEM (10% FCS) ile 12-kuyu plaka tohum ev sahibi 3T3 hücreler. Hücre yoğunluğu 70-80% konfluency veya yaklaşık 3 x 105 hücre başına ayarlayın.
Not: Formları motil olmadığından, ana hücreler tarafından büyüme yüzeyinin çoğunu kapsayan enfeksiyon verimliliğini artırır. - Electroporation bir gün sonra santrifüjleme tarafından adım 3,6 nakavt formları toplayın. Supernatant atın ve 2 ml dmem (10% FCS) ile paraziti pelletini.
- Ana hücre kültüründen orta kaldırın ve resuspended amastigotes uygulayın. Enfeksiyon çokluğu 20 veya daha yüksek olmalıdır. Astigotların enfeksiyon kurmasına izin vermek için plakası 37 °C ' de 5% CO2 ' nin altında 2 gün boyunca kulbe eder.
Not: Enfeksiyon süresi amaca bağlı olarak 1 gün olabilir. - Temizle EAs, ana bilgisayar hücrelerinin dışında DMEM (% 10 FCS) ile iki kez kalmıştır.
- Ev sahibi-parazit ortak kültürüne taze DMEM (% 10 FCS) ekleyin ve 2 gün ek olarak 37 °C ' de inkübasyon işlemine devam edin.
-
Enfeksiyon verimliliğini değerlendirmek için, konak hücrelerinin ve hücre içi amastigote çekirdekleri görselleştirin.
Not: çekirdekler doymuş Co-Culture örtüşme eğilimindedir. Sabitleme ve boyama öncesinde alt hücre yoğunluğu (1:5 seyreltme gibi) hücreleri yeniden kaplama daha kolay çekirdekler saymak için yardımcı olur.- Kültür ortamını kaldırın ve hücreleri düzeltmek için PBS 'de 1 mL% 10 formalin çözeltisi uygulayın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inküye yapın.
- 1 μg/mL Hoechst 33342 ve 0,1% Triton X-100 içeren 1 mL PBS ile formalin çözümünü değiştirin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inküye yapın.
- Hoechst solüsyonu çıkarın ve hücreleri PBS ile bir kez durulayın. 1 mL taze PBS ekleyin.
- Floresan mikroskobu altında gözlemlemek ve küçük parazit çekirdekleri ile ilişkili ana hücre çekirdeğini belirlemek (Şekil 4). 2 ' den fazla formları içeren ana hücreler enfekte olarak kabul edilmelidir, verimsiz ilk enfeksiyon veya yıkanmamış EAS dahil değil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Swim-out prosedürü ile tripomastigotların izolasyonu
Swim-out prosedürü ile eski EAs kontamine taze tripomastigotes hasat için, hücre granül en az 1 h için inkübe gerekir. 2 ' den fazla h için Pellet kulyüzle önemli ölçüde çözelti yüzme tripomastigotes sayısını artırmaz ( Şekil 2B). Bu özel deney, ilk karışımı tripomastigote yüzdesi% 38 oldu ve Swim-Out sonra yüzdesi herhangi bir zaman noktalarında% 98 üzerinde oldu. İki T-75 confluent Co-kültür flarlarından, biz rutin bu Swim-Out protokolü tarafından saf tripomastigote 3-4 x 107 hücreleri elde.
Akik kültür olarak nakavt amastigote büyüme izleme
T. cruzi'nin diğer gelişimsel aşamalarının aksine, flagellar-Less formları pratikte statik olarak kullanılır. Böylece, PI ile boyama canlı formları ölü olanlardan ayırt etmek için yardımcı olur. PI bozulmamış hücre membranı için geçirmez ama kolayca ölü hücreler nüfuz (Şekil 3A). Temel gen, TcCGM1 (tcclb. 511807.80) karşısında Grna ile transferasyon yapan amastigotes, Grna 'yı T. cruzi genom 'a homolog olmayan alan kontrol grubuna kıyasla önemli bir büyüme kusur gösterdi (Şekil 3B).
