Summary
여기에서, 우리는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여, Trypanosoma cruzi의 세포외 amastigote로 유전자 녹아웃을 소개하는 프로토콜을 기술합니다. 성장 표현형은 축세포 배양의 세포 계수 또는 숙주 세포 침입 후 세포 내 아마스티고테의 증식에 의해 추적될 수 있다.
Abstract
Trypanosoma cruzi는 주로 라틴 아메리카에서 Chagas' 질병을 일으키는 원인이 되는 병원성 원생 동물 기생충입니다. T. cruzi에대하여 새로운 약 표적을 확인하기 위하여는, 기생충의 포유류 단계에서 표적 유전자의 본질성을 확인하는 것이 중요합니다, amastigote. T. 크루지의 아마스티고테스는 숙주 세포 내부에 복제; 따라서, 다른 발달 단계를 거치지 않고 녹아웃 실험을 수행하는 것은 어렵다. 최근, 우리 그룹은 아마스티고테가 아마스티고테와 같은 특성을 잃지 않고 최대 10 일 동안 축으로 복제 할 수있는 성장 상태를보고했습니다. 이 시간적인 축 식 amastigote 문화를 사용하여, 우리는 성공적으로 유전자 녹아웃을 일으키는 원인이 되기 위하여 Cas9 표현 amastigote에 직접 gRNA를 소개하고 amastigote 단계에서 독점적으로 그들의 표현형을 분석했습니다. 이 보고서에서, 우리는 시험관 내에서 파생 된 세포 외 amastigotes를 생산 하는 상세한 프로토콜을 설명 하 고 CRISPR/Cas9 중재 녹아웃 실험에서 축 배양 활용. 녹아웃 amastigotes의 성장 표현형은 축세포 배양의 세포 수에 의해, 또는 숙주 세포 침략 후에 세포 내 amastigote의 복제에 의해 평가될 수 있습니다. 이 방법은 일반적으로 형질 전환 또는 녹아웃 amastigote생산에 관여하는 기생충 단계 분화를 우회합니다. 시간적 축아제아스티고트 문화의 활용은 T. cruzi에서 단계별 연구의 실험적 자유를 확장할 가능성이 있다.
Introduction
Trypanosoma cruzi는 라틴 아메리카1에서주로 널리 퍼진 Chagas'질병의 원인 에이전트입니다. T. cruzi는 곤충 벡터와 포유류 호스트2사이를 이동하는 독특한 라이프 사이클 단계를 가지고 있습니다. T. cruzi 혈액 을 빠는 triatomine 버그의 midgut에 epimastigote로 복제 하 고 인간 또는 동물 호스트에 증착 되기 전에 그것의 뒷글에 감염 성 메타 세포 trypomastigote로 분화. trypomastigote 물린 사이트를 통해 또는 점 막을 통해 호스트 몸으로 되 면, 기생충 호스트 세포를 침공 하 고 amastigote 라는 편모 없는 둥근 형태로 변환. amastigote는 호스트 세포 내의 복제하고 결국 trypomastigote로 분화합니다, 이는 호스트 세포에서 파열하고 다른 호스트 세포를 감염시키기 위하여 혈류를 입력합니다.
현재 이용 가능한 화학치료제, 벤즈니다졸 및 니푸르티목스는 부작용을 일으키고 질병의 만성 단계에서효과가 없기 때문에 3, T. cruzi에 대한 새로운 약물 표적을 식별하는 것이 큰 관심사이다. 최근 몇 년 동안, CRISPR/Cas9 시스템은 GRNA 및 Cas9 4를 포함하는 별도의 또는 단일 플라스미드(들)의 형질전환에의해, Cas9의 안정적인 발현에 의해 T. cruzi에서유전자 녹아웃을 효과적으로 수행할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다. gRNA5,6,7 또는 gRNA8의전사 템플릿의 도입, 또는 미리 형성된 gRNA/Cas9 RNP 복합체의 전기화에 의해7,9. 이러한 기술 발전은 Chagas'질병의 약물 표적 연구를 가속화할 것으로 기대됩니다.
약물 개발을 진행하기 위해서는 포유류 숙주에서 기생충의 복제 단계이기 때문에 T. cruzi의amastigote에서 표적 유전자 또는 약물 후보 화합물의 효능의 본질성을 검증하는 것이 중요합니다. 그러나, 이것은 도전적인 작업, 때문에 방해 호스트 세포의 존재에 직접 조작 할 수 없습니다. 리슈마니아에서는 T. cruzi와밀접하게 관련된 원생 동물 기생충, 축아제 배양 방법이 개발되었으며 약물 스크리닝 검거 법제10,11,12, 13. 도끼 아마스티고테와 세포 내 아마스티고테스(14)사이의 화합물에 대한 감수성에 약간의 불일치가 있지만, 축배양을 유지하는 능력은 그럼에도 불구하고 연구할 귀중한 실험 도구를 제공합니다. 리슈마니아15,16의임상적으로 관련된 단계의 기본 생물학 . T. cruzi의경우, 자연적으로 발생하는 세포외 amastigotes의 존재에 관한 문헌 (EA)17 및 EA의 체외 생산17,18,19 거슬러 올라간다 수십 년 전. 또한, EA는 20의 전염성능력을 가지는 것으로 알려져 있으며, 이는 트라이포마스티고테보다 적기는 하지만, 아마스티고테 숙주 침공의 메커니즘은 최근 몇 년 동안 해명되었다(본피엠-멜로 등21). 그러나, Leishmania와는달리, EA는 T. cruzi에있는 실험 적인 공구로 이용되지 않았습니다, EA가 의무적인 세포내 기생충으로 여겨졌기 때문에, 따라서 실용적인에서 "복제 양식"으로 간주되지 않았기 때문에 감각.
