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Genetics

Introduzindo um nocaute genético diretamente no estágio Amastigote do Trypanosoma cruzi usando o sistema crispr/Cas9

Published: July 31, 2019 doi: 10.3791/59962
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)

Summary

Aqui, nós descrevemos um protocolo para introduzir um nocaute do gene no amastigotas extracelular de Trypanosoma cruzi, usando o sistema de crispr/Cas9. O phenotype do crescimento pode ser seguido acima pela contagem da pilha da cultura axênicos do amastigotas ou pela proliferação de amastigotas intracelular após a invasão da pilha de anfitrião.

Abstract

O Trypanosoma cruzi é um parasita protozoário patogénico que causa a doença de Chagas principalmente na América Latina. A fim de identificar um novo alvo de drogas contra o T. cruzi, é importante validar a essencialidade do gene alvo na fase de mamíferos do parasita, o amastigote. Amastigotas de T. cruzi replicam dentro da célula hospedeira; assim, é difícil realizar uma experiência de nocaute sem passar por outros estágios de desenvolvimento. Recentemente, nosso grupo relatou uma condição do crescimento em que o amastigotas pode replicar axenically por até 10 dias sem perder suas propriedades amastigotas-like. Usando esta cultura axênica temporal do amastigotas, nós introduzimos com sucesso grnas diretamente no Cas9-expressando o amastigotas para causar nocautes do gene e analisou seus fenótipos exclusivamente no estágio do amastigotas. Neste relatório, nós descrevemos um protocolo detalhado para produzir in vitro os amastigotes extracelular derivados, e para utilizar a cultura axênicos em um experimento nocaute crispr/Cas9-negociado. O phenotype do crescimento de amastigotas do Knockout pode ser avaliado pela contagem da pilha da cultura axênicos, ou pela réplica do amastigotas intracelular após a invasão da pilha de anfitrião. Este método ignora a diferenciação do estágio do parasita envolvida normalmente em produzir um transgênicas ou um amastigote do knockout. A utilização da cultura do amastigotas axênico temporal tem o potencial de ampliar a liberdade experimental de estudos específicos do estágio em T. cruzi.

Introduction

O Trypanosoma cruzi é o agente causador da doença de Chagas, predominante principalmente na América Latina1. T. cruzi tem estágios distintos do ciclo de vida enquanto viaja entre um vetor do inseto e um anfitrião mamífero2. T. cruzi Replica como um atividade no intestino médio de um bug triatomíneo sugador de sangue e diferencia-se em um tripomastigota metacíclicos infeccioso em seu intestino posterior antes de ser depositado em um anfitrião humano ou animal. Uma vez que o tripomastigota entra no corpo hospedeiro através do local da mordida ou através de uma membrana mucosa, o parasita invade uma célula hospedeira e se transforma em uma forma redonda flagella-less chamada um amastigote. O amastigotas Replica dentro da célula hospedeira e, eventualmente, diferencia-se em trypomastigote, que explode fora da célula hospedeira e entra na corrente sanguínea para infectar outra célula hospedeira.

Como os agentes quimioterapêuticos atualmente disponíveis, o Benznidazol e o Nifurtimox, causam efeitos colaterais adversos e são ineficazes na fase crônica da doença3, é de grande interesse identificar novos alvos de drogas contra o T. cruzi. Nos últimos anos, o sistema CRISPR/Cas9 tornou-se uma poderosa ferramenta para efetivamente realizar nocaute genético em T. cruzi, seja por transfecção de plasmídeo (s) separado ou único contendo Grna e CAS94, por expressão estável de Cas9 e subsequente introdução de grna5,6,7 ou modelo de transcrição de grna8, ou por eletroporação do complexo pré-formado de grna/Cas9 RNP7,9. Este avanço tecnológico é altamente antecipado para acelerar a pesquisa-alvo de drogas na doença de Chagas.