Hücre içi formları olarak nakavt parazitlerin büyüme izleme
Amastigote aşamasında hedef genin esaslığı da, nakavt T. cruzi 'nin büyüme fenotipinin hücre içi amastigote olarak değerlendirilmesi ile gösterilebilir (Şekil 4). Küçük T. cruzi çekirdekleri ile ilişkili olan ana çekirdeklerin kesir önemli ölçüde TcCGM1-Ko grup kontrol grubuna kıyasla daha düşük oldu.
Etap spesifik geni nakavt amastigote ve tripomastigote aşamalarında fenotikotik fark neden olur
Paraflagellar çubuk bileşeni PAR1 son derece tripomastigote aşamasında ifade edilir, ama T. cruziayı amastigote aşamasında downdüzenlenmiş22,31. Nitekim, TcPAR1 (tcclb. 506755.20) karşı Grna transfeksiyon ÖNEMLI ölçüde EA büyümesini etkilemez 4 gün akenik Kültür (Şekil 5B). ev sahibi hücre istilası tarafından izlenen gRNA transfeksiyon, TcPAR1-Ko ' nın, enfekte olan ana hücre hücrelerinin fraksiyonu açısından 4 gün sonrası enfeksiyona (Şekil 5c) kadar hücre dışı amastigotların büyümesini inhibe etmediğini de göstermiştir. Bireysel ana bilgisayar hücresindeki parazitlerin sayısı, ya (ek Şekil 2) nakavt tarafından etkilenmez gibi görünmüyor. Bu sonuçlar TcPAR1 T. cruzi amastigote aşamasında gerekli olmadığını gösterir.
Bununla birlikte, ev sahibi hücrelerden oluşan tripomastigotların sayısı 5 gün sonra enfeksiyondan dolayı TcPAR1-Ko Co-Culture ' d a, kontrol Co-Culture (Şekil 5D) ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşüktür. Ayrıca, çıkış sonrası önce ev sahibi 3T3 hücre içinde farklılaşan tripomastigotes kontrol grubunda oldukça aktif olduğu ortaya çıktı (Tamamlayıcı film 1) ama TcPAR1-Ko grubunda (Tamamlayıcı Filmler 2) halsiz görünüyordu. Bu sonuçlar, TcPAR1 'in, amastigote sahnesinde olmadığı halde, egression 'a yardım etmek için motilite sağlayarak, T. cruzi'nin tripomastigote aşamasında önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir.
Şekil 2: trypomastigote 'nin Swim-out prosedürü Ile izolasyonu. (A) protokolün şematik temsili. Kırmızı = tripomastigote varlığı. (B) belirtilen zaman noktalarında Pelet dışında swum olan tripomastigotların sayısı. İlk granül toplam 3 x 107 parazitler,% 38 olan tripomastigotes ve geri kalanı amastigotes vardı. Deneyler triplicate ve ortalama değerleri (± SD) çizilir yapılmıştır. Çözelti tripomastigotes saflığı herhangi bir zaman noktalarında% 98 üzerindedir. (C) Swim-out işleminden önce parazitlerin mikroskopisi görüntüleri (sol), bir Pelet (orta) dışarı swum var tripomastigotes, ve bir Pelet kalan parazitler (sağda) sonra 1 h inkübasyon. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 3: aksiyenik amastigote 'Nin büyüme izlenmesi. (A) propidium iyodür (PI) dışlama tahlil. Parlak alan (sol), floresan kanal (orta) ve kaplanmış görüntü (sağ) bir hemasitometre EA mikroskopisi görüntüleri. Sarı oklar PI lekeli ölü hücreleri gösteriyor. Ölçek çubukları = 20 μm. (B) TcCGM1 (açık daire) karşı grnas ile transfeksiyon sonra Cas9-ifade formları hücre sayımı ve T. cruzi genom (kapalı