Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Introductie van een gen knock-out direct in het Amastigote stadium van Trypanosoma cruzi met behulp van het crispr/Cas9 systeem

Published: July 31, 2019 doi: 10.3791/59962
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)

Summary

Hier beschrijven we een protocol om een gen knock-out in de extracellulaire amastigote van Trypanosoma cruzi te introduceren, met behulp van het crispr/Cas9-systeem. De groei fenotype kan worden opgevolgd door de celtelling van de Axenische amastigote cultuur of door proliferatie van intracellulaire amastigotes na de invasie van de cel van de host.

Abstract

Trypanosoma cruzi is een pathogene protozoeen parasiet die de ziekte van Chagas voornamelijk in Latijns-Amerika veroorzaakt. Om een nieuwe drug target tegen T. cruzite identificeren, is het belangrijk om de essentialiteit van het doel gen in de zoogdier fase van de parasiet, de amastigote, te valideren. Amastigotes van T. cruzi repliceren in de host-cel; het is dus moeilijk om een knock-out experiment uit te voeren zonder door andere ontwikkelingsstadia te gaan. Onlangs rapporteerde onze groep een groei voorwaarde waarin de amastigote axenisch tot 10 dagen kan repliceren zonder zijn amastigote-achtige eigenschappen te verliezen. Door deze temporale Axenische amastigote cultuur te gebruiken, introduceerden we met succes Grna's rechtstreeks in het Cas9-uitdrukken van amastigote om genknockouts te veroorzaken en hun fenotypes uitsluitend in de amastigote fase te analyseren. In dit rapport beschrijven we een gedetailleerd protocol om in vitro afgeleide extracellulaire amastigotes te produceren en om de Axenische-cultuur te gebruiken in een CRISPR/Cas9-gemedieerd knock-outexperiment. De groei fenotype van uitblust amastigotes kan worden geëvalueerd hetzij door celtellingen van de Axenische-cultuur, of door replicatie van intracellulaire amastigote na de invasie van de cel van de host. Deze methode omzeilt de parasiet stage differentiatie normaal betrokken bij het produceren van een transgene of een knock-out amastigote. Het gebruik van de temporale Axenische amastigote cultuur heeft het potentieel om de experimentele vrijheid van stage-specifieke studies in T. cruzi uit te breiden.

Introduction

Trypanosoma cruzi is de veroorzaker van de ziekte van Chagas, die overwegend in Latijns-Amerika1voorkomt. T. cruzi heeft kenmerkende levenscyclus stadia tussen een insecten vector en een zoogdier gastheer2. T. cruzi repliceert als een epimastigote in de hepatopancreas van een bloedzuigende triatomine bug en onderscheidt zich in een infectieuze metacyclische trypomastigote in zijn achterhand voordat het wordt afgezet op een menselijke of dierlijke gastheer. Zodra de trypomastigote door de bijt plaats of door een slijmvlies in het gastlichaam komt, valt de parasiet in een holecel en transformeert in een flagella-loze ronde vorm genaamd een amastigote. De amastigote repliceert binnen de ontvangende cel en maakt uiteindelijk onderscheid in trypomastigote, die uit de ontvangende cel uitbarst en de bloedstroom binnenkomt om een andere hostcel te infecteren.

Aangezien momenteel beschikbare chemotherapeutische middelen, benznidazol en Nifurtimox, nadelige bijwerkingen veroorzaken en niet effectief in de chronische fase van de ziekte3, het is van groot belang om te identificeren van de nieuwe drug doelen tegen T. cruzi. In de afgelopen jaren is het CRISPR/Cas9 systeem uitgegroeid tot een krachtig instrument om genen knock-out effectief uit te voeren in T. cruzi, hetzij door transfectie van afzonderlijke of enkelvoudige plasmide (s) die Grna en Cas94bevatten, door stabiele expressie van Cas9 en daaropvolgende introductie van grna5,6,7 of transcriptie sjabloon van grna8, of door elektroporation van het voorgevormde grna/Cas9 RNP complex7,9. Deze technologische vooruitgang is zeer verwacht te versnellen van de drug target onderzoek in de ziekte van Chagas.

Om verder te gaan met de ontwikkeling van geneesmiddelen, is het cruciaal om de essentialiteit van het doel gen of de werkzaamheid van kandidaatstoffen in de amastigote van T. cruzite valideren, omdat het de replicatie fase van de parasiet is in de zoogdier gastheer. Echter, dit is een uitdagende taak, omdat amastigotes kan niet rechtstreeks worden gemanipuleerd als gevolg van de aanwezigheid van een obstructieve host-cel. In Leishmania, een nauw verwante protozoa parasiet tot T. cruzi, een Axenische amastigote kweekmethode werd ontwikkeld en is gebruikt in drug screening testen10,11,12, 13. Hoewel er enkele discrepanties in gevoeligheid voor verbindingen tussen Axenische amastigotes en intracellulaire amastigotes14, het vermogen om de Axenische cultuur te handhaven niettemin biedt waardevolle experimentele instrumenten om te bestuderen van de basis biologie van de klinisch relevante fase van Leishmania15,16. In het geval van T. cruzi, literaturen met betrekking tot de aanwezigheid van natuurlijk voorkomende extracellulaire amastigotes (EA)17 en in vitro productie van EA17,18,19 dateren uit decennia geleden. Daarnaast is het bekend dat EA een besmettelijke capaciteit heeft20, zij het minder dan die van trypomastigote, en het mechanisme van amastigote gastheer invasie is in de afgelopen jaren opgehelderd (beoordeeld door Bonfim-Melo et al.21). Echter, in tegenstelling tot Leishmania, was EA niet gebruikt als een experimenteel hulpmiddel in T. cruzi, vooral omdat EA werd beschouwd als een verplicht intracellulaire parasiet, en dus niet werd beschouwd als "replicatieve vorm" in een praktische Zin.