Para prosseguir com o desenvolvimento da droga, é crucial validar a essencialidade do gene alvo ou a eficácia dos compostos candidatos à droga na amastigotas de T. cruzi, pois é a fase de replicação do parasita no hospedeiro de mamíferos. No entanto, esta é uma tarefa desafiadora, porque amastigotas não podem ser manipuladas diretamente devido à presença de uma célula hospedeira obstrutiva. Em Leishmania, um parasita de protozoário intimamente relacionado ao T. cruzi, um método de cultivo de amastigotas axênico foi desenvolvido e tem sido utilizado em ensaios de triagem de fármacos10,11,12, 13. embora existam algumas discrepâncias na suscetibilidade a compostos entre amastigotas axênicas e amastigotas intracelulares14, a capacidade de manter a cultura axênica, no entanto, fornece valiosas ferramentas experimentais para estudar a biologia básica do estágio clinicamente relevante de Leishmania15,16. No caso do T. cruzi, literaturas quanto à presença de amastigotas extracelulares (ea)17 e produção in vitro de ea17,18,19 datam de décadas atrás. Além disso, a EA é conhecida por ter uma capacidade infecciosa20, embora menos do que a do trypomastigote, e o mecanismo de invasão do hospedeiro amastigota tem sido elucidado nos últimos anos (revisado por Bonfim-Melo et al.21). No entanto, diferentemente da Leishmania, a ea não tinha sido utilizada como ferramenta experimental no T. cruzi, principalmente porque a ea tinha sido considerada como um parasita intracelular obrigatório e, portanto, não tinha sido considerada como "forma replicativa" em uma prática Sentido.

Recentemente, nosso grupo propôs utilizar a EA de T. cruzi como uma cultura axênica temporal22. Amastigotas de T. cruzi tulahuen estirpe pode replicar livre de células hospedeiras em meio iluminado a 37 ° c por até 10 dias sem grande deterioração ou perda de propriedades semelhantes a amastigotas. Durante o período de crescimento livre de hospedeiro, a EA foi utilizada com sucesso para expressão gênica exógena por eletroporação convencional, ensaio de titulação de fármacos com compostos tripanociais e nocaute de CRISPR/Cas9, seguido de monitoramento do fenótipo de crescimento. Neste relatório, nós descrevemos o protocolo detalhado para produzir in vitro o ea derivado e para utilizar o amastigotas axênicos em experimentos do nocaute.

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Protocol

Nota: Uma visão geral de todo o fluxo experimental é descrita na Figura 1.

Figure 1
Figura 1: visão geral do experimento de nocaute usando o ea. Os tripomastigotas cultura-derivados do tecido são colhidos e diferenciados em ea. grna é transfected em Cas9-expressando amastigotas pelo Electroporation, e o phenotype do crescimento do amastigotas do Knockout é avaliado pela replicação axênicos ou pelo replicação intracelular após invasão de células hospedeiras. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. preparações da cultura do parasita