Daire) hiçbir Homoloji ile Grna kontrol. Triplicates içinde elektroporasyonlar yapıldı ve ortalama değerler (± SD) çizilmiş. (* * p < 0,01 tarafından Welch 's t-test). Bu rakam Takagi ve ark. 22 ' den değiştirildiBu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Ana İstiladan sonra nakavt formları büyümesi. (A) TcCGM1 ve kontrol Grna karşı grnas transfekte formları hücre içi çoğaltma sonra ev sahibi-parazit Co-Culture nükleer boyama. Grna-transfected EAS Elektroporasyon sonra 1 gün 3T3 hücreler üzerine uygulanan ve 2 gün boyunca ev sahibi hücreler bulaştırmak için izin verildi. Ev sahibi hücrelerin dışında kalan amastigotlar yıkıldı ve ev sahibi-parazit ortak kültürü ek olarak 2 gün boyunca inkübe edildi. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu rakam kontrol formları (siyah Bar) ve TcCGM1-Ko formları (gri bar) tarafından enfekte ev sahibi 3T3 hücrelerin yüzde Takagi ve al.22 (B) değiştirildi. Üç enfeksiyon deneylerinin ortalama (± SD) çizilen (* * p < 0,01, Welch 's t-test). Bu rakam Takagi ve ark. 22 ' den değiştirildiBu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: nakavt amastigote ve farklılaşmış tripomastigote arasındaki Phenotypic fark. (A) deneysel zaman satırının şematik temsili. (B) kontrol formları (siyah çubuk) ve TcPAR1-Ko formları (gri bar) için 4 gün sonrası transfeksiyon sırasında akik amastigote hücre sayıları. Üç Elektroporasyon deneyinin ortalama değerleri (± SD) çizilmiş (NS: önemli değil, Mann-Whitney U testi). (C) kontrol amastigote (Black Bar) ve TcPAR1-Ko amastigote (Gray Bar) ile 4 gün sonra enfekte olan ev sahibi 3T3 hücrelerinin yüzdesi. Üç kültür kuyularının ortalama değerleri (± SD) çizilmiş (a.d.: önemli değil, Mann-Whitney U testi). (D) kontrol Co-Culture (siyah Bar) ve TcPAR1-Ko Co-Culture (Gray Bar) için 5 gün sonrası enfeksiyonda kültür ortamına yayımlanan tripomastigote sayısı. Üç kültür kuyularının ortalama değerleri (± SD) çizilmiş (* p < 0,05, Mann-Whitney U testi). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Ek tablo 1: LIT orta bileşimi. YANıK orta ATCC 1029 göre hazırlandı, disodyum hidrojen fosfat miktarı dışında. Tabloyu indirmek Için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 1: Elektroporasyon tamponunun amastigote hücre viability üzerinde etkisi. EA, Elektroporasyon buffer veya em tampon olarak electroporated. Amastigote, canlı ve ölü amastigotların sayısını saymak için 24 saat sonra PI ile lekelendi. Her grupta ve hiçbir nabız grubunda ölü hücrelerin yüzdeleri çizilmiş. Üç Elektroporasyon deneyinin ortalama (± SD) gösterilme (* p < 0,05, a.d.: önemli değil, Kruskal-Wallis testi). Şekil indirmek Için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: nükleer lekeli TcPAR1-Ko mikroskopisi görüntüleri ve hücre içi amastigotes kontrol. Ev sahibi 3T3 hücrelerin Co-Culture ve transfekte formları sabit ve 4 gün sonrası enfeksiyon lekelenmiş. Ölçek çubukları: 20 μm. lütfen buraya tıklayarak figürü indirin.