Onlangs heeft onze fractie voorgesteld om EA van T. cruzi te gebruiken als een temporale Axenische-cultuur22. Amastigotes van T. cruzi tulahuen stam kan repliceren vrij van gastheer cellen in verlicht medium bij 37 ° c voor maximaal 10 dagen zonder ernstige verslechtering of verlies van amastigote-achtige eigenschappen. Tijdens de host-vrije groeiperiode werd EA met succes gebruikt voor exogene genexpressie door conventionele elektroporation, drug titratie assay met trypanocidale verbindingen, en CRISPR/Cas9-gemedieerde Knockout, gevolgd door groei fenotype monitoring. In dit rapport beschrijven we het gedetailleerde protocol om in vitro afgeleide EA te produceren en om de Axenische amastigote in Knockout-experimenten te gebruiken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: Een overzicht van de gehele experimentele stroming wordt afgebeeld in Figuur 1.

Figure 1
Afbeelding 1: overzicht van het knock-outexperiment met EA. Weefselkweek-afgeleide trypomastigoten worden geoogst en gedifferentieerd in EA. grna wordt omgezet in Cas9-uitdrukken van amastigotes door middel van elektroporation, en groei fenotype van de knockout amastigote wordt geëvalueerd hetzij door Axenische replicatie of door intracellulaire replicatie na invasie van host-cel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

1. preparaten voor de parasiet cultuur

  1. Tulahuen-stam van Trypanosoma cruzi wordt in dit verslag gebruikt. Handhaaf epimastigotes van T. cruzi in verlicht medium (10% FCS, Zie aanvullende tabel 1). Sluit de dop stevig en bewaar de kweek kolf op 28 °C.
  2. Genereer een transgene stam van T. cruzi die de Cas9 endonuclease herbergt. Voorbeelden van de expressie plasmiden die Cas9 Codeer volgorde en G418 (neor) selectie marker bevatten, kunnen gevonden worden in Lander et al.4 en Peng et al.5
    1. Transfect het bovenstaande plasmide in epimastigote door elektroporation, met behulp van de kit vermeld in de tabel van de materialen. Voor 1 cuvette, spin 2 x 107 cellen, gooi de supernatant, en respenderen met 100 μL van electroporatie buffer met de meegeleverde supplement oplossing.
      Opmerking: De electroporatie buffer kan worden vervangen door em buffer24 (3:1 mengsel van cytomix25 en fosfaat-sucrose buffer).
    2. Voeg 20-40 μg plasmide toe en breng het mengsel over in een 2 mm spleet elektroporation kuvette. Breng de puls aan met een elektroporation apparaat (Zie tabel met materialen) met behulp van het X-14 programma26.
    3. Breng de inhoud van de Cuvette in een T-25-kolf met 5 mL verlicht medium (10% FCS). Incuberen de kolf bij 28 °C gedurende 24 uur.
    4. Voeg G418 toe aan een eindconcentratie van 250 μg/mL en ga verder met incubatie bij 28 °C. Het duurt ongeveer 1 week om de niet-getransfunde epimastigotes te doden. Zodra de G418-resistente populatie begint te herstellen, doorgang van de cultuur een of twee keer per week om verzadiging te voorkomen en de dode cellen te verdunnen. Het opzetten van een stabiele cellijn duurt meestal in totaal 4 weken.
      Opmerking: Indien de constitutieve uitdrukking van Cas9 een last is voor de cel5, maak dan de uitdrukking specifiek voor de amastigote fase door de 3 '-UTR van het amastin gen onmiddellijk stroomafwaarts van de Cas9 open reading frame27te vervoegen. De gedetailleerde beschrijving van de amastigote-specifieke Cas9 expressie plasmide kan worden gevonden in Takagi et al.22
  3. Stel een gastheer-parasiet co-cultuur van Cas9-uitdrukken T. cruzi en zoogdieren gastheer cellen. Gebruik in dit rapport 3T3-Swiss albino fibroblast Cell als gastheer.
    1. Differentieer T. cruzi epimastigotes in metacyclische trypomastigotes. Bepaal de celdichtheid van de epimastigote cultuur met behulp van een hemocytometer en verzamel 5 x 107 cellen door centrifugeren gedurende 15 minuten bij 2.100 x g. Gooi de supernatant weg en regeer de cellen met 10 mL RPMI-medium. Incuberen de parasiet bij 28 °C gedurende 1 week28.
    2. Verzamel metacyclische trypomastigoten in rpmi-medium. Kantel de kolf voorzichtig en Pipet de oplossing uit zonder de parasieten te storen die aan het bodemoppervlak zijn gehecht. Breng het medium over naar een conische buis en centrifugeer 15 minuten bij 2.100 x g. Gooi het supernatant weg en regeer de parasiet met 5 mL DMEM (10% FCS).
      Opmerking: De parasiet populatie is een mengsel van metacyclische trypomastigotes, epimastigotes, en sommige tussenliggende vormen. Hoewel het niet nodig is, u trypomastigote isoleren door DEAE ionenwisselingschromatografie29. Als alternatief kunnen epimastigotes worden geëlimineerd door de parasieten met een actief serum te bebroed om ze te onderwerpen aan lysis30.
    3. Zaad 3T3-Zwitserse albino fibroblast cel tot 60-70% confluency, of ongeveer 1,7-2,0 x 106 cellen in 5 ml DMEM (10% FCS) in de T-25 cultuur kolf. Verwijder het groeimedium en breng de parasiet mengsel van stap 1.3.2. Incuberen gedurende 24 uur bij 37 °C onder 5% CO2 in een bevoficeerde incubator om een infectie op te zetten.
    4. Verwijder de parasieten die buiten de host 3T3 cellen blijven door twee keer de co-cultuur te wassen met DMEM (10% FCS).
    5. Zodra de co-cultuur verzadigd is, passage amastigote-geïnfecteerde gastheer cellen door trypsinisatie. Aspireren het medium en spoel de cultuur één keer met PBS. Breng 1 mL van 0,05% trypsine-oplossing aan om het hele cultuur oppervlak te bedekken en inbroed enkele minuten bij kamertemperatuur totdat de bijgevoegde hostcellen losraken. Maak de cellen los van het oppervlak van de kolf door 3 mL DMEM (10% FCS) over de cellen te spoelen.
    6. Breng losgekoppelde hostcellen over in een conische buis en Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 300 x g. Zuig de supernatant op en hervat de cellen met 3 mL verse DMEM (10% FCS). Deze stap helpt om resterende epimastigotes te elimineren. Breng alles over in een schone T-75 kolf met 9 mL DMEM (10% FCS). Ga verder met kweken totdat trypomastigote wordt vrijgelaten in de cultuur supernatant.
    7. Behoud de co-cultuur door twee keer per week trypsinisatie te door te voeren. Zodra 70-80% van de ontvangende populatie besmet raken, Voeg regelmatig niet-geïnfecteerde host 3T3 cellen toe aan de ratio van 5:1 (carryover: Fresh), om verslechtering van de cultuur te voorkomen. Trypomastigote egresses continu als de balans tussen de gastheer cellen en T. cruzi correct wordt gehandhaafd.