  1. A cepa de tulahuen do Trypanosoma cruzi é usada ao longo deste relatório. Manter epimastigotas de T. cruzi em meio lit (10% FCS, ver tabela suplementar 1). Feche firmemente a tampa e mantenha o balão de cultura a 28 ° c.
  2. Gerar uma cepa transgênica de T. cruzi que abriga a endonuclease Cas9. Exemplos da expressão plasmídica que contêm a seqüência de codificação Cas9 e o marcador de seleção G418 (neor) podem ser encontrados em Lander et al.4 e Peng et al.5
    1. Transfect o plasmídeo acima no atividade pelo Electroporation, usando o jogo alistado na tabela dos materiais. Para 1 cubeta, gire para baixo 2 x 107 pilhas, descarte o sobrenadante, e ressuspender com 100 μl do amortecedor do Electroporation que contem a solução fornecida do suplemento.
      Nota: O tampão do Electroporation pode ser substituído com o tampão de em24 (3:1 mistura do comprimidos25 e do amortecedor da fosfato-sacarose).
    2. Adicione 20-40 μg de plasmídeo e transfira a mistura para uma cubeta de electroporação de 2 mm de Gap. Aplique o pulso com um dispositivo do Electroporation (veja a tabela dos materiais), usando o programa X-1426.
    3. Transfira o conteúdo da cubeta para um balão T-25 contendo 5 mL de meio LIT (10% FCS). Incubar o balão a 28 ° c durante 24 h.
    4. Adicionar G418 a uma concentração final de 250 μg/mL e continuar a incubação a 28 ° c. Demora cerca de 1 semana para matar os epimastigotas não transfected. Uma vez que a população G418-resistant começa a recuperar, passagem a cultura uma vez ou duas vezes por semana para evitar a saturação e para diluir para fora as pilhas inoperantes. O estabelecimento de uma linha de pilha estável toma geralmente o total de 4 semanas.
      Nota: Se a expressão constitutiva de Cas9 é um fardo para a célula5, faça a expressão específica para o estágio amastigotas, conjugando o 3 '-UTR do gene amastina imediatamente a jusante do quadro de leitura aberto de CAS927. A descrição detalhada do plasmídeo de expressão de Cas9 específico para amastigote pode ser encontrada em Takagi et al.22
  3. Estabelecer uma cocultura hospedeiro-parasita de Cas9-expressando T. cruzi e células hospedeiras de mamíferos. Neste relatório, use a pilha do fibroblasto do albino 3T3-Swiss como um anfitrião.
    1. Diferenciar epimastigotas de T. cruzi em tripomastigotas metacílicos. Determine a densidade celular da cultura atividade usando um hemociômetro e colete 5 x 107 células por centrifugação por 15 min a 2.100 x g. Descarte o sobrenadante e resuma as células com 10 mL de meio RPMI. Incubar o parasita a 28 ° c durante 1 semana28.
    2. Colete tripomastigotas metacílicos em meio RPMI. Incline cuidadosamente o balão e o Pipet para fora da solução sem perturbar os parasitas aderiram à superfície inferior. Transfira o meio para um tubo cônico e centrifugue por 15 min a 2.100 x g. Descartar o sobrenadante e ressuscitará o parasita com 5 mL de DMEM (10% FCS).
      Nota: A população parasita é uma mistura de tripomastigotas metacílicos, epimastigotas e algumas formas intermediárias. Embora não seja necessário, você pode isolar o tripomastigota pela cromatografia de troca iónica29de DEAE. Alternativamente, os epimastigotas podem ser eliminados incubando os parasitas com soro ativo para sujei-los a complementar a Lise30.
    3. Semente 3T3-pilha Suíça do fibroblasto do albino a 60-70% confluency, ou aproximadamente 1.7-2.0 x 106 pilhas em 5 ml de DMEM (10% FCS) no balão da cultura T-25. Retire o meio de crescimento e aplique a mistura parasita a partir do passo 1.3.2. Incubar para 24 h em 37 ° c 5% CO2 em uma incubadora humidificada para estabelecer a infecção.
    4. Remova os parasitas restantes fora das células do hospedeiro 3T3 lavando a cocultura com DMEM (10% FCS) duas vezes.
    5. Uma vez que a cocultura é saturada, as células hospedeiras da passagem amastigote-infectadas por trypsinization. Aspirar o meio e enxaguar a cultura uma vez com PBS. Aplique 1 mL de solução de tripsina de 0, 5% para cobrir toda a superfície da cultura e incubar por alguns minutos à temperatura ambiente até que as células hospedeiras anexadas fiquem soltas. Retire as células da superfície do balão, liberando 3 mL de DMEM (10% FCS) sobre as células.
    6. Transfira células hospedeiras separadas para um tubo cônico e centrifugue por 3 min a 300 x g. Aspirar o sobrenadante e suspender as células com 3 mL de DMEM fresco (10% FCS). Esta etapa ajuda a eliminar epimastigotas remanescentes. Transfira tudo para um frasco T-75 limpo contendo 9 mL de DMEM (10% FCS). Continue cultivando até que o tripomastigota seja liberado no sobrenadante da cultura.
    7. Manter a cocultura por de com tripsinização duas vezes por semana. Uma vez que 70-80% da população hospedeira se infecta, adicione regularmente células não infectadas do hospedeiro 3T3 na proporção de 5:1 (Carryover: fresco), a fim de evitar a deterioração da cultura. Trypomastigote egressos continuamente se o equilíbrio entre células hospedeiras e T. cruzi for mantido adequadamente.