Ek şekil 3: Cas9-ifade epimastigote büyüme fenotipi. Wildtype epimastigotes (WT) hücre sayısı, Cas9-EGFP (Cas9-EGFP) ' ı ifade eden epimastigotes, ve amastigote-özel 3 '-UTR (Cas9-EGFP-Ayautr) Yönetmeliği kapsamında Cas9-EGFP ' ı ifade eden epimastigotes günlük ölçekte çizilir. Epimastigotler 28 °C ' de ışık ortamında (% 10 FCS) yetiştirildiler. Parazit hücre yoğunluğu 0 gün 1 x 106 hücreler/ml olarak ayarlandı. Toplu hücre sayısı, toplam seyreltme faktörüyle çarpılarak hücre yoğunluğu olarak hesaplanır. Üç kültür flsorunda ortalama (± SD) gösterilir (* p < 0.05, a.d.: önemli değil, Kruskal-Wallis testi). Şekil indirmek Için lütfen tıklayınız.
Ek film 1: kontrol Co-kültür mikroskopisi video görüntü. Kontrol amastigotes farklılaşmış tripomastigotes sayısı ve activeness. Video görüntü 5 gün sonrası enfeksiyon gösterilir. Filmi indirmek Için lütfen tıklayınız.
Ek film 2: TcPAR1-Ko Co-Culture mikroskopisi video görüntü. TcPAR1-KO amastigotes 'ten farklılaşmış tripomastigotların sayısı ve activeness. Video görüntü 5 gün sonrası enfeksiyon gösterilir. Filmi indirmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz T. cruzi formları, axenik kültürün Crispr/Cas9-aracılı gen nakavt, doğrudan Cas9-ifade EA içine Grna electroporating tarafından kullanılabilecek göstermiştir. Bu şekilde, özellikle amastigote aşamasında hedef genin esaslığı diğer Gelişimsel aşamalara girmeden değerlendirilebilir.
Amastigote transfeksiyonunun başka bir faydalı yönü, çok sayıda hedef genler için test kolaylığı. Bir kez Co-Culture Cas9-ifade T. cruzi ve ev sahibi memeli hücre kuruldu, sadece birkaç gün içinde doku-türevi tripomastigotes dönüştürmek için alır EA ve transfect Grna nakavt amastigotes elde etmek. gRNA her hedef gen için uyarlanmış olması gereken tek malzemedir, ancak sentetik gRNA üretici sayısı kullanılabilir, bu yüzden sadece satın alınabilir. Hedef genlerin sahne özel şartında analiz etmek için alternatif bir yöntem bir indüklenebilir nakavt sistemi32kurmak olacaktır. Bu durumda, plazmidler her hedef geni için inşa edilmelidir ve epimastigote aşamasında parazitin transferitlerin ilaç seçimine izin vermek için nakli yapılmalıdır, çünkü Plasmid transfeksiyon verimliliği Grna 'dan çok daha düşüktür (plazmid için <% 15 26 Grna22için >% 96 gerekiyordu). Seçilen transferiler, ana hücreleri bulaştırmak için metacyclic tripomastigotes içine ayırt edilmelidir sonunda hücre içi amastigote bir nakavt neden. Tüm bu süreç 1-2 ay sürer.
Bu raporda, axenik amastigote kültüründe ölü hücreleri ayırt etmek için PI 'yi kullandık ve hücre yoğunluğunu bir hemokytometreye göre niceli Alternatif olarak, resazurin randıman tahlili gibi metabolik sınavlar, yüksek verimlilik formatı için daha uygun olan canlı amastigotların sayısını tahmin etmek için kullanılabilir. Bizim elimizde, 1 x 105 formları başına iyi verim yeterli redoks etkinliği sonra bir resazurin tahlil tarafından tespit edilecek 5 inkübasyon h.