최근 우리 그룹은 T. cruzi의 EA를 일시적인 축문화(22)로 활용하자고 제안했다. T. cruzi Tulahuen 균주의 아마스티고트는 37°C에서 LIT 배지에서 숙주 세포의 자유로운 복제를 최대 10일 동안 주요 열화 또는 아마티고테 유사 성질의 손실 없이 복제할 수 있다. 숙주 없는 성장 기간 동안, EA는 기존의 전기천공에 의한 외인성 유전자 발현, 트라이파노시드 화합물을 통한 약물 적정 분석, CRISPR/Cas9 매개 녹아웃에 의한 성장 표현형 모니터링에 성공적으로 활용되었다. 이 보고서에서, 우리는 시험관내에서 유래된 EA를 생산하고 녹아웃 실험에서 축산 아마스티고테를 활용하기 위한 상세한 프로토콜을 설명한다.
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Protocol
참고: 전체 실험 흐름에 대한 개요는 그림1에 설명되어 있습니다.
그림 1: EA를 사용한 녹아웃 실험개요. 조직 배양 유래 trypomastigotes는 EA로 수확되고 분화됩니다. gRNA는 전기 기공에 의해 Cas9 발현 아마스티고테로 형질전환되고, 녹아웃 아마스티고트의 성장 표현형은 축세포 복제또는 에 의해 평가된다. 호스트 세포 침략 후 세포 내 복제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 기생충 문화 준비
- 트라이파노소마 크루지의 툴라후엔 균주는 이 보고서 전반에 걸쳐 사용된다. LIT 배지에서 T. 크루지의 에피마스티고트 유지(FCS 10%, 보충표 1참조). 뚜껑을 단단히 닫고 배양 플라스크를 28°C로 유지합니다.
- Cas9 엔도누슬리스를 항하는 T. 크루지의 형질전환 균주를 생성합니다. Cas9 코딩 서열 및 G418(neo r) 선택마커를 포함하는 발현 플라스미드의 예는 Lander et al.4 및 Peng et al.5에서 확인할 수 있습니다.
- 재료표에 열거된 키트를 사용하여 상기 플라스미드를 전기 천공에 의해 에피마스티고트로 트랜스펙트한다. 큐벳 1개에 대해 2 x 107 셀을 스핀다운하고 상류물을 버리고 제공된 보충제 용액을 함유한 100 μL의 전기 천공 완충제로 다시 중단하십시오.
참고: 전기 천공 버퍼는 EM 버퍼 24(사이토믹스25 및 인산염 수크로오스 완충액의 3:1 혼합물)로 치환될 수 있다. - 플라스미드 20-40 μg를 넣고 혼합물을 2mm 간격 전기 화기 큐벳으로 옮긴다. X-14 프로그램26을사용하여 전기 개루 장치(재료 표참조)로 펄스를 적용합니다.
- 큐벳 내용물 5mL의 LIT 배지(10% FCS)가 들어 있는 T-25 플라스크에 옮김을 옮김을 옮니다. 24 시간 동안 28 °C에서 플라스크를배양합니다.
- G418을 최종 농도 250 μg/mL에 추가하고 28°C에서 인큐베이션을 계속합니다. 그것은 비 형질 감염 된 epimastigotes를 죽일 약 1 주 걸립니다. 일단 G418 저항하는 인구가 복구하기 시작하면, 포화를 피하고 죽은 세포를 희석하기 위하여 문화를 일주일에 한두 번 통과합니다. 안정한 세포주의 설치는 일반적으로 총 4 주가 걸립니다.
참고: Cas9의 구성발현이 세포(5)에 대한부담이라면, Cas9 오픈 판독 프레임(27)의 하류에 있는 아마스틴 유전자의 3'-UTR을 즉시하류에 결합시킴으로써 아마스티고테 단계에 특이적인 발현을 한다. 아마스티고테 특이적 Cas9 식 플라스미드에 대한 자세한 설명은 타카기 외22에서 확인할 수 있습니다.
- 재료표에 열거된 키트를 사용하여 상기 플라스미드를 전기 천공에 의해 에피마스티고트로 트랜스펙트한다. 큐벳 1개에 대해 2 x 107 셀을 스핀다운하고 상류물을 버리고 제공된 보충제 용액을 함유한 100 μL의 전기 천공 완충제로 다시 중단하십시오.