2. diferenciação de tripomastigotas na EA

  1. No dia anterior a este experimento, remover o meio de crescimento da cocultura hospedeiro-parasita e adicionar DMEM fresco (10% FCS) para lavar afastado EA e tripomastigotas que já haviam sido liberados das células hospedeiras em dias anteriores. Experimentos regulares exigem pelo menos dois frascos T-75 de co-cultura confluente.
  2. Colete o sobrenadante de cultura em um tubo cônico para colher tripomastigotas recém-emergidos. Verific a amostra um microscópio (lente objetiva de 10x ou de 20x) para a qualidade. Se houver restos de células hospedeiras, centrifugue brevemente a amostra e transfira o sobrenadante para um novo tubo. Se houver um número significativo de EAs, isole tripomastigotas pelo seguinte procedimento de mergulho.
    1. Gire para baixo a mistura de tripomastigotas e amastigotas por 15 min em 2.100 x g. Descarte a maior parte do sobrenadante, deixando 0,5-1,0 mL de meio no tubo.
      Nota: reduzir o volume é opcional, mas facilita a etapa seguinte.
    2. Incubar a pelota a 37 ° c por 1-2 h, permitindo que as tripomastigotas ativas nadem para fora da pelota (Figura 2).
    3. Transfira o sobrenadante contendo tripomastigotas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  3. Centrifugue o tubo cônico durante 15 min a 2.100 x g para recolher tripomastigotas. Se o procedimento de mergulho foi realizado acima, centrifugue o tubo de 1,5 mL por 2 min a 4.000 x g para pellet o trypomastigote. Descarte o sobrenadante.
  4. Ressuspender o pellet com 5 mL de DMEM tamponado com 20 mM MES (pH 5,0), suplementado com 0,4% BSA19. Transfira o parasita para um balão de cultura T-25. Deixe a tampa solta. A densidade celular deve ser em torno ou abaixo de 1 x 107 células/ml, uma vez que a sobresaturação aumenta a chance de morte celular.
    Nota: A cor do DMEM deve ser amarela, não laranja. Se o DMEM original tinha alta capacidade de tamponamento, 20 mM MES (pH 5,0) não é suficiente para diminuir o pH. O pH do meio deve ser ajustado pela adição de HCl nesse caso. O meio ácido pode ser mantido a 4 ° c, mas não mais do que 1 mês.
  5. Incubar o balão da cultura em 37 ° c 5% CO2 em uma incubadora humidificada. Cerca de 95% dos parasitas se diferenciam em amastigotas após 24 h.

3. electroporação da EA

  1. Prepare o gRNA para o electroporation. Isto pode ser feito pela transcrição in vitro, ou simplesmente comprando oligonucleotídeos sintéticos do RNA de um fabricante. Neste relatório, crRNA e tracrRNA da Integrated DNA Technologies, Inc. são utilizados.
  2. Centrifugue a cultura de EAs por 15 min em 2.100 x g. Descarte o sobrenadante.
  3. Ressuscitação da pelota com tampão do Electroporation que contem a solução fornecida do suplemento à densidade final da pilha de 1 x 108 Cells/ml.
    Nota: o tampão EM causa mais mortes da pilha comparada ao amortecedor do Electroporation alistado na tabela dos materiais; assim, não é recomendado para o transfection do amastigotas (Figura suplementar 1).
  4. Alíquota 100 μL de parasitas ressuscipended (1 x 107 células) em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 5-10 μg de gRNA e misturar suavemente com pipetagem.
  5. Transfira a mistura para uma cubeta da electroporação da abertura de 2 milímetros. Aplique o pulso com o dispositivo do Electroporation, usando o programa X-14.
  6. Transfira o conteúdo da cubeta para um balão T-25 contendo 5 mL de meio de LIT pré-aquecido (10% FCS). Deixar a tampa solta e incubar o balão a 37 ° c abaixo de 5% CO2.
  7. Monitore o crescimento celular, seja pela continuação da cultura axênica (seção 4) ou como amastigotas intracelulares após a infecção da célula hospedeira (seção 5).

4. monitorando o crescimento de células Knockout como amastigotas Axenic

  1. EAs se instalam na parte inferior do meio de cultura, assim agitar suavemente o balão para ressuscitem-los para a solução. A lavagem da superfície do balão por pipetagem ajuda, pois algumas células são aderiram ao balão.
  2. Misturar 1 μL de solução de iodeto de propiídio (PI) (20 μg/mL) com 20 μL de cultura de amastigotas.
    Nota: Não deixe o balão de cultura fora da incubadora por mais tempo do que o necessário. A temperatura é um dos fatores que possibilita a proliferação axênica22.
  3. Aplique a amostra no hemocitômetro e observe um microscópio de fluorescência. O PI é persignificado à membrana de pilha danificada mas é excluído das pilhas vivos. Conte o número de amastigotas viáveis que não são manchadas por PI (ex/em 570 nm/602 nm).

5. monitorando o crescimento de pilhas do Knockout como Amastigotes intracellular