2. differentiatie van Trypomastigotes in EA

  1. Op de dag voor dit experiment, verwijder het groeimedium van gastheer-parasiet co-cultuur en voeg verse DMEM (10% FCS) om weg te spoelen EA en trypomastigoten die al waren vrijgelaten uit de gastheer cellen in voorgaande dagen. Voor regelmatige experimenten zijn ten minste twee T-75 kolven van de confluente co-cultuur nodig.
  2. Verzamel cultuur supernatant in een conische buis om vers opgedoken trypomastigotes te oogsten. Controleer het monster onder een microscoop (10x of 20x objectief objectief) voor de kwaliteit. Als er vuil van de gastheer is, Centrifugeer het monster kort en breng het supernatant over in een nieuwe buis. Als er een significant aantal ea's, isoleren trypomastigoten door de volgende Swim-out procedure.
    1. Spin het mengsel van trypomastigoten en amastigotes gedurende 15 minuten bij 2.100 x g. Gooi het grootste deel van het supernatant weg en laat 0,5-1,0 mL medium in de buis.
      Opmerking: het volume verminderen is optioneel, maar het maakt de volgende stap gemakkelijker.
    2. Inbroed de pellet bij 37 ° c voor 1-2 h, waardoor actieve trypomastigoten uit de pellet kunnen zwemmen (Figuur 2).
    3. Breng het supernatant met trypomastigoten over in een micro centrifugebuis van 1,5 ml.
  3. Centrifugeer de conische buis gedurende 15 minuten bij 2.100 x g om trypomastigotes te verzamelen. Als de zwemout-procedure hierboven werd uitgevoerd, centrifugeer de buis van 1,5 mL gedurende 2 minuten bij 4.000 x g tot pellet de trypomastigote. Gooi het supernatant weg.
  4. Respendeer de pellet met 5 mL DMEM gebufferd met 20 mM MES (pH 5,0), aangevuld met 0,4% BSA19. Breng de parasiet over in een T-25-kweek kolf. Laat de dop los. De celdichtheid moet rond of onder 1 x 107 cellen/ml liggen, aangezien oververzadiging de kans op celdood verhoogt.
    Opmerking: De kleur van de DMEM moet geel zijn, niet oranje. Als de oorspronkelijke DMEM een hoge buffercapaciteit had, is 20 mM MES (pH 5,0) niet voldoende om de pH te verlagen. De pH van het medium moet in dat geval worden aangepast door toevoeging van HCl. Het zure medium kan worden bewaard bij 4 °C, maar niet langer dan 1 maand.
  5. Incuberen de kweek kolf bij 37 °C onder 5% CO2 in een bevoficeerde incubator. Rond 95% van de parasieten differentiëren in amastigotes na 24 uur.

3. elektroporation van EA

  1. Bereid gRNA voor elektroporation. Dit kan worden gedaan door in vitro transcriptie, of gewoon door de aankoop van synthetische RNA oligonucleotiden van een fabrikant. In dit rapport worden crRNA en tracrRNA van Integrated DNA Technologies, Inc. gebruikt.
  2. Centrifuge de cultuur van EAs gedurende 15 minuten bij 2.100 x g. Gooi supernatant weg.
  3. Respendeer de pellet met electroporatie buffer met de meegeleverde supplement oplossing voor de uiteindelijke celdichtheid van 1 x 108 cellen/ml.
    Opmerking: em-buffer veroorzaakt meer celsterf gevallen in vergelijking met de electroporatie buffer in de lijst van materialen; Dus, het is niet aanbevolen voor amastigote transfectie (aanvullend figuur 1).
  4. Aliquot 100 μL resuspendeerde parasieten (1 x 107 cellen) in 1,5 ml micro centrifugebuizen. Voeg 5-10 μg gRNA toe en meng zachtjes door pipetten.
  5. Breng het mengsel over in een 2 mm gap electroporatie kuvette. Breng de puls met de electroporatie apparaat, met behulp van X-14 programma.
  6. Breng de inhoud van de Cuvette in een T-25-kolf met 5 mL voorverwarmd verlicht medium (10% FCS). Laat het dopje los en incuberen de kolf bij 37 °C onder 5% CO2.
  7. Monitor de celgroei door voortzetting van Axenische kweek (sectie 4) of als intracellulaire amastigotes na infectie van de host-cel (rubriek 5).