- Cas9-발현 T. 크루지 및 포유류 숙주 세포의 숙주 기생충 공동 배양을 확립한다. 이 보고에서, 숙주로서 3T3-스위스 알비노 섬유아세포 세포를 사용한다.
- T. 크루시 에피마스티고테스를 메타사이클 트리포마스티고테스로 차별화합니다. 혈세포계를 사용하여 상피 배양의 세포 밀도를 결정하고 2,100 x g에서 15 분 동안 원심분리에 의해 5 x 107 세포를 수집합니다. 상급체를 버리고 RPMI 배지의 10 mL로 세포를 다시 일시 중단합니다. 1 주28에대 한 28 °C에서 기생충을 배양.
- RPMI 매체에 메타 사이클 트리포 마시고테스를 수집합니다. 조심스럽게 플라스크를 기울이고 바닥 면에 부착 된 기생충을 방해하지 않고 용액을 피펫. 2,100 x g에서 15 분 동안 원원수 튜브와 원심 분리기로 매체를 옮긴다. 상급을 버리고 5 mL의 DMEM (10 % FCS)로 기생충을 다시 중단하십시오.
참고: 기생충 인구는 메타 시크 릭 트리포 마 스티 고테의 혼합물, epimastigotes, 그리고 일부 중간 형태. 필요하지는 않지만 DEAE 이온 교환 크로마토그래피(29)에의해 trypomastigote를 분리 할 수 있습니다. 대안적으로, epimastigotes는 활성 혈청으로 기생충을 배양하여 용해(30)를보완하기 위해 그들을 대상으로 함으로써 제거될 수 있다. - 시드 3T3-스위스 알비노 섬유아세포는 T-25 배양 플라스크에서 DMEM(10% FCS)의 5 mL에서 60-70% 동률, 또는 약 1.7-2.0 x 10 6세포를 나타낸다. 성장 배지를 제거하고 단계 1.3.2에서 기생충 혼합물을 적용합니다. 감염을 확립하기 위해 가습 된 인큐베이터에서 5 %CO2 미만에서 37 °C에서 24 시간 동안 배양하십시오.
- DMEM(10% FCS)과 공동 배양을 세척하여 숙주 3T3 세포 외부에 남아 있는 기생충을 2회 제거한다.
- 일단 공동 배양이 포화되면, 트립시네화에 의해 아마스티고테-감염된 숙주 세포를 통로에 감염시다. 배지를 흡인하고 PBS로 배양을 한 번 헹구는다. 전체 배양 표면을 커버하기 위해 0.05% 트립신 용액 의 1 mL을 적용하고, 부착 된 숙주 세포가 느슨해질 때까지 실온에서 몇 분 동안 배양한다. 3 mL의 DMEM (10% FCS)을 세포 위로 플러시하여 플라스크 표면으로부터 세포를 분리합니다.
- 분리된 숙주 세포를 원유관으로 옮기고, 300 x g에서 3분 동안 원심분리기를 한다. 상월체를 흡인하고 신선한 DMEM (10 % FCS)의 3 mL로 세포를 재중단시. 이 단계는 남아있는 epimastigotes을 제거하는 데 도움이됩니다. DMEM 9mL(10% FCS)를 함유한 깨끗한 T-75 플라스크에 모두 옮김을 옮니다. trypomastigote 문화 상급으로 출시 될 때까지 배양을 계속.
- 일주일에 두 번 트립시니화와 함께 통과하여 공동 문화를 유지합니다. 일단 호스트 인구의 70-80%가 감염되면, 배양 악화를 피하기 위하여 5:1(이월:신선)의 비율로 감염되지 않은 호스트 3T3 세포를 정기적으로 추가합니다. 트리포마스티고테는 숙주 세포와 T. 크루지 사이의 균형이 적절히 유지되는 경우 지속적으로 송신한다.
2. EA로 트리포마스티고테스의 차별화
- 본 실험 전날, 숙주 기생충 공동 배양의 성장 배지를 제거하고 신선한 DMEM(10% FCS)을 첨가하여 이전에 숙주 세포로부터 이미 방출된 EA 및 trypomastigotes를 씻어낸다. 정기적인 실험은 적어도 두 개의 T-75 플라스크가 필요합니다.
-
원추형 튜브에 배양 상류를 수집하여 갓 출현한 trypomastigotes를 수확합니다. 현미경(10x 또는 20x 대물 렌즈)으로 샘플을 확인하여 품질을 확인합니다. 숙주 세포 파편이있는 경우, 샘플을 잠시 원심 분리하고 상구체를 새 튜브로 옮김. 상당한 수의 EA가 있는 경우, 다음 의 스윔아웃 절차에 의해 trypomastigotes를 격리하십시오.
- 2,100 x g에서 15 분 동안 trypomastigotes와 아마스티고테스의 혼합물을 스핀 다운하십시오. 튜브에 매체의 0.5-1.0 mL를 떠나, 상류의 대부분을 폐기.