  1. Semente do anfitrião 3T3 pilhas em uma placa de 12 poços com DMEM (10% FCS). Ajuste a densidade da célula para 70-80% de confluência, ou cerca de 3 x 105 células por poço.
    Nota: Desde que os amastigotas não são motile, cobrindo a maioria da superfície do crescimento pelas pilhas do anfitrião melhora a eficiência da infecção.
  2. Colete amastigotas Knockout da etapa 3,6 pela centrifugação um dia após o electroporation. Descartar o sobrenadante, e ressuscitará o parasita com 2 mL de DMEM (10% FCS).
  3. Remova o meio da cultura de célula hospedeira e aplique amastigotas resrepended. A multiplicidade de infecção deve ser 20 ou superior. Incubar a placa a 37 ° c abaixo de 5% CO2 por 2 dias para permitir que os amastigotas estabeleçam infecção.
    Nota: O período de infecção pode ser 1 dia, dependendo da finalidade.
  4. Lave afastado EAs remanesceu fora das pilhas do anfitrião duas vezes com DMEM (10% FCS).
  5. Adicione DMEM fresco (10% FCS) à cocultura hospedeiro-parasita e continue a incubação a 37 ° c por 2 dias adicionais.
  6. Avaliar a eficiência da infecção, Visualizar núcleos das células hospedeiras e amastigotas intracelulares.
    Nota:     os núcleos tendem a ser sobrepostos em cocultura saturada. Re-plating as pilhas na mais baixa densidade da pilha (tal como a diluição 1:5) antes da fixação e a mancha ajuda a contar núcleos mais facilmente.
    1. Remova o meio de cultura e aplique 1 mL de solução de formalina a 10% em PBS para fixar as células. Incubar por 10 min à temperatura ambiente.
    2. Substitua a solução de formalina por 1 mL de PBS contendo 1 μg/mL Hoechst 33342 e 0,1% Triton X-100. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
    3. Retire a solução de Hoechst e enxague as células uma vez com PBS. Adicione 1 mL de PBS fresco.
  7. Observar microscópio de fluorescência e identificar núcleos de células hospedeiras que estão associados a núcleos parasitas menores (Figura 4). As células hospedeiras que contêm mais de 2 amastigotas devem ser consideradas como infectadas, não incluir infecção inicial não produtiva ou EAs não lavadas.

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Representative Results

Isolação de tripomastigotas pelo procedimento da nadada-para fora

Para colher tripomastigotas frescas contaminando EAs velhos pelo procedimento da nadada, as pelotas da pilha precisam de ser incubadas pelo menos para 1 h. incubando as pelotas por mais de 2 h não aumenta significativamente o número de tripomastigotas nadando na solução ( Figura 2b). Neste experimento em particular, a porcentagem de tripomastigotas na mistura inicial foi de 38%, e a porcentagem após o nado-out foi acima de 98% em qualquer ponto de tempo determinado. A partir de dois frascos T-75 de co-cultura confluente, nós rotineiramente obter 3-4 x 107 células de tripomastigota puro por este mergulho-out protocolo.

Monitorização do crescimento do amastigotas Knockout como cultura axênica

Ao contrário de outros estágios de desenvolvimento do T. cruzi, os amastigotas flagelar-menos são praticamente estáticos. Assim, manchar com o PI ajuda a distinguir amastigotas vivos dos inoperantes. O PI é impermeável à membrana celular intacta, mas penetra facilmente nas células mortas (Figura 3a). Amastigotas transfected com grna de encontro ao gene essencial, TcCGM1 (tcclb. 511807.80), mostraram um defeito significativo do crescimento que compara ao grupo de controle que recebeu o grna não homólogo ao genoma de T. cruzi (Figura 3B).

Monitorização do crescimento de parasitas Knockout como amastigotas intracelulares

A essencialidade do gene alvo no estágio amastigotas também pode ser demonstrada pela avaliação do fenótipo de crescimento do nocaute T. cruzi como amastigotas intracelulares (Figura 4). A fração dos núcleos hospedeiros associados aos núcleos menores de T. cruzi foi significativamente menor no grupo TcCGM1-ko comparando com o grupo controle.

Nocaute de um gene específico da fase provoca diferença fenotípica em estágios de amastigotas e tripomastigotas

O componente par1 da haste paraflagelar é altamente expresso no estágio de tripomastigota, mas é regulado no estágio amastigotas de T. cruzi22,31. De fato, a transfecção de gRNA contra TcPAR1 (tcclb. 506755.20) não afetou significativamente o crescimento da ea após 4 dias de cultivo axênico (Figura 5b). o transfection de grna seguiu pela invasão da pilha do anfitrião igualmente mostrou que TcPAR1-ko não inibe o crescimento de amastigotes intracelular, nos termos da fração de pilhas de anfitrião contaminadas em 4 dias de infecção do borne (Figura 5C). O número de parasitas dentro da célula hospedeira individual não pareceu ser afetado pelo nocaute, tampouco (Figura suplementar 2). Estes resultados indicam que o TcPAR1 não é essencial no estágio amastigotas do T. cruzi.