Bir Cas9-ifade hücre hattı kurulması bir dezavantajı potansiyel hücresel yük ve non-spesifik bölünme Cas9 ekspresyonu5,33nedeniyle. Cas9 'nin kurucu ifadesinin, T. cruzi4,6,7,8' in büyüme oranı üzerinde hiçbir etkisi olmadığını gösteren birkaç rapor vardır. Ancak, bir örnekte5 ve aynı zamanda bizim elimizde, Cas9-ifade paraziti vahşi türe kıyasla yavaş büyüme gösterdi. Bu konunun üstesinden gelmek için, Cas9 ' nın amastigote aşaması22' ye ifade edilmesini kısıtlamak üzere amastigote-specific 3 '-UTR ' ı istihdam ettik. Cas9 açık okuma çerçevesi için asalak 3 '-UTR konjugasyonu transgenik parazitin çoğaltma hızını restore (ek şekil 3), böylece sürekli olarak trypomastigotes sağlamak için sağlam ana-parazit Co-Culture üreten in vitro yok etmek. Son zamanlarda, diğer gruplar wildtype parazite Grna/Cas9 RNP kompleksi giriş T. cruzi7,9genom düzenleme neden olabilir göstermiştir. Bu yöntem parazite daha az stresli bir yaklaşım olarak keşfedilmelidir9, memelinin hücrelerinde çalışma RNP kullanımı istenmeyen off-hedef genom düzenleme azaltır önerdiği, kısa yarı ömrü nedeniyle Cas9 protein34.
Protokole başka bir isteğe bağlı değişiklik Homolog rekombinasyon için bir şablon olarak donör DNA ortak transfeksiyon olacaktır. Bu donör DNA, çift telli DNA4,5,8,35 ya da tek telli bir form olarak, satır içi ve aşağı akış sitesi için homolog dizileri içeren bildirdi oligonükleotid7,9, Cas9 nuclease neden çift telli break onarım sürecini kolaylaştırır. Bazı raporlar mikrohomoloji aracılı uç donör şablonu olmadan katılma belirtmek rağmen ve bir silme mutasyon5, mutasyon siteye tanımlanan dizinin giriş, yine de onaylamak için yardımcı olabilir başarılı genom düzenleme, çünkü bazı durumlarda gen nakavt DNA kanıtı göstermek zordur, hedef protein azaltma ve fenotipi sonuç tavsiye olsa bile hedef geni mutasyona uğramış4.
Cas9/gRNA RNP transfeksiyon ve donör DNA 'nın ortak transfeksiyonu, protokol açıklamasını basitleştirmek ve EA 'nın hazırlanması ve bundan sonra akenik kültürün kullanımı üzerine odaklanmak için bu raporda gösterilmez. Eğer bu deneyler yapmak isterse, sadece Electroporation bileşenlerini değiştirerek yapılabilir.
Deneysel bir araç olarak T. cruzi EA kullanarak bizim Yöntem potansiyel olarak Plasmid transfeksiyon ve ilaç etkinliği testi22ile geçici gen ifadesi de dahil olmak üzere, aşamaya özgü çeşitli çalışmalar sağlar. Bununla birlikte, bu yaklaşımın etkinliği sadece Tulahuen gerginliğinde bugüne kadar test edilmiştir. T. cruzi suşları oldukça farklı olduğundan, bu protokolün diğer suşlar için uygulanabilirliği incelenmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, ifşa etmek için ilgi çakışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, kısmen JSPS KAKENHı Grant numarası 18K15141 için YT için desteklenmektedir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20% formalin solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 068-03863 | fixing cells |
| 25 cm2 double seal cap culture flask | AGC Techno Glass | 3100-025 | |
| 75 cm2 double seal cap culture flask | AGC Techno Glass | 3110-075 | |
| All-in One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 | |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for Control) | IDT | custom made | target sequence = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcCGM1) | IDT | custom made | target sequence = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcPAR1) | IDT | custom made | target sequence = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA | IDT | 1072532 | to anneal with crRNA |
| Amaxa Nucleofector device | LONZA | AAN-1001 | electroporation |
| Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | LONZA | VMI-1021 | electroporation |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | component of the medium for in vitro amastigogenesis |
| Burker-Turk disposable hemocytometer | Watson | 177-212C | cell counting |
| Coster 12-well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3513 | |
| DMEM | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 044-29765 | culture medium |
| Fetal bovine serum, Defined | Hyclone | SH30070.03 | heat-inactivate before use |
| G-418 Sulfate Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 077-06433 | selection of transformant |
| Hemin chloride | Sigma-Aldrich | H-5533 | component of LIT medium |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | staining of nuclei |
| Liver infusion broth, Difco | Becton Dickinson | 226920 | component of LIT medium |
| MES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 349-01623 | component of the medium for in vitro amastigogenesis |
| PBS (–) | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 166-23555 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | staining of dead cells |
| RPMI 1646 | Sigma-Aldrich | R8758 | medium for metacyclogenesis |
References
- World Health Organization. (WHO) Fact sheet: Chagas disease (American trypanosomiasis). , [updated 2017 Mar; cited 2017 Aug], at http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/ (2017).