참고: 볼륨을 줄이는 것은 선택 사항이지만 다음 단계를 더 쉽게 만듭니다. - 펠렛을 37°C에서 1-2시간 동안 배양하여 활성 트리포마스티고트가 펠릿에서수영할 수 있도록 합니다(그림 2).
- 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에 trypomastigotes를 포함하는 상급을 전송합니다.
- 2,100 x g에서 15 분 동안 trypomastigotes와 아마스티고테스의 혼합물을 스핀 다운하십시오. 튜브에 매체의 0.5-1.0 mL를 떠나, 상류의 대부분을 폐기.
- 원원줄기를 2,100 x g에서 15분 동안 원원분리하여 트리포마스티고테스를 수집한다. 스윔 아웃 절차가 위에서 수행된 경우, 1.5 mL 튜브를 4,000 x g에서 2분 동안 원심분리하여 트립포마스티고테를 펠렛한다. 상급제는 버리십시오.
- 20 mM MES (pH 5.0)로 버퍼링 된 DMEM 5 mL로 펠릿을 다시 일시 중단하고 0.4 % BSA19로보충하십시오. T-25 배양 플라스크에 기생충을 전송합니다. 뚜껑을 느슨하게 둡니다. 세포 밀도는 과포화로 세포 사멸의 기회를 증가하기 때문에, 주위 또는 아래 1 x 107 세포 / mL이어야합니다.
참고: DMEM의 색상은 주황색이 아닌 노란색이어야 합니다. 원래 DMEM이 높은 버퍼링 용량을 가졌다면, 20 mM MES(pH 5.0)는 pH를 낮추기에 충분하지 않다. 배지의 pH는 이 경우 HCl을 첨가하여 조절되어야 한다. 산성 배지는 4°C에서 유지될 수 있지만, 1개월 이상 보관할 수 없다. - 가습 된 인큐베이터에서 5 %CO2 미만에서 37 °C에서 배양 플라스크를 배양합니다. 기생충의 약 95%는 24 시간 후에 amastigotes로 분화합니다.
3. EA의 전기 화
- 전기 개화를 위해 gRNA를 준비하십시오. 이것은 시험관 내 전사에 의해, 또는 단순히 제조 업체에서 합성 RNA 올리고 뉴클레오티드를 구입하여 수행 할 수 있습니다. 이 보고에서는, 통합 DNA 기술, Inc.에서 crRNA 및 tracrRNA가 이용됩니다.
- 2,100 x g에서 15 분 동안 EA의 문화를 원심 분리합니다. 상급을 버리십시오.
- 1 x 108 셀 /mL의 최종 세포 밀도에 대한 보충 용액을 포함하는 전기 화 버퍼로 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
참고 : EM 버퍼는 재료표에 나열된 전기 개화 버퍼에 비해 더 많은 세포 사망을 일으킵니다. 따라서, amastigote 형질 감염에 대 한 권장 하지 않습니다 (보충그림1). - Aliquot 100 μL의 재중단 된 기생충 (1 x 107 세포) 1.5 mL 미세 원심 분리튜브튜브. gRNA 5-10 μg를 넣고 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다.
- 혼합물을 2mm 갭 전기 화기 큐벳으로 옮니다. X-14 프로그램을 사용하여 전기 천공 장치로 펄스를 적용합니다.
- 큐벳 내용물 5mL의 미리 따뜻화된 LIT 매체(10% FCS)가 들어 있는 T-25 플라스크에 옮김을 옮니다. 캡을 느슨하게 두고 5% CO2 미만의 37°C에서 플라스크를배양합니다.
- 축배술의 연속에 의해 세포 성장을 모니터링 (섹션 4) 또는 숙주 세포 감염 후 세포 내 amastigotes로 (섹션 5).
4. 도끼 아마스티고테스로 녹아웃 세포의 성장을 모니터링
- EA는 배양 매체의 바닥에 정착, 그래서 부드럽게 용액에 다시 중단 플라스크를 흔들어. 일부 세포가 플라스크에 부착되기 때문에 파이펫팅으로 플라스크 표면을 세척하는 것이 도움이됩니다.
- 프로피듐 요오드화물 (PI) 용액 (20 μg / mL)의 1 μL을 20 μL의 아마스티고테 배양과 섞습니다.
참고: 배양 플라스크를 인큐베이터 외부에 오래 두지 마십시오. 온도는 축증증을 가능하게 하는 요인 중 하나이다22. - 샘플을 혈세포계에 적용하고 형광 현미경으로 관찰하십시오. PI는 손상된 세포막에 permeant하지만 살아있는 세포에서 제외됩니다. PI(예:em 570 nm/602 nm)로 얼룩지지 않는 실행 가능한 아마스티고트 수를 계산합니다.
5. 세포 내 Amastigotes로 녹아웃 세포의 성장을 모니터링
- 시드 숙주 3T3 세포를 DMEM(10% FCS)을 가진 12웰 플레이트에서 숙주한다. 세포 밀도를 70-80% 동률또는 웰당 약 3 x 105 셀로 조정합니다.