Entretanto, o número de tripomastigotas emergiu das células hospedeiras aos 5 dias após a infecção foi significativamente menor na cocultura TcPAR1-ko, comparando-se a cocultura controle (Figura 5D). Além disso, tripomastigotas diferenciadas dentro do host 3T3 célula antes de egression parecia ser bastante ativo no grupo de controle (suplementar filme 1), mas parecia lento no grupo TcPAR1-KO (suplementar filmes 2). Estes resultados sugerem que o TcPAR1 desempenha um papel importante no estágio tripomastigota de T. cruzi, presumivelmente por fornecer motilidade para ajudar a egressão, apesar de sua não-essencialidade no estágio amastigotas.

Figure 2
Figura 2: isolação do tripomastigota pelo procedimento da nadada-para fora. (A) representação esquemática do protocolo. Vermelho = presença de trypomastigote. (B) o número de tripomastigotas que nadaram para fora da pelota em pontos de tempo indicados. As pelotas iniciais continham um total de 3 x 107 parasitas, 38% dos quais foram tripomastigotas e os restantes foram amastigotas. Os experimentos foram realizados em triplicado e os valores médios (± DP) são plotados. A pureza dos tripomastigotas na solução era acima de 98% em todos os pontos de tempo dado. (C) imagens de microscopia de parasitas antes do procedimento de natação (esquerda), tripomastigotas que têm nadada de um pellet (meio), e parasitas remanescentes em uma pelota (direita) após 1 h de incubação. Barras de escala = 10 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: monitorização do crescimento da amastigote axênica. (A) ensaio de exclusão de iodeto de PROPIÍDIO (PI). Imagens de microscopia de ea em um hemocitômetro em campo brilhante (esquerda), canal de fluorescência (meio), e imagem sobreposta (direita). As setas amarelas indicam as células mortas manchadas de PI. Barras de escala = 20 μm. (B) contagem de células de Cas9-expressando amastigotas após transfecção com Grnas contra TcCGM1 (círculo aberto) e controle grna sem homologia ao genoma do T. cruzi (círculo fechado). As eletroporações foram realizadas em triplicados, e os valores médios (± DP) são plotados. (* * p < 0, 1 pelo teste t de Welch). Este número foi modificado a partir de Takagi et al.22por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: crescimento de amastigotas de nocaute após invasão de hospedeiro. (A) coloração nuclear da cocultura hospedeiro-parasita após replicação intracelular de amastigotas transfectadas com grnas contra TcCGM1 e controle de grna. as EAs de gRNA-transfected foram aplicadas em 3T3 pilhas 1 dia após o electroporation e permitiram infectar pilhas de anfitrião por 2 dias. Amastigotas restantes fora das células hospedeiras foram lavadas, e a cocultura hospedeiro-parasita foi incubada por 2 dias adicionais. Barras de escala = 20 μm. Este número foi modificado de Takagi et al.22 (B) percentual de células hospedeiras 3T3 infectadas por amastigotas de controle (barra preta) e TcCGM1-ko amastigotas (barra cinza). A média (± DP) de três experimentos de infecção é plotada (* * p < 0, 1, teste t de Welch). Este número foi modificado a partir de Takagi et al.22por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: diferença fenotípica entre amastigotas de nocaute e trypomastigote diferenciado. (A) representação esquemática da linha de tempo experimental. (B) contagens da pilha do amastigotas axênicos em 4 dias de transfection do borne para amastigotas do controle (barra preta) e TcPAR1-ko amastigotas (barra cinzenta). Os valores médios (± DP) de três experimentos de eletroporação são plotados (n.s.: não significante, teste U de Mann-Whitney). (C) percentual de células do hospedeiro infectado 3T3 em 4 dias após a infecção pelo controle amastigotas (barra preta) e TcPAR1-ko amastigotas (barra cinza). Os valores médios (± DP) de três poços de cultura são plotados (n.s.: não significante, teste U de Mann-Whitney). (D) número de tripomastigota liberado no meio de cultura em 5 dias de infecção do borne para a cocultura do controle (barra preta) e a co-cultura de TcPAR1-KO (barra cinzenta). Os valores médios (± DP) de três poços de cultura são plotados (* p < 0, 5, teste U de Mann-Whitney). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela suplementar 1: composição do meio lit. O meio LIT foi preparado de acordo com ATCC 1029, exceto para a quantidade de fosfato dissódico de hidrogênio. Por favor, clique aqui para baixar a tabela.