- Clayton, J. Chagas disease 101. Nature. 465 (n7301_supp), S4-S5 (2010).
- Apt, W. Current and developing therapeutic agents in the treatment of Chagas disease. Drug Design, Development and Therapy. 4, 243-253 (2010).
- Lander, N., Li, Z. H. H., Niyogi, S., Docampo, R. CRISPR/Cas9-induced disruption of paraflagellar rod protein 1 and 2 genes in Trypanosoma cruzi reveals their role in flagellar attachment. mBio. 6 (4), e01012 (2015).
- Peng, D., Kurup, S. P., Yao, P. Y., Minning, T. A., Tarleton, R. L. CRISPR-Cas9-mediated single-gene and gene family disruption in Trypanosoma cruzi. mBio. 6 (1), e02097-e02114 (2015).
- Romagnoli, B. A. A., Picchi, G. F. A., Hiraiwa, P. M., Borges, B. S., Alves, L. R., Goldenberg, S. Improvements in the CRISPR/Cas9 system for high efficiency gene disruption in Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 178, 190-195 (2018).
- Burle-Caldas, G. A., Soares-Simões, M., Lemos-Pechnicki, L., DaRocha, W. D., Teixeira, S. M. R. Assessment of two CRISPR-Cas9 genome editing protocols for rapid generation of Trypanosoma cruzi gene knockout mutants. International Journal for Parasitology. 48 (8), 591-596 (2018).
- Costa, F. C. Expanding the toolbox for Trypanosoma cruzi: A parasite line incorporating a bioluminescence-fluorescence dual reporter and streamlined CRISPR/Cas9 functionality for rapid in vivo localisation and phenotyping. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), e0006388 (2018).
- Soares Medeiros, L. C. High-Efficiency Genome Editing in Protozoan Parasites Using CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins. mBio. 8 (6), (2017).
- Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An axenic amastigote system for drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (4), 818-822 (1997).
- Bates, P. A. Axenic culture of Leishmania amastigotes. Parasitology Today. 9 (4), 143-146 (1993).
- Ravinder, R., Bhaskar, B., Gangwar, S., Goyal, N. Development of luciferase expressing Leishmania donovani axenic amastigotes as primary model for in vitro screening of antileishmanial compounds. Current Microbiology. 65 (6), 696-700 (2012).
- Nühs, A. Development and Validation of a Novel Leishmania donovani Screening Cascade for High-Throughput Screening Using a Novel Axenic Assay with High Predictivity of Leishmanicidal Intracellular Activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), 1-17 (2015).
- De Rycker, M. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
- Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
- Pescher, P., Blisnick, T., Bastin, P., Späth, G. F. Quantitative proteome profiling informs on phenotypic traits that adapt Leishmania donovani for axenic and intracellular proliferation. Cellular Microbiology. 13 (7), 978-991 (2011).