4. monitoring van de groei van Knockout cellen als Axenic Amastigotes

  1. Ea's vestigen zich aan de onderkant van het kweekmedium, dus schud de kolf voorzichtig om ze in de oplossing te hervatten. Het reinigen van het oppervlak van de kolf door pipetteren helpt, omdat sommige cellen aan de kolf worden gehecht.
  2. Meng 1 μL propidium jodide (PI)-oplossing (20 μg/mL) met 20 μL amastigote-cultuur.
    Opmerking: Laat de kweek kolf niet langer dan nodig buiten de incubator. Temperatuur is een van de factoren die het mogelijk maakt Axenische proliferatie22.
  3. Breng het monster op hemocytometer aan en observeer onder een fluorescentiemicroscoop. PI is bedoeld om het celmembraan te beschadigen, maar is uitgesloten van levende cellen. Tel het aantal levensvatbare amastigotes die niet worden gekleurd door PI (ex/em 570 nm/602 nm).

5. monitoring van de groei van Knockout cellen als intracellulaire Amastigotes

  1. Seed host 3T3 cellen in een 12-put plaat met DMEM (10% FCS). Pas de celdichtheid aan tot 70-80% confluency, of ongeveer 3 x 105 cellen per put.
    Opmerking: Aangezien amastigotes niet motiel zijn, het grootste deel van het groei oppervlak bedekt door de gastheer cellen verbetert de efficiëntie van de infectie.
  2. Verzamel Knockout amastigotes uit stap 3,6 door centrifugeren een dag na elektroporation. Gooi de supernatant weg en regeer de parasiet met 2 mL DMEM (10% FCS).
  3. Verwijder medium uit de celcultuur van de host en pas geresuspendeerde amastigotes toe. Een veelheid van infecties moet 20 of hoger zijn. Incuberen de plaat bij 37 °C onder 5% CO2 gedurende 2 dagen om amastigotes in staat te stellen een infectie te veroorzaken.
    Opmerking: Infectie periode kan 1 dag, afhankelijk van het doel.
  4. Weggewassen EAs bleef tweemaal buiten de hostcellen met DMEM (10% FCS).
  5. Voeg verse DMEM (10% FCS) toe aan de co-cultuur van de gastheer-parasiet en ga verder met de incubatietijd bij 37 °C voor nog 2 dagen.
  6. Om te evalueren infectie efficiëntie, visualiseer kernen van de gastheer cellen en intracellulaire amastigote.
    Opmerking:     kernen worden meestal overlapt met verzadigde co-cultuur. Het opnieuw plateren van cellen bij lagere celdichtheid (zoals 1:5 verdunning) voorafgaand aan fixatie en kleuring helpt om kernen gemakkelijker te tellen.
    1. Verwijder het kweekmedium en breng 1 mL 10% formaline oplossing aan in PBS om de cellen te fixeren. Incuberen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Vervang de formaline-oplossing door 1 mL PBS met 1 μg/mL Hoechst 33342 en 0,1% Triton X-100. Incuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Verwijder de Hoechst-oplossing en spoel de cellen één keer met PBS. Voeg 1 mL verse PBS toe.
  7. Observeer onder fluorescentiemicroscoop en Identificeer host celkernen die geassocieerd zijn met kleinere parasiet kernen (Figuur 4). Host cellen die meer dan 2 amastigotes bevatten moeten worden beschouwd als besmet, niet te bevatten niet-productieve initiële infectie of ongewassen EAs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolatie van trypomastigoten door de Swim-out procedure

Om verse trypomastigoten te oogsten van contaminerende oude ea's door Swim-out procedure, moeten celpellets ten minste voor 1 h worden geïnineerd. incuberen van de pellets voor meer dan 2 h niet significant verhogen het aantal trypomastigoten zwemmen in de oplossing ( Figuur 2b). In dit specifieke experiment was het percentage trypomastigote in het oorspronkelijke mengsel 38%, en het percentage na de Swim-out was boven 98% op een gegeven moment punten. Van twee T-75 kolven van de confluente co-cultuur verkrijgen we routinematig 3-4 x 107 cellen van pure trypomastigote door dit Swim-out protocol.

Groei monitoring van knock-out amastigote als Axenische-cultuur

In tegenstelling tot andere ontwikkelingsstadia van T. cruzi, zijn flagellar-minder amastigotes praktisch statisch. Dus, kleuring met PI helpt om levende amastigotes van dode degenen te onderscheiden. PI is ongevoelbaar voor het intacte celmembraan, maar dringt gemakkelijk dode cellen in (Figuur 3a). Amastigotes met grna tegen Essential Gene, TcCGM1 (tcclb. 511807.80), toonde een significant groei defect vergeleken met de controlegroep die grna niet homologe ontving voor het T. cruzi genoom (Figuur 3b).

Groei monitoring van Knock-outparasieten als intracellulaire amastigotes

De essentialiteit van het doel gen in het amastigote stadium kan ook worden aangetoond door evaluatie van het groei fenotype van Knockout T. cruzi als intracellulaire amastigote (Figuur 4). De Fractie van de gastheer kernen die geassocieerd zijn met kleinere T. cruzi kernen was significant lager in TcCGM1-ko groep vergeleken met de controlegroep.