Complementar Figura 1: efeito do tampão de eletroporação na viabilidade da célula amastigotas. A EA foi eletroporada em tampão de eletroporação ou em tampão em em. Amastigote foi manchado com o PI após 24 h para contar o número de amastigotes vivos e inoperantes. Porcentagens de células mortas em cada grupo e no grupo sem pulso são plotadas. A média (± DP) de três experimentos de eletroporação é mostrada (* p < 0, 5, n.s.: não significante, teste de Kruskal-Wallis). Por favor clique aqui para baixar a figura.

Figura suplementar 2: imagens da microscopia de TcPAR1-ko nuclear-manchada e de amastigotes intracelular do controle. A co-cultura de pilhas 3T3 do anfitrião e de amastigotas transfected foi fixada e manchada em 4 dias de infecção do borne. Barras de escala: 20 μm. por favor clique aqui para baixar a figura.

Figura complementar 3: fenótipo de crescimento do epimastigote de expressão de Cas9. Contagens de células de epimastigotas silvestres (WT), epimastigotas que expressam constitutivamente Cas9-EGFP (Cas9-EGFP), e epimastigotas que expressam Cas9-EGFP a regulação de amastigote-específico 3 '-UTR (Cas9-EGFP-AmaUTR) são plotados na escala de log. Os epimastigotas foram cultivados em meio LIT (10% FCS) a 28 ° c. A densidade de células parasitadas foi ajustada para 1 x 106 células/ml no dia 0. As contagens de células cumulativas são calculadas como a densidade da célula multiplicada pelo fator de diluição total. A média (± DP) de três frascos de cultura é mostrada (* p < 0,05, n.s.: não significante, teste de Kruskal-Wallis). Por favor clique aqui para baixar a figura.

Suplementar filme 1: imagem de vídeo de microscopia de cocultura de controle. Número e actividade de tripomastigotas que diferenciaram-se de amastigotas de controle. Imagem de vídeo em 5 dias após a infecção é mostrada.  Por favor, clique aqui para baixar o filme.

Suplementar filme 2: imagem de vídeo de microscopia de TcPAR1-ko cocultura. Número e atividade de tripomastigotas que se diferenciaram de amastigotas de TcPAR1-KO. Imagem de vídeo em 5 dias após a infecção é mostrada. Por favor, clique aqui para baixar o filme.

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Discussion

Nós demonstramos que a cultura axênicos de amastigotas do T. cruzi pode ser utilizada no nocaute crispr/Cas9-negociado do gene, electroporating o grna diretamente em Cas9-expressando o ea. Desta forma, a essencialidade do gene alvo especificamente no estágio amastigotas pode ser avaliada sem passar por outros estágios de desenvolvimento.

Um outro aspecto benéfico do transfection do amastigotas é a conveniência no teste para um grande número genes do alvo. Uma vez que a cocultura de Cas9-expressando T. cruzi e célula de mamíferos hospedeiro é estabelecida, leva apenas alguns dias para transformar os tripomastigotas derivados do tecido em ea e transfecção grna para obter amastigotas de nocaute. gRNA é o único material que precisa ser adaptado para cada gene alvo, mas o gRNA sintético está disponível a partir do número de fabricantes, por isso pode simplesmente ser comprado. Um método alternativo para analisar a essencialidade específica do estágio dos genes alvo seria estabelecer um sistema de nocaute induzível32. Nesse caso, os plasmídeo devem ser construídos para cada gene alvo e transfectados para o parasita no estágio atividade para permitir a seleção de fármacos dos transfectantes, uma vez que a eficiência de transfecção do plasmídico é muito menor do que a do grna (< 15% para plasmídeo 26 como suposto > 96% para grna22). Os ACTHR selecionados devem ser diferenciados em tripomastigotas metacíclicos para infectar pilhas de anfitrião para induzir finalmente um nocaute no amastigote intracelular. Todo esse processo levaria 1-2 meses.

Neste relatório, nós usamos o PI para distinguir pilhas inoperantes na cultura axênicos do amastigotas para quantificar a densidade da pilha com um Hemocytometer. Alternativamente, ensaios metabólicos como o ensaio de viabilidade de resazurina podem ser empregados para estimar o número de amastigotas ao vivo, o que é mais adequado para um formato de alta taxa de transferência. Em nossas mãos, 1 x 105 amastigotas por poço produzem uma atividade redox suficiente para ser detectada por um ensaio de resazurina após 5 h de incubação.