참고: 아마스티고테는 운동성이 아니기 때문에, 숙주 세포에 의해 성장 표면의 대부분을 덮는 것은 감염 효율을 향상시킨다. - 전기개공 후 1일 원심분리에 의해 3.6단계에서 녹아웃 아마스티고테를 모으자. 상급체를 버리고, 2 mL의 DMEM (10 % FCS)로 기생충을 다시 중단하십시오.
- 숙주 세포 배양으로부터 배지를 제거하고 다시 일시 중단된 아마스티고테를 적용한다. 감염의 복합성은 20 이상이어야합니다. 37°C에서 5% CO2 미만에서 2일 동안 배양하여 아마스티고트가 감염을 확립할 수 있도록 하였다.
참고: 감염 기간은 목적에 따라 1 일 수 있습니다. - 씻어 제거 EA는 DMEM (10% FCS)으로 숙주 세포 외부에 두 번 남아 있었다.
- 숙주 기생충 공동 배양에 신선한 DMEM(10% FCS)을 첨가하고 추가로 2일 동안 37°C에서 배양을 계속한다.
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감염 효율을 평가하기 위해 숙주 세포 및 세포 내 아마티고테의 핵을 시각화합니다.
참고: 핵은 포화 된 공동 문화에서 중첩되는 경향이 있습니다. 고정 및 염색 전에 낮은 세포 밀도 (예 : 1 :5 희석)에서 세포를 다시 도금하면 핵을 보다 쉽게 계산하는 데 도움이됩니다.- 배양 배지를 제거하고 1 mL의 1 mL을 PBS에 적용하여 세포를 고치도록 하였다. 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 포르말린 용액을 1 μg/mL Hoechst 33342 및 0.1% 트리톤 X-100을 포함하는 PBS 의 1 mL로 교체하십시오. 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
- Hoechst 용액을 제거하고 PBS로 세포를 한 번 헹구어. 신선한 PBS 1 mL을 추가합니다.
- 형광 현미경의 밑에 관찰하고 더 작은 기생충 핵과 연관되는 호스트세포 핵을 확인합니다 (그림 4). 2 개 이상의 amastigotes를 포함하는 호스트 세포는 비생산적인 초기 감염 또는 세척되지 않은 EA를 포함하지 않는 감염으로 간주되어야 합니다.
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Representative Results
스윔 아웃 절차에 의한 트라이포마스티고트 격리
수영 아웃 절차에 의해 오래된 EA를 오염에서 신선한 trypomastigotes를 수확하려면, 세포 펠릿은 적어도 인큐베이션 할 필요가 1 시간. 2 시간 이상 에 대한 펠릿을 배양하는 것은 크게 용액에서 수영 trypomastigotes의 수를 증가하지 않습니다 ( 그림2B)를 참조하십시오. 이 특정 실험에서, 초기 혼합물에서 trypomastigote의 비율은 38%, 그리고 수영 후 백분율 이상 이었다 98% 어떤 주어진된 시점에서. 두 개의 T-75 플라스크에서, 우리는 정기적으로이 수영 프로토콜에 의해 순수한 trypomastigote의 3-4 x 107 세포를 얻습니다.
축 문화로 녹아웃 amastigote의 성장 모니터링
T. cruzi의다른 발달 단계와는 달리, 기겔라리스 아마스티고트는 실질적으로 정적입니다. 따라서 PI로 염색하면 살아있는 아마스티고인과 죽은 것을 구별하는 데 도움이됩니다. PI는 손상되지 않은 세포막에 불투과성이지만죽은 세포에 쉽게 침투합니다(도 3A). 필수 유전자에 대해 gRNA로 형질감염된 아마스티고트는 TcCGM1(TcCLB.511807.80)으로, T. cruzi 게놈에 상동성이 아닌 gRNA를 수신한 대조군과 비교하여 유의한 성장 결함을 보였다(그림 3B).
세포 내 amastigotes로 녹아웃 기생충의 성장 모니터링
아마티고트 단계에서 표적 유전자의 본질성은 또한 세포내 아마티고테로서 녹아웃 T. cruzi의 성장 표현형의 평가에의해 입증될 수 있다(도 4). 더 작은 T. cruzi 핵과 연관되는 숙주 핵의 분율은 대조군과 비교하여 TcCGM1-KO군에서 유의하게 낮았다.
단계 특정 유전자의 녹아웃은 아마스티고테와 trypomastigote 단계에 있는 phenotypic 다름을 일으키는 원인이 됩니다
파라플래그엘라로드 성분 PAR1은 트리포마스티고테 단계에서 고도로 발현되지만, T. cruzi22,31의아마스티고테 단계에서 하향 조절된다. 실제로, TcPAR1(TcCLB.506755.20)에 대하여 gRNA의 형질감염은 축배술 4일 후 EA의 성장에 유의하지 않았다(도 5B). gRNA 형질감염 후 숙주 세포 침습은 또한 TcPAR1-KO가감염 후 4일 후 감염된 숙주 세포의 분율의 관점에서 세포내 아마스티고트의 성장을 억제하지 않는다는 것을 보여주었다(도5C). 개별 숙주 세포 내의 기생충의 수는 녹아웃에 의해 영향을 받지 않는 것으로 보였다(보충도2). 이러한 결과는 TcPAR1이 T. cruzi의 아마스티고테 단계에서 필수적이지 않다는 것을 나타낸다.