Knockout van een fase-specifiek gen veroorzaakt fenotypische verschil in amastigote en trypomastigote stadia

Paraflagellar Rod component PAR1 wordt sterk uitgedrukt in trypomastigote stage, maar is gedowngereguleerd in het amastigote stadium van T. cruzi22,31. Inderdaad, transfectie van grna tegen TcPAR1 (tcclb. 506755.20) had geen significant effect op de groei van EA na 4 dagen Axenische kweek (Figuur 5b). gRNA transfectie gevolgd door gastheer cel invasie toonde ook aan dat TcPAR1-ko niet remt de groei van intracellulaire amastigotes, in termen van de Fractie van geïnfecteerde gastheer cellen op 4 dagen na infectie (figuur 5c). Het aantal parasieten binnen de individuele host-cel leek niet te worden beïnvloed door de knock-out, ofwel (aanvullend figuur 2). Deze resultaten geven aan dat TcPAR1 niet essentieel is in het amastigote stadium van T. cruzi.

Het aantal trypomastigoten dat na 5 dagen na de infectie uit gastheer cellen ontstond, was echter significant lager in de TcPAR1-ko-co-cultuur, in vergelijking met de co-cultuur van de controle (figuur 5d). Ook, gedifferentieerde trypomastigoten binnen host 3T3 cel voor egression leek vrij actief in controlegroep (aanvullende film 1) maar leek traag in TcPAR1-ko groep (aanvullende films 2). Deze resultaten suggereren dat TcPAR1 een belangrijke rol speelt in de trypomastigote fase van T. cruzi, vermoedelijk door het verstrekken van beweeglijkheid om de egressie te helpen, ondanks de niet-essentialiteit in amastigote stadium.

Figure 2
Figuur 2: isolatie van trypomastigote door een zwemout procedure. A) Schematische weergave van het protocol. Rood = aanwezigheid van trypomastigote. B) het aantal trypomastigoten dat op aangegeven tijdstippen uit de pellet is gezwel. Initiële pellets bevatte totaal 3 x 107 parasieten, 38% van die waren trypomastigoten en de rest van die waren amastigotes. Experimenten werden uitgevoerd in drievand en gemiddelde waarden (± SD) worden uitgezet. De zuiverheid van trypomastigoten in oplossing was boven 98% op een gegeven moment punten. C) microscopie beelden van parasieten vóór het zwemmen-out procedure (links), trypomastigoten die gezwommen uit een pellet (midden), en parasieten overgebleven in een pellet (rechts) na 1 h van incubatie. Schaal staven = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: groei monitoring van Axenische amastigote. A) uitsluitings test voor propidium jodide (PI). Microscopie beelden van EA op een hemocytometer in helderveld (links), fluorescentie kanaal (midden), en overlegde afbeelding (rechts). Gele pijlen geven PI-gekleurd dode cellen aan. Schaal staven = 20 μm. (B) aantal cellen van Cas9-het uiten van amastigotes na transfectie met Grnas tegen TcCGM1 (Open Circle) en controle van grna met geen homologie aan T. cruzi genoome (gesloten cirkel). Elektroporaties werden uitgevoerd in triplicaten, en gemiddelde waarden (± SD) worden uitgezet. (* * p < 0,01 door de t-toets van Welch). Dit cijfer is gewijzigd van Takagi et al.22Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: groei van knock-out amastigotes na invasie van de host. A) kern kleuring van de co-cultuur van gastheer-parasiet na intracellulaire replicatie van amastigotes met grnas tegen TcCGM1 en Control grna. gRNA-getransfuneerde EAs werden aangebracht op 3T3 cellen 1 dag na elektroporation en toegestaan om gastheer cellen te infecteren voor 2 dagen. Amastigotes overgebleven buiten de gastheer cellen werden weggespoeld, en de gastheer-parasiet co-cultuur werd geïnineerd voor een extra 2 dagen. Schaal staven = 20 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Takagi et al.22 (B) percentage van host 3T3 cellen geïnfecteerd door controle amastigotes (Black bar) en TcCGM1-ko amastigotes (grijze balk). Het gemiddelde (± SD) van drie infectie experimenten wordt uitgezet (* * p < 0,01, de t-toets van Welch). Dit cijfer is gewijzigd van Takagi et al.22Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: fenotypische verschil tussen knock-out amastigote en gedifferentieerde trypomastigote. A) Schematische weergave van de experimentele tijdlijn. B) celtellingen van Axenische amastigote op 4 dagen na transfectie voor controle amastigotes (zwarte balk) en TcPAR1-ko amastigotes (grijze balk). Gemiddelde waarden (± SD) van drie elektroporatieexperimenten worden uitgezet (n.s.: niet significant, Mann-Whitney U -test). (C) percentage geïnfecteerde gastheer 3T3 cellen op 4 dagen na infectie door controle amastigote (zwarte balk) en TcPAR1-ko amastigote (grijze balk). Gemiddelde waarden (± SD) van drie kweek putten worden uitgezet (n.s.: niet significant, Mann-Whitney U -test). D) het aantal trypomastigote dat in kweekmedium wordt vrijgegeven na 5 dagen na infectie voor controle-co-cultuur (zwarte balk) en TcPAR1-ko-co-cultuur (grijze balk). De gemiddelde waarden (± SD) van drie kweek putten worden uitgezet (* p < 0,05, Mann-Whitney U -test). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende tabel 1: samenstelling van verlicht medium. VERLICHT medium werd bereid volgens ATCC 1029, met uitzondering van de hoeveelheid dinatriumwaterstoffosfaat. Klik hier om de tabel te downloaden.