Uma desvantagem de estabelecer uma linha celular de expressão de CAS9 é a carga celular potencial e a clivagem não específica devido à superexpressão Cas95,33. Há vários relatos indicando que a expressão constitutiva de Cas9 não tem efeito sobre a taxa de crescimento de T. cruzi4,6,7,8. Entretanto, em um exemplo5 e também em nossas mãos, o parasita de expressão de Cas9 mostrou o crescimento lento que compara ao wildtype. Para superar esse problema, empregamos o 3 '-UTR específico de amastigotas para restringir a expressão de Cas9 ao estágio amastigotas22. A conjugação do amastina 3 '-UTR ao quadro de leitura aberto de Cas9 restaurou a taxa de replicação do parasita transgênico (Figura 3 suplementar), produzindo assim a cocultura robusta do parasita hospedeiro para fornecer continuamente tripomastigotas para in vitro a amastigogênese. Recentemente, outros grupos demonstraram que a introdução do complexo grna/Cas9 RNP ao parasita tipo selvagem pode causar a edição do genoma em T. cruzi7,9. Este método deve ser explorado como uma abordagem menos estressante para o parasita9, uma vez que o estudo em células de mamíferos sugere que o uso de RNP reduz a edição indesejada do genoma fora do alvo, devido à meia-vida curta da proteína Cas934.

Outra modificação opcional ao protocolo seria a cotransfecção do DNA do doador como modelo para recombinação homóloga. Relatou-se que o ADN do doador que contem seqüências homóforas ao montante e a jusante do local do clivagem, em um formulário do ADN dobro-encalhado4,5,8,35 ou único-encalhado o oligonucleotide7,9, facilita o processo do reparo da ruptura dobro-encalhada causada pela nuclease Cas9. Embora alguns relatórios indiquem que a junção mediada microhomology da extremidade sem molde fornecedor pode reparar a clivagem e introduzir uma mutação5do apagamento, introdução da seqüência definida ao local da mutação não obstante ajuda a confirmar edição bem sucedida do genoma, porque é difícil mostrar a evidência do ADN do nocaute do gene em alguns casos, mesmo que a redução da proteína do alvo e o resultado fenotípico sugerem que o gene do alvo estêve mutado4.

O transfection de Cas9/grna RNP e o co-transfection de um ADN do doador não são demonstrados neste relatório para simplificar a descrição do protocolo e para centrar-se sobre a preparação do ea e o uso da cultura axênicos depois disso. Se alguém deseja realizar esses experimentos, pode ser feito simplesmente substituindo os componentes do Electroporation.

Nosso método de utilizar a EA de T. cruzi como uma ferramenta experimental potencialmente permite uma variedade de estudos específicos de estágio, incluindo expressão gênica transitória por transfecção de plasmídeo e teste de eficácia de drogas22. Entretanto, a eficácia desta aproximação foi testada somente na tensão de Tulahuen até agora. Como cepas de T. cruzi são bastante diversificadas, a aplicabilidade deste protocolo a outras cepas deve ser investigada.

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Disclosures

Os autores não têm conflito de interesse em divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado em parte por JSPS KAKENHI Grant Number 18K15141 para Y.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20% formalin solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 068-03863 fixing cells
25 cm2 double seal cap culture flask AGC Techno Glass 3100-025
75 cm2 double seal cap culture flask AGC Techno Glass 3110-075
All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X710
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for Control) IDT custom made target sequence = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcCGM1) IDT custom made target sequence = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcPAR1) IDT custom made target sequence = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA IDT 1072532 to anneal with crRNA
Amaxa Nucleofector device LONZA AAN-1001 electroporation
Basic Parasite Nucleofector Kit 2 LONZA VMI-1021 electroporation
BSA Sigma-Aldrich A3294 component of the medium for in vitro amastigogenesis
Burker-Turk disposable hemocytometer Watson 177-212C cell counting
Coster 12-well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3513
DMEM FUJIFILM Wako Pure Chemical 044-29765 culture medium
Fetal bovine serum, Defined Hyclone SH30070.03 heat-inactivate before use
G-418 Sulfate Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 077-06433 selection of transformant
Hemin chloride Sigma-Aldrich H-5533 component of LIT medium
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570 staining of nuclei
Liver infusion broth, Difco Becton Dickinson 226920 component of LIT medium
MES FUJIFILM Wako Pure Chemical 349-01623 component of the medium for in vitro amastigogenesis
PBS (–) FUJIFILM Wako Pure Chemical 166-23555
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4864-10ML staining of dead cells
RPMI 1646 Sigma-Aldrich R8758 medium for metacyclogenesis

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References

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Introduzindo um nocaute genético diretamente no estágio Amastigote do <em>Trypanosoma cruzi</em> usando o sistema crispr/Cas9
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Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K., Takagi, Y. Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (149), e59962, doi:10.3791/59962 (2019).

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