그러나, 5일 후 감염 후 숙주 세포에서 출현한 트리포마스티고트의 수는 TcPAR1-KO공동 배양에서 유의하게 낮았으며, 대조군 공동 배양에 비해(도5D). 또한, 퇴출 전 호스트 3T3 세포 내에서 차별화된 trypomastigotes는 대조군(보충영화1)에서 상당히 활발한 것으로 보였지만 TcPAR1-KO군(보충영화2)에서는 부진한 것으로 보였다. 이 결과는 TcPAR1가 아마스티고트 단계에서 비본질성에도 불구하고, 퇴행을 돕기 위하여 운동성을 제공해서, T. cruzi의trypomastigote 단계에서 중요한 역할을 한다는 것을 건의합니다.
그림 2: 스윔아웃 절차에 의한 트라이포마스티고테의 격리. (A) 프로토콜의 개략적 표현. 빨간색 = 트라이포마스티고테의 존재. (B) 표시된 시점에서 펠릿에서 빠져나온 트리포마스티고트 수입니다. 초기 펠 릿의 총을 포함 3 x 107 기생충, 38% trypomastigotes 되었고 나머지는 amastigotes 했다. 실험은 삼중항으로 수행되었고 평균 값(±SD)이 플롯된다. 용액에서 trypomastigotes의 순도는 주어진 시점에서 98 % 이상이었습니다. (C) 수영 절차 전에 기생충의 현미경 이미지 (왼쪽), 펠릿에서 swum이 있는 trypomastigotes (중간), 그리고 펠 릿에 남아 있는 기생충 (오른쪽) 배양 의 1 시간 후. 배율 막대 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 축아스티고테의 성장 모니터링. (a) 프로피듐 요오드화물 (PI) 배제 분석. 밝은 필드 (왼쪽), 형광 채널 (가운데), 및 중첩 된 이미지 (오른쪽)의 혈세포계에 EA의 현미경 검사법 이미지. 노란색 화살표는 PI 염색 죽은 세포를 나타냅니다. 스케일 바 = 20μm. (B) TcCGM1 (오픈 원)에 대하여 gRNA로 형질전환 후 Cas9 발현 아마스티고트의 세포 수 및 T. cruzi 게놈 (폐쇄 원)에 대한 상동성이없는 gRNA를 제어한다. 전기 개천은 삼중계에서 수행되었고 평균 값(±SD)이 플롯됩니다. (**p< 0.01: 웰치의 t-테스트). 이 그림은 Takagi 외 에서 수정되었습니다.22이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 호스트 침공 후 녹아웃 아마스티고테스의 성장. (a) TcCGM1에 대하여 gRNA로 형질감염된 아마스티고트의 세포내 복제 후 숙주 기생충 공동 배양의 핵 염색 및 대조군 gRNA. gRNA 형질감염된 EA는 전기포공 후 1일 3T3 세포에 적용하고 2일 동안 숙주 세포를 감염시킬 수 있도록 하였다. 숙주 세포 외부에 남아 있는 아마스티고테스를 씻어내고, 숙주-기생충 공동 배양을 추가로 2일 동안 배양하였다. 배율 막대 = 20 μm. 이 수치는 타카기 외22 (B) 대조군 아마스티고테스(검정바)와 TcCGM1-KO아마스티고테스(회색 막대)에 의해 감염된 숙주 3T3 세포의 백분율로부터 변형되었다. 3개의 감염 실험의 평균(±SD)이 플롯된다(**p & 0.01, 웰치의 t-검정). 이 그림은 Takagi 외 에서 수정되었습니다.22이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 녹아웃 아마스티고테와 차별화된 트라이포마스티고테의 Phenotypic 차이. (A) 실험 타임라인의 개략적 표현. (B) 4일 후 변속기에서 축산 아마스티고테의 세포 카운트(검정바)와 TcPAR1-KO아마스티고테스(회색바)를 대조한다. 3개의 전기 천공 실험의 평균 값(±SD)이 플롯된다(n.s.: 유의하지 않음, Mann-Whitney U 시험). (C) 4일 후 감염 후 3T3 세포의 대조군 아마스티고테(검정바)와 TcPAR1-KO아마스티고테(회색바)에 의한 감염률을 조절한다. 3개의 배양 웰의 평균 값(±SD)이 플롯됩니다(n.s.: 유의하지 않음, Mann-Whitney U 테스트). (D) 대조군 공동배양(블랙바)과 TcPAR1-KO공동배양(그레이바)을 위해 5일 후 감염 후 배양배지에 방출된 트리포마스티고트의 수. 3개의 배양 웰의 평균 값(±SD)이 플롯됩니다(*p< 0.05, Mann-Whitney U 테스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: LIT 배지의 조성. LIT 배지는 인산 나트륨 수소의 양을 제외하고 ATCC 1029에 따라 제조하였다. 