Aanvullend figuur 1: effect van electroporatie buffer op amastigote cel levensvatbaarheid. EA werd elektroporated in de electroporatie buffer of in em buffer. Amastigote was gekleurd met PI na 24 h om het aantal levende en dode amastigotes te tellen. Percentages dode cellen in elke groep en in de groep no Pulse worden uitgezet. Het gemiddelde (± SD) van drie elektroporation experimenten wordt getoond (* p < 0,05, n.s.: niet significant, Kruskal-Wallis test). Klik hier om de afbeelding te downloaden.

Aanvullend figuur 2: microscopie beelden van nucleair-gekleurd TcPAR1-ko en controle intracellulaire amastigotes. Co-cultuur van host 3T3 cellen en getransffecteerde amastigotes werden vastgesteld en gekleurd op 4 dagen na infectie. Schaal staven: 20 μm. Klik hier om de afbeelding te downloaden.

Aanvullend figuur 3: groei fenotype van Cas9-uitdrukken epimastigote. Celtellingen van wild type epimastigotes (WT), epimastigotes die in constitutief-EGFP (Cas9-EGFP) en epimastigotes die Cas9-EGFP uitdrukt onder de regeling van amastigote-specifieke 3 '-UTR (Cas9-EGFP-AmaUTR), worden uitgezet in de log schaal. Epimastigotes werden geteeld in verlicht medium (10% FCS) bij 28 °C. De celdichtheid van de parasiet werd aangepast aan 1 x 106 cellen/ml op dag 0. Cumulatieve celtellingen worden berekend als celdichtheid vermenigvuldigd met de totale verdunningsfactor. De gemiddelde (± SD) van de drie kweek kolven wordt getoond (* p < 0,05, n.s.: niet significant, Kruskal-Wallis test). Klik hier om de afbeelding te downloaden.

Aanvullende film 1: microscopie videobeeld van de controle-co-cultuur. Aantal en activiteit van trypomastigoten die onderscheiden van controle amastigotes. Video beeld op 5 dagen na infectie wordt getoond.  Klik hier om de film te downloaden.

Aanvullende film 2: microscopie videobeeld van TcPAR1-ko co-Culture. Aantal en activiteit van trypomastigoten die onderscheiden van TcPAR1-ko amastigotes. Video beeld op 5 dagen na infectie wordt getoond. Klik hier om de film te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We hebben aangetoond dat de Axenische-cultuur van T. cruzi amastigotes kan worden gebruikt in crispr/Cas9-gemedieerde Gene Knockout, door grna rechtstreeks te elektroporeren in Cas9-UITDRUKKEN van EA. Op deze manier kan de essentialiteit van het doel gen specifiek in amastigote stadium worden geëvalueerd zonder door andere ontwikkelingsstadia te gaan.

Een ander gunstig aspect van amastigote transfectie is het gemak bij het testen van een groot aantal doel genen. Zodra de co-cultuur van Cas9-uitdrukken van T. cruzi en gastheer zoogdier cel is vastgesteld, duurt het slechts enkele dagen om de weefsel-afgeleide trypomastigoten te transformeren in EA en transfect grna om Knockout amastigotes te verkrijgen. gRNA is het enige materiaal dat moet worden afgestemd op elk doel gen, maar synthetische gRNA is verkrijgbaar bij het aantal fabrikanten, zodat het eenvoudig kan worden aangeschaft. Een alternatieve methode om de fase-specifieke essentialiteit van doel genen te analyseren, zou zijn om een induceerbaar afdeksysteem32op te zetten. In dat geval moeten de plasmiden voor elk doel gen worden geconstrueerd en naar de parasiet in de epimastigote fase worden gegeneerd om de geneesmiddelen keuze van de transfectanten mogelijk te maken, aangezien de transfectie-efficiëntie van het plasmide veel lager is dan die van gRNA (< 15% voor plasmide 26 zoals verondersteld om 96% te ≫ voor grna22). Geselecteerde transfectanten moeten worden gedifferentieerd in metacyclic trypomastigoten om gastheer cellen te infecteren om eindelijk een knock-out te induceren in intracellulaire amastigote. Dit hele proces zou 1-2 maanden duren.

In dit rapport gebruikten we PI om dode cellen in Axenische amastigote Culture te onderscheiden om de celdichtheid te kwantificerend met een hemocytometer. Als alternatief kunnen metabole assays zoals de resazurin levensvatbaarheid assay worden gebruikt om het aantal levende amastigotes te schatten, wat meer geschikt is voor een hoge doorvoer indeling. In onze handen, 1 x 105 amastigotes per goed rendement voldoende redox activiteit worden gedetecteerd door een resazurin assay na 5 h van incubatie.

Een nadeel van het tot stand brengen van een Cas9-uitgerichte cellijn is de potentiële cellulaire last en het niet-specifieke decolleté als gevolg van Cas9 overexpressie5,33. Er zijn verschillende rapporten waaruit blijkt dat de constitutieve uitdrukking van Cas9 geen invloed heeft op het groeitempo van T. cruzi4,6,7,8. Echter, in één geval5 en ook in onze handen toonde Cas9-uitsprak parasiet trage groei in vergelijking met het wild type. Om dit probleem op te lossen, hebben we de amastigote-specifieke 3 '-UTR gebruikt om de expressie van Cas9 te beperken tot amastigote stage22. Conjugatie van amastin 3 '-UTR aan het Cas9 open Lees frame herstelde de replicatiesnelheid van transgene parasiet (aanvullend figuur 3), waardoor een robuuste gastheer-parasiet co-cultuur wordt geproduceerd om trypomastigoten in vitro te leveren amastigogenese. Onlangs hebben andere groepen aangetoond dat de introductie van grna/Cas9 RNP complex aan wild type parasiet kan leiden tot genoom bewerking in T. cruzi7,9. Deze methode moet worden onderzocht als een minder stressvolle benadering van de parasiet9, omdat onderzoek in zoogdiercellen suggereert dat het gebruik van RNP ongewenste, niet-doel genoom bewerking vermindert, vanwege de korte halfwaardetijd van Cas9 proteïne34.