- Andrews, N. W., Hong, K. S. U., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Stage-specific surface antigens expressed during the morphogenesis of vertebrate forms of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 64 (3), 474-484 (1987).
- Pan, S. C. Trypanosoma cruzi: intracellular stages grown in a cell-free medium at 37 C. Experimental Parasitology. 45 (2), 215-224 (1978).
- Tomlinson, S., Vandekerckhove, F., Frevert, U., Nussenzweig, V. The induction of Trypanosoma cruzi trypomastigote to amastigote transformation by low pH. Parasitology. 110 (05), 547 (1995).
- Ley, V., Andrews, N. W., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Amastigotes of Trypanosoma cruzi sustain an infective cycle in mammalian cells. Journal of Experimental Medicine. 168 (0022-1007 (Print)), 649-659 (1988).
- Bonfim-Melo, A., Ferreira, E. R., Florentino, P. T. V., Mortara, R. A. Amastigote Synapse: The Tricks of Trypanosoma cruzi Extracellular Amastigotes. Frontiers in Microbiology. 9, 1341 (2018).
- Takagi, Y., Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K. Utilization of proliferable extracellular amastigotes for transient gene expression, drug sensitivity assay, and CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in Trypanosoma cruzi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 13 (1), e0007088 (2019).
- Fernandes, J. F., Castellani, O. Growth characteristics and chemical composition of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 18 (2), 195-202 (1966).
- Oberholzer, M., Lopez, M. A., Ralston, K. S., Hill, K. L. Approaches for Functional Analysis of Flagellar Proteins in African Trypanosomes. Methods in Cell Biology. 93, 21-57 (2009).
- van den Hoff, M. J. B., Moorman, A. F. M., Lamers, W. H. Electroporation in ‘intracellular’ buffer increases cell survival. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2902-2902 (1992).
- Pacheco-Lugo, L., Díaz-Olmos, Y., Sáenz-García, J., Probst, C. M., DaRocha, W. D. Effective gene delivery to Trypanosoma cruzi epimastigotes through nucleofection. Parasitology International. 66 (3), 236-239 (2017).
- Coughlin, B. C., Teixeira, S. M., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Amastin mRNA abundance in Trypanosoma cruzi is controlled by a 3’-untranslated region position-dependent cis-element and an untranslated region-binding protein. The Journal of Biological Chemistry. 275 (16), 12051-1260 (2000).
- Shaw, A. K., Kalem, M. C., Zimmer, S. L. Mitochondrial Gene Expression Is Responsive to Starvation Stress and Developmental Transition in Trypanosoma cruzi. mSphere. 1 (2), (2016).
- Chao, D., Dusanic, D. G. Comparative studies of the isolation of metacyclic trypomastigotes of Trypanosoma cruzi by DEAE ion exchange chromatography. Zhonghua Minguo wei sheng wu ji mian yi xue za zhi (Chinese Journal of Microbiology and Immunology). 17 (3), 146-152 (1984).
- Nogueira, N., Bianco, C., Cohn, Z. Studies on the selective lysis and purification of Trypanosoma cruzi. The Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 224-229 (1975).
- Minning, T. A., Weatherly, D. B., Atwood, J., Orlando, R., Tarleton, R. L., Tarleton, R. L. The steady-state transcriptome of the four major life-cycle stages of Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 10, 370 (2009).
- Rico, E., Jeacock, L., Kovářová, J., Horn, D. Inducible high-efficiency CRISPR-Cas9-targeted gene editing and precision base editing in African trypanosomes. Scientific Reports. 8 (1), 7960 (2018).
- Fu, Y. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chiurillo, M. A., Lander, N., Bertolini, M. S., Storey, M., Vercesi, A. E., Docampo, R. Different roles of mitochondrial calcium uniporter complex subunits in growth and infectivity of Trypanosoma cruzi. mBio. 8 (3), e00574-e00617 (2017).