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 아마스티고테 세포 생존가능성에 대한 전기 개공 완충제의 효과. EA는 전기화 완충제 또는 EM 버퍼에서 전기포에 의해 전기화되었다. 아마스티고테는 24시간 후에 PI로 염색되어 살아있는 아마스티고테의 수를 계산했다. 각 그룹과 펄스 없음 그룹에서 죽은 세포의 백분율이 플롯됩니다. 3개의 전기 천공 실험의 평균(±SD)이 도시됩니다(*p&0.05, n.s.: 유의하지 않음, Kruskal-Wallis 시험). 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 핵 염색 된 TcPAR1-KO의 현미경 이미지 및 제어 세포 내 아마스티고트. 숙주 3T3 세포의 공동 배양 및 형질감염된 아마스티고트는 감염 후 4일 에서 고정 및 염색하였다. 배율 표시줄: 20 μm. 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 3: Cas9-표현의 성장 표현형-epimastigote. 야생형 에피마스티고트(WT)의 세포 수, Cas9-EGFP(Cas9-EGFP)를 구성적으로 표현하는 에피마스티고트, 그리고 아마스티고트 특이적 3'-UTR(Cas9-EGFP-AmaUTR)의 규정에 따라 Cas9-EGFP를 표현하는 에피마스티고트가 로그 단위로 플롯됩니다. 에피마스티고테스는 28°C에서 LIT 배지(10% FCS)로 재배되었습니다. 기생충 세포 밀도는 0일째에 1 x 106 세포/mL로 조정되었다. 누적 셀 수는 세포 밀도에 총 희석 계수를 곱한 값으로 계산됩니다. 3개의 배양 플라스크의 평균(±SD)이 도시됩니다(*p&0.05, n.s.: 유의하지 않음, 크루스칼-월리스 테스트). 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 1: 대조군 공동 배양의 현미경 비디오 이미지. 제어 amastigotes에서 차별화 한 trypomastigotes의 수와 활성. 감염 후 5 일 후 비디오 이미지가 표시됩니다. 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 2: TcPAR1-KO공동 배양의 현미경 비디오 이미지. TcPAR1-KO 아마스티고테스와 차별화된 트라이포마스티고트의 수와 활성도. 감염 후 5 일 후 비디오 이미지가 표시됩니다. 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 T. cruzi amastigotes의 축배양이 Cas9 발현 EA로 직접 gRNA를 전기로 전환해서 CRISPR/Cas9 매개 유전자 녹아웃에서 이용될 수 있다는 것을 보여주었습니다. 이와 같이, amastigote 단계에서 특히 표적 유전자의 본질성은 다른 발달 단계를 거치지 않고 평가될 수 있다.
amastigote 형질감염의 또 다른 유익한 양상은 많은 표적 유전자를 위한 시험에 있는 편의성입니다. 일단 Cas9 발현 T. cruzi 및 호스트 포유류 세포의 공동 배양이 확립되면, 조직 유래 trypomastigotes를 EA 및 transfect gRNA로 변환하여 녹아웃 아마티고테스를 얻는 데 며칠밖에 걸리지 않습니다. gRNA는 각 표적 유전자에 맞추어야 하는 유일한 물자입니다, 그러나 합성 gRNA는 제조자의 수에서 유효합니다, 그래서 단순히 구입해서 가능합니다. 표적 유전자의 단계 특이적 본질성을 분석하는 대안적인 방법은 유도성녹아웃 시스템(32)을 확립하는 것이다. 이 경우, 플라스미드는 각 표적 유전자에 대해 시공되어야 하며, 플라스미드의 형질감염 효율이 gRNA보다 훨씬 낮기 때문에, 각 표적 유전자에 대해 시공되어야 하며, 에피마스티고트 단계에서 기생충으로 형질감염되어야 합니다(plasmid의 경우 15%). 26으로 >96% gRNA22에대 한). 선택된 트랜스펙트는 세포내 아마스티고테에서 녹아웃을 최종적으로 유도하기 위해 숙주 세포를 감염시키기 위해 메타사이클 트리포마스티고제로 분화되어야 한다. 이 모든 과정은 1-2 개월이 걸릴 것입니다.
이 보고에서는, 우리는 혈세포계로 세포 조밀도를 정량화하기 위하여 축세포 아마스티고트 배양에 있는 죽은 세포를 구별하기 위하여 PI를 이용했습니다. 대안적으로, resazurin 생존율 분석과 같은 대사 분석술은 높은 처리량 형식에 더 적합한 살아있는 아마스티고테의 수를 추정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 우리의 손에, 1 x 105 amastigotes 잘 배양 의 5 시간 후에 resazurin 분석에 의해 검출될 충분한 산화환소 활성을 산출한다.