Een andere facultatieve wijziging van het protocol zou de co-transfectie van het donor DNA zijn als een sjabloon voor een homologe recombinatie. Er is gemeld dat het donor DNA dat homologe sequenties bevat, stroomopwaarts en stroomafwaarts van de splijting plaats, in een vorm van dubbel-streng DNA4,5,8,35 of enkel-streng Oligonucleotide7,9, vergemakkelijkt het herstelproces van dubbelgestrande breuk veroorzaakt door Cas9 Nuclease. Hoewel sommige rapporten aangeven dat microhomology gemedieerde eind verbinding zonder donor sjabloon het decolleté kan herstellen en een deletie mutatie5introduceren, helpt de introductie van de gedefinieerde sequentie op de mutatie site niettemin om te bevestigen succesvol genoom Editing, omdat het moeilijk is om het DNA-bewijs van genen knock-out in sommige gevallen te tonen, hoewel de doel proteïne-reductie en fenotypische uitkomst suggereren dat het doel-gen werd gemuleerd4.

Cas9/gRNA RNP-transfectie en co-transfectie van een donor-DNA worden in dit verslag niet gedemonstreerd om de beschrijving van het protocol te vereenvoudigen en zich daarna te concentreren op de voorbereiding van EA en het gebruik van Axenische-cultuur. Als men deze experimenten wil uitvoeren, kan het worden gedaan door de componenten van de elektroporation te vervangen.