Cas9 발현 세포주 확립의 한 가지 단점은 Cas9 과발현5,33으로인한 잠재적세포 부담 및 비특이적 절단이다. Cas9의 구성발현이 T. cruzi4,6,7,8의성장률에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타내는 몇 가지 보고가 있다. 그러나, 한인스턴스에서 5 그리고 또한 우리의 손에, Cas9 표현 기생충 야생 형에 비해 느린 성장을 보였다. 이 문제를 극복하기 위해, 우리는 아마스티고테 단계22에Cas9의 표현을 제한하기 위해 amastigote 특정 3'-UTR을 채택했다. Cas9 오픈 독서 프레임에 amastin 3'-UTR의 컨쥬게이션은 형질전환 기생충의 복제 속도를 복원 (보충그림3), 이에 따라 지속적으로 시험관 내 trypomastigotes를 공급하는 강력한 숙주 기생충 공동 배양을 생산 아마스티고제네시스. 최근, 다른 그룹은 야생형 기생충에 gRNA/Cas9 RNP 복합체의 도입이 T. cruzi7,9에서게놈 편집을 일으킬 수 있음을 입증했다. 이 방법은 기생충에 덜 스트레스가 많은 접근법으로 탐구되어야한다9, 포유류 세포에 대한 연구는 RNP의 사용이 Cas9 단백질34의짧은 반감기 때문에 원치 않는 오프 타겟 게놈 편집을 감소시킨다는 것을 시사하기 때문에.
프로토콜에 대한 또 다른 선택적 변형은 상동 재조합을 위한 템플릿으로서 공여자 DNA의 병용 화질일 것이다. 그것은 이중 가닥 DNA 4, 5,8,35 또는 단일 가닥의 형태로, 절단 부위의 상류 및 하류에 상동 서열을 포함하는 기증자 DNA가보고되었다 올리고뉴클레오티드7,9는Cas9 뉴클레아제에 의한 이중 가닥 휴식의 수리 과정을 용이하게 한다. 일부 보고서는 기증자 템플릿없이 미세 호민학 중재 끝 접합이 절단을 복구하고 결실 돌연변이 를 도입할수 있음을 나타내지 만 5, 돌연변이 부위에 정의 된 서열의 도입은 그럼에도 불구하고 확인하는 데 도움이 성공적인 게놈 편집은, 표적 단백질 감소 및 현상형 결과가 표적 유전자가 돌연변이되었음에도 불구하고 어떤 경우에는 유전자 녹아웃의DNA 증거를 보여주기 어렵기 때문에 4.
Cas9/gRNA RNP 형질감염 및 공여자 DNA의 공동 형질감염은 프로토콜의 설명을 단순화하고 EA의 제조 및 그 이후의 축세포 배양의 사용에 초점을 맞추기 위해 이 보고서에서 입증되지 않는다. 이러한 실험을 수행하고자하는 경우, 단순히 전기 천공의 구성 요소를 교체하여 수행 할 수 있습니다.
실험 도구로 T. cruzi의 EA를 활용하는 우리의 방법은 잠재적으로 플라스미드 형질 감염 및 약물 효능 시험22에의한 일시적인 유전자 발현을 포함하여 다양한 단계 별 연구를 가능하게 한다. 그러나, 이 접근법의 효과는 지금까지 툴라후엔 균주에서만 시험되었다. T. cruzi의 균주는 매우 다양하기 때문에, 다른 균주에이 프로토콜의 적용성을 조사해야합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 Y.T에 JSPS KAKENHI 교부금 번호 18K15141에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20% formalin solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 068-03863 | fixing cells |
| 25 cm2 double seal cap culture flask | AGC Techno Glass | 3100-025 | |
| 75 cm2 double seal cap culture flask | AGC Techno Glass | 3110-075 | |
| All-in One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 | |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for Control) | IDT | custom made | target sequence = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcCGM1) | IDT | custom made | target sequence = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcPAR1) | IDT | custom made | target sequence = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA | IDT | 1072532 | to anneal with crRNA |
| Amaxa Nucleofector device | LONZA | AAN-1001 | electroporation |
| Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | LONZA | VMI-1021 | electroporation |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | component of the medium for in vitro amastigogenesis |
| Burker-Turk disposable hemocytometer | Watson | 177-212C | cell counting |
| Coster 12-well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3513 | |
| DMEM | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 044-29765 | culture medium |
| Fetal bovine serum, Defined | Hyclone | SH30070.03 | heat-inactivate before use |
| G-418 Sulfate Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 077-06433 | selection of transformant |
| Hemin chloride | Sigma-Aldrich | H-5533 | component of LIT medium |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | staining of nuclei |
| Liver infusion broth, Difco | Becton Dickinson | 226920 | component of LIT medium |
| MES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 349-01623 | component of the medium for in vitro amastigogenesis |
| PBS (–) | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 166-23555 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | staining of dead cells |
| RPMI 1646 | Sigma-Aldrich | R8758 | medium for metacyclogenesis |
References
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