Onze methode van het gebruik van EA van T. cruzi als een experimentele tool mogelijk maakt een verscheidenheid van fase-specifieke studies, met inbegrip van voorbijgaande genexpressie door plasmide transfectie en drug werkzaamheids test22. De effectiviteit van deze aanpak is echter alleen getest in de Tulahuen-stam tot nu toe. Aangezien stammen van T. cruzi vrij divers zijn, moet de toepasbaarheid van dit protocol op andere stammen worden onderzocht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflict te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd deels ondersteund door JSPS KAKENHI Grant nummer 18K15141 tot Y.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20% formalin solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 068-03863 fixing cells
25 cm2 double seal cap culture flask AGC Techno Glass 3100-025
75 cm2 double seal cap culture flask AGC Techno Glass 3110-075
All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X710
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for Control) IDT custom made target sequence = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcCGM1) IDT custom made target sequence = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcPAR1) IDT custom made target sequence = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA IDT 1072532 to anneal with crRNA
Amaxa Nucleofector device LONZA AAN-1001 electroporation
Basic Parasite Nucleofector Kit 2 LONZA VMI-1021 electroporation
BSA Sigma-Aldrich A3294 component of the medium for in vitro amastigogenesis
Burker-Turk disposable hemocytometer Watson 177-212C cell counting
Coster 12-well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3513
DMEM FUJIFILM Wako Pure Chemical 044-29765 culture medium
Fetal bovine serum, Defined Hyclone SH30070.03 heat-inactivate before use
G-418 Sulfate Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 077-06433 selection of transformant
Hemin chloride Sigma-Aldrich H-5533 component of LIT medium
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570 staining of nuclei
Liver infusion broth, Difco Becton Dickinson 226920 component of LIT medium
MES FUJIFILM Wako Pure Chemical 349-01623 component of the medium for in vitro amastigogenesis
PBS (–) FUJIFILM Wako Pure Chemical 166-23555
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4864-10ML staining of dead cells
RPMI 1646 Sigma-Aldrich R8758 medium for metacyclogenesis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. (WHO) Fact sheet: Chagas disease (American trypanosomiasis). , [updated 2017 Mar; cited 2017 Aug], at http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/ (2017).
  2. Clayton, J. Chagas disease 101. Nature. 465 (n7301_supp), S4-S5 (2010).
  3. Apt, W. Current and developing therapeutic agents in the treatment of Chagas disease. Drug Design, Development and Therapy. 4, 243-253 (2010).
  4. Lander, N., Li, Z. H. H., Niyogi, S., Docampo, R. CRISPR/Cas9-induced disruption of paraflagellar rod protein 1 and 2 genes in Trypanosoma cruzi reveals their role in flagellar attachment. mBio. 6 (4), e01012 (2015).
  5. Peng, D., Kurup, S. P., Yao, P. Y., Minning, T. A., Tarleton, R. L. CRISPR-Cas9-mediated single-gene and gene family disruption in Trypanosoma cruzi. mBio. 6 (1), e02097-e02114 (2015).
  6. Romagnoli, B. A. A., Picchi, G. F. A., Hiraiwa, P. M., Borges, B. S., Alves, L. R., Goldenberg, S. Improvements in the CRISPR/Cas9 system for high efficiency gene disruption in Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 178, 190-195 (2018).
  7. Burle-Caldas, G. A., Soares-Simões, M., Lemos-Pechnicki, L., DaRocha, W. D., Teixeira, S. M. R. Assessment of two CRISPR-Cas9 genome editing protocols for rapid generation of Trypanosoma cruzi gene knockout mutants. International Journal for Parasitology. 48 (8), 591-596 (2018).
  8. Costa, F. C. Expanding the toolbox for Trypanosoma cruzi: A parasite line incorporating a bioluminescence-fluorescence dual reporter and streamlined CRISPR/Cas9 functionality for rapid in vivo localisation and phenotyping. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), e0006388 (2018).
  9. Soares Medeiros, L. C. High-Efficiency Genome Editing in Protozoan Parasites Using CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins. mBio. 8 (6), (2017).
  10. Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An axenic amastigote system for drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (4), 818-822 (1997).
  11. Bates, P. A. Axenic culture of Leishmania amastigotes. Parasitology Today. 9 (4), 143-146 (1993).
  12. Ravinder, R., Bhaskar, B., Gangwar, S., Goyal, N. Development of luciferase expressing Leishmania donovani axenic amastigotes as primary model for in vitro screening of antileishmanial compounds. Current Microbiology. 65 (6), 696-700 (2012).
  13. Nühs, A. Development and Validation of a Novel Leishmania donovani Screening Cascade for High-Throughput Screening Using a Novel Axenic Assay with High Predictivity of Leishmanicidal Intracellular Activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), 1-17 (2015).
  14. De Rycker, M. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
  15. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  16. Pescher, P., Blisnick, T., Bastin, P., Späth, G. F. Quantitative proteome profiling informs on phenotypic traits that adapt Leishmania donovani for axenic and intracellular proliferation. Cellular Microbiology. 13 (7), 978-991 (2011).
  17. Andrews, N. W., Hong, K. S. U., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Stage-specific surface antigens expressed during the morphogenesis of vertebrate forms of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 64 (3), 474-484 (1987).
  18. Pan, S. C. Trypanosoma cruzi: intracellular stages grown in a cell-free medium at 37 C. Experimental Parasitology. 45 (2), 215-224 (1978).
  19. Tomlinson, S., Vandekerckhove, F., Frevert, U., Nussenzweig, V. The induction of Trypanosoma cruzi trypomastigote to amastigote transformation by low pH. Parasitology. 110 (05), 547 (1995).
  20. Ley, V., Andrews, N. W., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Amastigotes of Trypanosoma cruzi sustain an infective cycle in mammalian cells. Journal of Experimental Medicine. 168 (0022-1007 (Print)), 649-659 (1988).
  21. Bonfim-Melo, A., Ferreira, E. R., Florentino, P. T. V., Mortara, R. A. Amastigote Synapse: The Tricks of Trypanosoma cruzi Extracellular Amastigotes. Frontiers in Microbiology. 9, 1341 (2018).
  22. Takagi, Y., Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K. Utilization of proliferable extracellular amastigotes for transient gene expression, drug sensitivity assay, and CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in Trypanosoma cruzi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 13 (1), e0007088 (2019).
  23. Fernandes, J. F., Castellani, O. Growth characteristics and chemical composition of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 18 (2), 195-202 (1966).
  24. Oberholzer, M., Lopez, M. A., Ralston, K. S., Hill, K. L. Approaches for Functional Analysis of Flagellar Proteins in African Trypanosomes. Methods in Cell Biology. 93, 21-57 (2009).
  25. van den Hoff, M. J. B., Moorman, A. F. M., Lamers, W. H. Electroporation in ‘intracellular’ buffer increases cell survival. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2902-2902 (1992).
  26. Pacheco-Lugo, L., Díaz-Olmos, Y., Sáenz-García, J., Probst, C. M., DaRocha, W. D. Effective gene delivery to Trypanosoma cruzi epimastigotes through nucleofection. Parasitology International. 66 (3), 236-239 (2017).
  27. Coughlin, B. C., Teixeira, S. M., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Amastin mRNA abundance in Trypanosoma cruzi is controlled by a 3’-untranslated region position-dependent cis-element and an untranslated region-binding protein. The Journal of Biological Chemistry. 275 (16), 12051-1260 (2000).
  28. Shaw, A. K., Kalem, M. C., Zimmer, S. L. Mitochondrial Gene Expression Is Responsive to Starvation Stress and Developmental Transition in Trypanosoma cruzi. mSphere. 1 (2), (2016).
  29. Chao, D., Dusanic, D. G. Comparative studies of the isolation of metacyclic trypomastigotes of Trypanosoma cruzi by DEAE ion exchange chromatography. Zhonghua Minguo wei sheng wu ji mian yi xue za zhi (Chinese Journal of Microbiology and Immunology). 17 (3), 146-152 (1984).
  30. Nogueira, N., Bianco, C., Cohn, Z. Studies on the selective lysis and purification of Trypanosoma cruzi. The Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 224-229 (1975).
  31. Minning, T. A., Weatherly, D. B., Atwood, J., Orlando, R., Tarleton, R. L., Tarleton, R. L. The steady-state transcriptome of the four major life-cycle stages of Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 10, 370 (2009).
  32. Rico, E., Jeacock, L., Kovářová, J., Horn, D. Inducible high-efficiency CRISPR-Cas9-targeted gene editing and precision base editing in African trypanosomes. Scientific Reports. 8 (1), 7960 (2018).
  33. Fu, Y. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
  34. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  35. Chiurillo, M. A., Lander, N., Bertolini, M. S., Storey, M., Vercesi, A. E., Docampo, R. Different roles of mitochondrial calcium uniporter complex subunits in growth and infectivity of Trypanosoma cruzi. mBio. 8 (3), e00574-e00617 (2017).

Tags

Genetica probleem 149 CRISPR/Cas9 genen knock-out stage-specifiek Trypanosoma cruzi Chagas ziekte kinetoplastid parasiet drug target Axenische cultuur amastigote
Introductie van een gen knock-out direct in het Amastigote stadium van <em>Trypanosoma cruzi</em> met behulp van het crispr/Cas9 systeem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K.,… More

Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K., Takagi, Y. Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (149), e59962, doi:10.3791/59962 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter