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Genetics

Presentazione di un Gene Knockout direttamente nello stadio Amastigote di Trypanosoma cruzi Utilizzando il sistema CRISPR/Cas9

Published: July 31, 2019 doi: 10.3791/59962
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)

Summary

Qui, descriviamo un protocollo per introdurre un knockout genico nell'amastigote extracellulare di Trypanosoma cruzi, usando il sistema CRISPR/Cas9. Il fenotipo della crescita può essere seguito sia dal conteggio cellulare della coltura degli amastigote axenico, sia dalla proliferazione degli amastigoti intracellulari dopo l'invasione delle cellule ospiti.

Abstract

Trypanosoma cruzi è un parassita protozoo patogeno che causa la malattia di Chagas principalmente in America Latina. Al fine di identificare un nuovo bersaglio farmacologico contro T. cruzi, è importante convalidare l'essenzialità del gene bersaglio nello stadio dei mammiferi del parassita, l'amastigote. Gli amastigoti di T. cruzi si replicano all'interno della cellula ospite; quindi, è difficile condurre un esperimento ad eliminazione diretta senza passare attraverso altre fasi di sviluppo. Recentemente, il nostro gruppo ha segnalato una condizione di crescita in cui l'amastigote può replicare axenically per un massimo di 10 giorni senza perdere le sue proprietà amastigote-like. Utilizzando questa coltura amastigote ascia temporale, abbiamo introdotto con successo i gRNA direttamente nell'amastigote che esprime Cas9 per causare eliminazioni genetiche e analizzato i loro fenotipi esclusivamente nella fase di amastigote. In questo rapporto, descriviamo un protocollo dettagliato per produrre amastigoti extracellulari derivati in vitro e per utilizzare la coltura ascia in un esperimento di knockout mediato da CRISPR/Cas9. Il fenotipo di crescita degli amastigoti knockout può essere valutato sia dai conteggi cellulari della coltura axenica, sia dalla replicazione dell'amastigote intracellulare dopo l'invasione delle cellule ospiti. Questo metodo bypassa la differenziazione dello stadio parassita normalmente coinvolto nella produzione di un amastigote transgenico o knockout. L'utilizzo della cultura amastigote ascia temporale ha il potenziale per espandere la libertà sperimentale di studi specifici dello stadio in T. cruzi.

Introduction

Trypanosoma cruzi è l'agente causale della malattia di Chagas, prevalente principalmente in America Latina1. T. cruzi ha fasi del ciclo di vita distintive mentre viaggia tra un vettore di insetti e un ospite di mammiferi2. T. cruzi si replica come un epimastigote nel midgut di un insetto di triatomina succhiasangue e si differenzia in una trypomastigote metaciclica infettiva nel suo intestino posteriore prima di essere depositato su un ospite umano o animale. Una volta che il trypomastigote entra nel corpo ospite attraverso il sito del morso o attraverso una membrana mucosa, il parassita invade una cellula ospite e si trasforma in una forma rotonda senza flagelli chiamata amastigote. L'amastigote si replica all'interno della cellula ospite e alla fine si differenzia in trypostigote, che esce dalla cellula ospite ed entra nel flusso sanguigno per infettare un'altra cellula ospite.

Dal momento che gli agenti chemioterapici attualmente disponibili, benznidazolo e nifurtimox, causano effetti collaterali negativi e sono inefficaci nella fase cronica della malattia3, è di grande interesse identificare nuovi bersagli farmacologici contro T. cruzi. Negli ultimi anni, il sistema CRISPR/Cas9 è diventato un potente strumento per eseguire efficacemente l'abbattimento genico in T. cruzi, sia per trasfezione di plasmide separate o singole contenenti gRNA e Cas94, con espressione stabile di Cas9 e successiva introduzione di gRNA5,6,7 o modello di trascrizione di gRNA8, o per elettroporazione del complesso gRNA/Cas9 RNP preformato7,9. Questo progresso tecnologico è molto previsto per accelerare la ricerca sul target farmacologico nella malattia di Chagas.

Per procedere con lo sviluppo del farmaco, è fondamentale convalidare l'essenzialità del gene bersaglio o l'efficacia dei composti candidati al farmaco nell'amastigote di T. cruzi, in quanto è la fase di replicazione del parassita nell'ospite dei mammiferi. Tuttavia, questo è un compito impegnativo, perché gli amastigoti non possono essere manipolati direttamente a causa della presenza di una cellula ospite ostruttiva. In Leishmania, un parassita protozoo strettamente imparentato con T. cruzi, è stato sviluppato un metodo di coltura amastigote axenico ed è stato utilizzato nei prelievi di farmaci10,11,12, 13.Sebbene vi siano alcune discrepanze nella suscettibilità ai composti tra amastigoti axenici e amastigoti intracellulari14, la capacità di mantenere comunque la cultura ascia fornisce preziosi strumenti sperimentali per studiare la biologia di base della fase clinicamente rilevante della Leishmania15,16. Nel caso di T. cruzi, le pubblicazioni riguardanti la presenza di amastigotes extracellulari naturali (EA)17 e la produzione in vitro di EA17,18,19 risalgono a decenni fa. Inoltre, EA è noto per avere una capacità infettiva20, anche se inferiore a quella di trypomastigote, e il meccanismo di invasione dell'ospite amastigote è stato chiarito negli ultimi anni (rivisto da Bonfim-Melo et al.21). Tuttavia, a differenza della Leishmania, EA non era stato utilizzato come strumento sperimentale in T. cruzi, soprattutto perché EA era stato considerato come un parassita intracellulare obbligato, e quindi non era stato considerato come "forma replicativa" in un pratico senso.

Recentemente, il nostro gruppo ha proposto di utilizzare EA di T. cruzi come cultura axenica temporale22. Gli amastigotes del ceppo T. cruzi Tulahuen possono replicarsi senza cellule ospiti nel mezzo LIT a 37 gradi centigradi per un massimo di 10 giorni senza un grave deterioramento o perdita di proprietà simili ad amastigote. Durante il periodo di crescita senza ospiti, EA è stata utilizzata con successo per l'espressione genica esogena mediante elettroporazione convenzionale, l'analisi della titolazione dei farmaci con composti tributo e il knockout mediato da CRISPR/Cas9 seguito dal monitoraggio del fenotipo della crescita. In questo rapporto, descriviamo il protocollo dettagliato per produrre EA derivato in vitro e per utilizzare l'amastigote ascia negli esperimenti con knockout.

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Protocol

NOT: Una panoramica dell'intero flusso sperimentale è illustrata nella Figura 1.

Figure 1
Figura 1: Panoramica dell'esperimento a eliminazione diretta tramite EA. I trypomastigoti derivati dalla coltura dei tessuti vengono raccolti e differenziati in EA. gRNA viene trafitto in amastigoti che esprimono Cas9 per elettroporazione, e il fenotipo di crescita dell'amastigote knockout viene valutato mediante la replica axenica o mediante la replica axenica replica intracellulare dopo l'invasione delle cellule ospiti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparati per la coltura dei parassiti

  1. Il ceppo Tulahuen di Trypanosoma cruzi viene utilizzato in tutto questo rapporto. Mantenere gli epimastigoti di T. cruzi in Media LIT (10% FCS, vedi tabella supplementare 1). Chiudere in modo sicuro il tappo e mantenere la fiaschetta di coltura a 28 gradi centigradi.
  2. Generare un ceppo transgenico di T. cruzi che ospita l'endonucleasi Cas9. Esempi di espressione plasmidi che contengono sequenza di codifica Cas9 e G418 (neor) marcatore di selezione possono essere trovati in Lander et al.4 e Peng et al.5
    1. Trasfecare il plasmide di cui sopra in epimastigote per elettroporazione, utilizzando il kit elencato nella Tabella dei Materiali. Per 1 cuvette, girare verso il basso 2 x 107 celle, scartare il supernatante e risospendere con 100 l di buffer di elettroporazione contenente la soluzione di supplemento fornita.
      NOT: Il buffer di elettroporazione può essere sostituito con il buffer EM24 (3:1 miscela di cytomix25 e buffer fosfato-sucrosi).
    2. Aggiungete 20-40 g di plasmide e trasferite la miscela in una cuvette di elettroporazione gap di 2 mm. Applicare l'impulso con un dispositivo di elettroporazione (vedere Tabella dei materiali), utilizzando il programma X-1426.
    3. Trasferire il contenuto della cuvette in un pallone T-25 contenente 5 mL di supporto LIT (10% FCS). Incubare il pallone a 28 gradi centigradi per 24 h.
    4. Aggiungete il G418 ad una concentrazione finale di 250 g/mL e continuate l'incubazione a 28 gradi centigradi. Ci vuole circa 1 settimana per uccidere gli epimastigoti non trasfettati. Una volta che la popolazione resistente al G418 inizia a riprendersi, passare la coltura una o due volte alla settimana per evitare la saturazione e diluire le cellule morte. La creazione di una linea cellulare stabile di solito richiede un totale di 4 settimane.
      NOT: Se l'espressione costituiscitiva di Cas9 è un onere per la cellula5, rendere l'espressione specifica per lo stadio amastigote coniugando il 3'-UTR del gene amastin immediatamente a valle del telaio di lettura aperto Cas927. La descrizione dettagliata del plasmide dell'espressione Cas9 specifica dell'amastigote si trova in Takagi et al.
  3. Stabilire una co-coltura ospite-parassita di Cellule ospiti T. cruzi e mammiferi che esprimono Cas9. In questo rapporto, utilizzare la cellula fibroblasta 3T3-Svizzera di Albino come ospite.
    1. Differenziare T. cruzi epimastigotes in metaciclici trypostigotes. Determinare la densità cellulare della coltura dell'epimastigote utilizzando un emocitometro e raccogliere 5 x 107 cellule mediante centrifugazione per 15 min a 2.100 x g. Eliminare il supernatante e risospendere nuovamente le cellule con 10 mL di mezzo RPMI. Incubare il parassita a 28 gradi centigradi per 1 settimana28.
    2. Raccogli le metamastigote metacicliche nel mezzo RPMI. Inclinare con attenzione il pallone e pipet fuori la soluzione senza disturbare i parassiti aderitati alla superficie inferiore. Trasferire il mezzo in un tubo conico e centrifugare per 15 min a 2.100 x g. Eliminare il supernatante e risospendere nuovamente il parassita con 5 mL di DMEM (10% FCS).
      NOT: La popolazione di parassiti è una miscela di trypomastigotes metacicliche, epimastigotes e alcune forme intermedie. Anche se non è necessario, è possibile isolare trypostigote da DEAE ion exchange cromatografia29. In alternativa, gli epimastigoti possono essere eliminati incubando i parassiti con siero attivo per sottoporli a completare la lisi30.
    3. Seme 3T3-Svizzera fibroblasto Albino a 60-70% di confluenza, o circa 1.7-2.0 x 106 cellule in 5 mL di DMEM (10% FCS) in flacone di coltura T-25. Rimuovere il mezzo di crescita e applicare la miscela di parassiti dal passo 1.3.2. Incubare per 24 h a 37 gradi sotto il 5% di CO2 in un'incubatrice umidificata per stabilire l'infezione.
    4. Rimuovere i parassiti che rimangono al di fuori delle cellule 3T3 dell'ospite lavando la co-coltura con DMEM (10% FCS) due volte.
    5. Una volta che la co-cultura è satura, passaggio cellule ospiti infettati da amastigote da trypsinization. Aspirare il mezzo e risciacquare la cultura una volta con PBS. Applicare 1 mL di 0,05% soluzione di prova per coprire l'intera superficie di coltura e incubare per alcuni minuti a temperatura ambiente fino a quando le cellule ospiti collegate non si allentano. Scollegare le celle dalla superficie del pallone conungere 3 mL di DMEM (10% FCS) sulle celle.
    6. Trasferire le cellule ospiti staccate in un tubo conico e centrifugare per 3 min a 300 x g. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule con 3 mL di DMEM fresco (10% FCS). Questo passaggio aiuta ad eliminare gli epimastigoti rimanenti. Trasferire tutto in un flacone T-75 pulito contenente 9 mL di DMEM (10% FCS). Continuare a coltivare fino a quando trypomastigote viene rilasciato in cultura supernatant.
    7. Mantenere la co-cultura passando con la prova due volte a settimana. Una volta che il 70-80% della popolazione ospite si infetta, aggiungere regolarmente cellule host 3T3 non infette al rapporto di 5:1 (carryover:fresh), al fine di evitare il deterioramento della coltura. Trypostigote scappa continuamente se l'equilibrio tra le cellule ospiti e T. cruzi è correttamente mantenuto.

2. Differenziazione dei Trypomastigotes in EA

  1. Il giorno prima di questo esperimento, rimuovi il mezzo di crescita della cocoltura ospite-parassita e aggiungi dMEM fresco (10% FCS) per lavare via EA e trypomastigotes che erano già stati rilasciati dalle cellule ospiti nei giorni precedenti. Esperimenti regolari richiedono almeno due flaconi T-75 di co-cultura confluente.
  2. Raccogliere la coltura supernatant in un tubo conico per raccogliere trypostigotes appena emersi. Controllare il campione al microscopio (10x o 20x obiettivo obiettivo) per la qualità. Se ci sono detriti cellulari ospiti, centrifugare brevemente il campione e trasferire il supernatante in un nuovo tubo. Se c'è un numero significativo di EA, isolare trypomastigotes con la seguente procedura di swim-out.
    1. Girare verso il basso la miscela di trypostigotes e amastigotes per 15 min a 2.100 x g. Eliminare la maggior parte del supernatante, lasciando 0,5-1,0 mL di mezzo nel tubo.
      NOTA: la riduzione del volume è facoltativa, ma semplifica il passaggio seguente.
    2. Incubare il pellet a 37 gradi centigradi per 1-2 h, permettendo ai trypostigoti attivi di nuotare fuori dal pellet (Figura 2).
    3. Trasferire il supernatante contenente trypomastigotes in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL.
  3. Centrifugare il tubo conico per 15 min a 2.100 x g per raccogliere trypomastigotes. Se la procedura di nuoto è stata eseguita sopra, centrifugare il tubo da 1,5 mL per 2 min a 4.000 x g per pellet il trypomastigote. Scartare il super-attardato.
  4. Risospendere il pellet con 5 mL di DMEM memorizzato nel buffer con 20 mM MES (pH 5.0), integrato con lo 0,4% BSA19. Trasferire il parassita in una fiaschetta di coltura T-25. Lascia il tappo allentato. La densità cellulare deve essere pari o inferiore a 1 x 107 cellule/mL, poiché la sovrasaturazione aumenta la probabilità di morte cellulare.
    NOT: Il colore del DMEM deve essere giallo, non arancione. Se il DMEM originale aveva un'elevata capacità di buffering, 20 mM MES (pH 5.0) non sono sufficienti per abbassare il pH. Il pH del mezzo deve essere regolato mediante l'aggiunta di HCl in questo caso. Il mezzo acido può essere mantenuto a 4 gradi centigradi, ma non più di 1 mese.
  5. Incubare il flacone di coltura a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2 in un'incubatrice umidificata. Circa il 95% dei parassiti si differenzia in amastigoti dopo 24 ore.

3. Elettroporazione di EA

  1. Preparare il gRNA per l'elettroporazione. Questo può essere fatto con la trascrizione in vitro, o semplicemente acquistando oligonucleotidi RNA sintetici da un produttore. In questo rapporto, vengono utilizzati crRNA e tracrRNA da Integrated DNA Technologies, Inc.
  2. Centrifugare la cultura di EAs per 15 min a 2.100 x g. Scartare supernatante.
  3. Risospendere il pellet con buffer di elettroporazione contenente la soluzione di supplemento fornita alla densità cellulare finale di 1 x 108 celle/mL.
    NOTA: il buffer EM causa più decessi cellulari rispetto al buffer di elettroporazione elencato nella tabella dei materiali; pertanto, non è raccomandato per la trasfezione amastigote ( Figura supplementare1).
  4. Aliquota 100 - L di parassiti risospesi (1 x 107 cellule) in tubi di microcentrifuga da 1,5 ml. Aggiungere 5-10 g di gRNA e mescolare delicatamente pipettando.
  5. Trasferire la miscela in una cuvette di elettroporazione gap di 2 mm. Applicare l'impulso con il dispositivo di elettroporazione, utilizzando il programma X-14.
  6. Trasferire il contenuto della cuvette in un flacone T-25 contenente 5 mL di mezzo LIT preriscaldato (10% FCS). Lasciare il tappo allentato e incubare il pallone a 37 gradi sotto il 5% di CO2.
  7. Monitorare la crescita cellulare mediante la continuazione della coltura axenica (sezione 4) o come amastigotes intracellulari dopo l'infezione delle cellule ospiti (sezione 5).

4. Monitoraggio della crescita delle cellule Knockout come Amastigotes axenic

  1. EAs stabilirsi nella parte inferiore del mezzo di coltura, in modo da scuotere delicatamente il pallone per rinvigorire nella soluzione. Lavare la superficie del pallone con la pipimernatura aiuta, poiché alcune cellule vengono aderite al pallone.
  2. Mescolare 1 - L di propidio iodide (PI) soluzione (20 g/mL) con 20 l di coltura amastigote.
    NOT: Non lasciare il flacone di coltura al di fuori dell'incubatrice più a lungo del necessario. La temperatura è uno dei fattori che consente la proliferazione ascia22.
  3. Applicare il campione sull'emocitometro e osservarlo al microscopio a fluorescenza. PI è permeant e la membrana cellulare danneggiata, ma è escluso dalle cellule vive. Contare il numero di amastigoti vitali che non sono macchiati da PI (ex/em 570 nm/602 nm).

5. Monitoraggio della crescita delle cellule knockout come Amastigotes intracellulari

  1. I semi ospitano celle 3T3 in una piastra da 12 pozzetti con DMEM (10% FCS). Regolare la densità cellulare al 70-80% di confluenza, o circa 3 x 105 celle per bene.
    NOT: Poiché gli amastigoti non sono motili, coprire la maggior parte della superficie di crescita da parte delle cellule ospiti migliora l'efficienza dell'infezione.
  2. Raccogliere gli amastigoti knockout dal passo 3.6 per centrifugazione un giorno dopo l'elettroporazione. Eliminare il supernatante e risospendere il parassita con 2 mL di DMEM (10% FCS).
  3. Rimuovere il supporto dalla coltura della cellula ospite e applicare gli amastigoti risospesi. La molteplicità dell'infezione deve essere pari o superiore a 20. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2 per 2 giorni per consentire agli amastigoti di stabilire l'infezione.
    NOT: Il periodo di infezione può essere di 1 giorno, a seconda dello scopo.
  4. Lavare via EA è rimasto al di fuori delle celle ospiti due volte con DMEM (10% FCS).
  5. Aggiungere dMEM fresco (10% FCS) alla co-coltura ospite-parassita e continuare l'incubazione a 37 gradi centigradi per ulteriori 2 giorni.
  6. Per valutare l'efficienza dell'infezione, visualizzare i nuclei delle cellule ospiti e l'amastigote intracellulare.
    NOTA:     i nuclei tendono ad essere sovrapposti alla cocultura satura. Ri-placcatura delle cellule a densità cellulare inferiore (come diluizione 1:5) prima della fissazione e colorazione aiuta a contare i nuclei più facilmente.
    1. Rimuovere il mezzo di coltura e applicare 1 mL di 10% soluzione formalina in PBS per fissare le cellule. Incubare per 10 min a temperatura ambiente.
    2. Sostituire la soluzione di formalina con 1 mL di PBS contenente 1 G/mL Hoechst 33342 e 0,1% Triton X-100. Incubare per 5 min a temperatura ambiente.
    3. Rimuovere la soluzione Hoechst e risciacquare le cellule una volta con PBS. Aggiungere 1 mL di PBS fresco.
  7. Osservare al microscopio a fluorescenza e identificare i nuclei delle cellule ospiti associati a nuclei parassiti più piccoli (Figura 4). Le cellule ospiti che contengono più di 2 amastigotes devono essere considerate infette, per non includere infezioni iniziali non produttive o EA non lavate.

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Representative Results

Isolamento dei trypostigotes con la procedura di swim-out

Per raccogliere nuove prove da contaminanti vecchi EA con procedura di nuoto fuori, pellet cellulari devono essere incubati almeno per 1 h. Incubare i pellet per più di 2 h non aumenta significativamente il numero di trypostigotes nuotare nella soluzione ( Figura 2B). In questo particolare esperimento, la percentuale di trypomastigote nella miscela iniziale era del 38% e la percentuale dopo il swim-out era superiore al 98% in un dato momento. Da due flaconi T-75 di co-cultura confluente, otteniamo regolarmente 3-4 x 107 cellule di puro trypostigote da questo protocollo di swim-out.

Monitoraggio della crescita di amastigote knockout come coltura axenica

A differenza di altri stadi di sviluppo di T. cruzi, gli amastigoti senza flagelli sono praticamente statici. Così, colorazione con PI aiuta a distinguere gli amastigotes vivi da quelli morti. PI è impermeabile alla membrana cellulare intatta, ma penetra facilmente le cellule morte (Figura 3A). Gli amastigoti trasfettati da gRNA contro il gene essenziale, TcCGM1 (TcCLB.511807.80), hanno mostrato un significativo difetto di crescita rispetto al gruppo di controllo che ha ricevuto gRNA non omologato al genoma di T. cruzi (Figura 3B).

Monitoraggio della crescita dei parassiti knockout come amastigoti intracellulari

L'essenzialità del gene bersaglio nella fase amastigote può anche essere dimostrata dalla valutazione del fenotipo di crescita di Knockout T. cruzi come amastigote intracellulare (Figura 4). La frazione dei nuclei ospiti associati a nuclei T. cruzi più piccoli era significativamente più bassa nel gruppo TcCGM1-KO rispetto al gruppo di controllo.

L'eliminazione di un gene specifico per fase causa una differenza fenotipica negli stadi di amastigote e trypomastigote

Il componente dell'asta del paracadutante PAR1 è altamente espresso nello stadio trypomastigote, ma è downregolato nella fase amastigote di T. cruzi22,31. Infatti, la trasfezione di gRNA contro TcPAR1 (TcCLB.506755.20) non ha influenzato in modo significativo la crescita di EA dopo 4 giorni di culturazione axenica (Figura 5B). la traflessione gRNA seguita dall'invasione delle cellule ospiti ha anche mostrato che TcPAR1-KO non inibisce la crescita di amastigoti intracellulari, in termini di frazione di cellule ospiti infette a 4 giorni dopo l'infezione (Figura 5C). Il numero di parassiti all'interno della singola cellula ospite non sembra essere influenzato dal knockout, né (Figura supplementare 2). Questi risultati indicano che TcPAR1 non è essenziale nella fase amastigote di T. cruzi.

Tuttavia, il numero di trypostigotes è emerso dalle cellule ospiti a 5 giorni dopo l'infezione è stato significativamente inferiore nella co-coltura TcPAR1-KO, rispetto alla co-cultura dei controlli (Figura 5D). Inoltre, trypomastigotes differenziati all'interno della cella 3T3 dell'host prima dell'uscita sembravano essere molto attivi nel gruppo di controllo (Supplemental Movie 1), ma sembravano lenti nel gruppo TcPAR1-KO (Supplemental Movies 2). Questi risultati suggeriscono che TcPAR1 svolge un ruolo importante nella fase trypostigote di T. cruzi, presumibilmente fornendo motilità per aiutare l'egressione, nonostante la sua non essenzialità nella fase amastigote.

Figure 2
Figura 2: Isolamento del trypomastigote mediante procedura di swim-out. (A) Rappresentazione schematica del protocollo. Rosso: presenza di trypostigote. (B) Il numero di trypomastigotes che hanno nuotato fuori dal pellet ai punti temporali indicati. I pellet iniziali contenevano un totale di 3 x 107 parassiti, il 38% dei quali erano trypostigotes e il resto dei quali erano amastigoti. Gli esperimenti sono stati effettuati in triplice copia e i valori medi (SD) sono tracciati. La purezza dei trypostigotes in soluzione era superiore al 98% in un dato momento. (C) Le immagini microscopiche dei parassiti prima della procedura di nuoto (a sinistra), i provareastigoti che hanno nuotato da un pellet (al centro) e parassiti rimasti in un pellet (a destra) dopo 1 h di incubazione. Barre di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Monitoraggio della crescita dell'amastigote ascia. (A) Saggio di esclusione del propidium iodide (PI). Foto microscopiche di EA su un emocitometro in campo luminoso (a sinistra), canale di fluorescenza (al centro) e immagine sovrapposta (a destra). Le frecce gialle indicano cellule morte macchiate di PIPI. Barre di scala - 20 m. (B) Numero di cellule di amastigote sbarrate che esprimono Cas9 dopo la trasfezione con gRNA contro TcCGM1 (cerchio aperto) e gRNA di controllo senza omologia al genoma di T. cruzi (cerchio chiuso). Le elettroporazioni sono state eseguite in triplicati e i valori medi (SD) sono tracciati. (p < 0,01 del test t di Welch). Questa cifra è stata modificata da Takagi et al.22Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Crescita degli amastigoti knockout dopo l'invasione dell'ospite. (A) Colorazione nucleare della cocoltura ospite-parassita dopo la replica intracellulare di amastigotes trafettati da gRNA contro TCGM1 e gRNA di controllo. Gli EA trasaffetti da gRNA sono stati applicati su 3T3 cellule 1 giorno dopo l'elettroporazione e hanno permesso di infettare le cellule ospiti per 2 giorni. Gli amastigoti che rimangono al di fuori delle cellule ospiti sono stati lavati via, e la cocoltura ospite-parassita è stata incubata per altri 2 giorni. Barre della scala: 20 m. Questa cifra è stata modificata da Takagi et al.22 (B) Percentuale di cellule 3T3 ospiti infettate da amastigotes di controllo (barra nera) e TcCGM1-KO amastigotes (barra grigia). La media di tre esperimenti di infezione è tracciata (sezione p < 0,01, test t di Welch). Questa cifra è stata modificata da Takagi et al.22Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Differenza fenotipica tra amastigote knockout e trypomastigote differenziata. (A) Rappresentazione schematica della linea temporale sperimentale. (B) Conta di amastigote axenic a 4 giorni dopo la trasfezione per amastigotes di controllo (barra nera) e TcPAR1-KO amastigotes (barra grigia). I valori medi di tre esperimenti di elettroporazione sono tracciati (n.s.: non significativo, test Mann-Whitney U). (C) Percentuale di cellule 3T3 ospiti infette a 4 giorni dopo l'infezione da amastigote di controllo (barra nera) e TcPAR1-KO amastigote (barra grigia). Vengono tracciati i valori medi di tre pozzi di coltura (n.s.: non significativo, test Mann-Whitney U). (D) Numero di trypomastigote rilasciati nel mezzo culturale a 5 giorni dopo l'infezione per la cocultura del controllo (barra nera) e TcPAR1-KO co-cultura (barra grigia). I valori medi di tre pozze l'iva vengono tracciati (test di Mann-Whitney U). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1: Composizione del supporto LIT. Il supporto LIT è stato preparato secondo ATCC 1029, fatta eccezione per la quantità di fosfato di idrogeno disondio. Fare clic qui per scaricare la tabella.

Figura supplementare 1: Effetto del buffer di elettroporazione sulla vitalità delle cellule amastigote. EA è stato elettroporate nel buffer di elettroporazione o nel buffer EM. Amastigote è stato macchiato di PI dopo 24 h per contare il numero di amastigotes vivi e morti. Le percentuali di cellule morte in ogni gruppo e nel gruppo di impulsi no vengono tracciate. Viene mostrata la media di tre esperimenti di elettroporazione (p < 0,05, n.s.: non significativo, test Kruskal-Wallis). Clicca qui per scaricare la figura.

Supplemento Figura 2: Immagini microscopiche di TcPAR1-KO macchiate di nucleare e controllo degli amastigoti intracellulari. La co-cultura delle cellule 3T3 ospiti e degli amastigoti trafetti è stata fissata e macchiata a 4 giorni dopo l'infezione. Barre della scala: 20 m. Fare clic qui per scaricare la figura.

Figura supplementare 3: Fenotipo della crescita dell'epimastigote che esprime Cas9. I conteggi cellulari degli epimastigotes (WT) di tipo selvatico, degli epimastigote che constitutivemente esprimeno Cas9-EGFP (Cas9-EGFP) ed epimastigotes che esprime Cas9-EGFP secondo il regolamento di 3'-UTR (Cas9-EGFP-AmaUTR) specifici per amastigote sono tracciati nella scala dei tronchi. Gli epimastigoti sono stati coltivati nel mezzo LIT (10% FCS) a 28 . La densità delle cellule parassiche è stata regolata a 1 x 106 cellule/mL il giorno 0. I conteggi cumulativi delle cellule vengono calcolati come densità di cellule moltiplicata per il fattore di diluizione totale. Viene visualizzata la media dei tre flaconi di coltura (p<0,05, n.s.: non significativo, test Kruskal-Wallis). Clicca qui per scaricare la figura.

Filmato supplementare 1: immagine video di microscopia della co-cultura del controllo. Numero e attività dei trypomastigotes che si sono differenziati dagli amastigoti di controllo. Immagine video a 5 giorni dopo l'infezione è mostrato.  Clicca qui per scaricare il film.

Film supplementare 2: Fotodia microscopia della co-cultura TcPAR1-KO. Numero e attività dei trypomastigotes che si sono differenziati dagli amastigoti TcPAR1-KO. Immagine video a 5 giorni dopo l'infezione è mostrato. Clicca qui per scaricare il film.

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Discussion

Abbiamo dimostrato che la cultura ascia di T. cruzi amastigotes può essere utilizzata nel knockout genico mediato da CRISPR/Cas9, elettropolando gRNA direttamente nell'EA che esprime Cas9. In questo modo, l'essenzialità del gene bersaglio specificamente nella fase amastigote può essere valutata senza passare attraverso altre fasi di sviluppo.

Un altro aspetto benefico della trasfezione dell'amastigote è la convenienza nel test di un gran numero di geni bersaglio. Una volta stabilita la co-cultura di T. cruzi e cellule dei mammiferi ospiti, ci vogliono solo pochi giorni per trasformare i trypomastigotes derivati dai tessuti in EA e gRNA transfetale per ottenere amastigoti knockout. gRNA è l'unico materiale che deve essere adattato a ciascun gene bersaglio, ma il gRNA sintetico è disponibile presso il numero di produttori, quindi può essere semplicemente acquistato. Un metodo alternativo per analizzare l'essenzialità specifica dello stadio dei geni bersaglio sarebbe quello di stabilire un sistema di knockout inducibile32 . In tal caso, i plasmidi devono essere costruiti per ogni gene bersaglio e trasfigurati dal parassita nella fase epimastigote per consentire la selezione dei farmaci dei transfetti, poiché l'efficienza della transfezione del plasmide è molto inferiore a quella del gRNA (<15% per il plasmide 26 come dovrebbe >96% per gRNA22). I transfettienti selezionati devono essere differenziati in metapomastigoti metaciclici per infettare le cellule ospiti per indurre infine un knockout nell'amastigote intracellulare. L'intero processo richiederebbe 1-2 mesi.

In questo rapporto, abbiamo usato PI per distinguere le cellule morte nella coltura degli amastigote aspetici per quantificare la densità cellulare con un emocitometro. In alternativa, è possibile utilizzare saggi metabolici come l'analisi della resazurina per stimare il numero di amastigoti vivi, che è più adatto per un formato ad alta produttività. Nelle nostre mani, 1 x 105 amastigotes per pozzo producono sufficiente attività redox per essere rilevato da un saggio di resazurin dopo 5 h di incubazione.

Uno svantaggio di stabilire una linea cellulare che esprime Cas9 è il potenziale carico cellulare e scissione non specifica a causa della sovraespressione Cas95,33. Ci sono diversi rapporti che indicano che l'espressione coniugale di Cas9 non ha alcun effetto sul tasso di crescita di T. cruzi4,6,7,8. Tuttavia, in un caso5 e anche nelle nostre mani, il parassita che esprime Cas9 ha mostrato una crescita lenta rispetto al tipo selvatico. Per superare questo problema, abbiamo impiegato l'amastigote-specific 3'-UTR per limitare l'espressione di Cas9 alla fase22di amastigote . La coniugazione dell'amastina 3'-UTR al telaio di lettura aperto Cas9 ha ripristinato il tasso di replica del parassita transgenico ( Figura supplementare3), producendo così una robusta co-cultura ospite-parasita per fornire continuamente trypomastigotes per in vitro l'amastigogenesi. Recentemente, altri gruppi hanno dimostrato che l'introduzione del complesso gRNA/Cas9 RNP al parassita selvatico può causare l'editing del genoma in T. cruzi7,9. Questo metodo dovrebbe essere esplorato come un approccio meno stressante al parassita9, poiché lo studio nelle cellule dei mammiferi suggerisce che l'uso di RNP riduce l'editing indesiderato del genoma fuori target, a causa della breve emivita della proteina Cas934.

Un'altra modifica facoltativa al protocollo sarebbe la co-trasfezione del DNA del donatore come modello per la ricombinazione omologa. È stato riferito che il DNA del donatore contenente sequenze omologhe a monte e a valle del sito di scissione, sotto forma di DNA a doppio filamento4,5,8,35 o a filamento singolo oligonucleotide7,9, facilita il processo di riparazione della rottura a doppio filamento causata dalla nucleale di Cas9. Sebbene alcuni rapporti indichino che l'unione finale mediata da microhomologia senza modello di donatore può riparare la scissione e introdurre una mutazione di delezione5, l'introduzione della sequenza definita nel sito di mutazione aiuta comunque a confermare successo dell'editing del genoma, perché è difficile mostrare l'evidenza del DNA del knockout genico in alcuni casi, anche se la riduzione della proteina bersaglio e l'esito fenotipica suggeriscono che il gene bersaglio è stato mutato4.

La trafezione e la co-trasfezione Cas9/gRNA RNP di un DNA del donatore non sono dimostrate in questa relazione per semplificare la descrizione del protocollo e concentrarsi sulla preparazione dell'EA e sull'uso della coltura ascia in seguito. Se si desidera eseguire tali esperimenti, può essere fatto semplicemente sostituendo i componenti dell'elettroporazione.

Il nostro metodo di utilizzo di EA di T. cruzi come strumento sperimentale consente potenzialmente una varietà di studi specifici dello stadio, tra cui l'espressione genica transitoria per trasfezione plasmida e test di efficacia farmacologica22. Tuttavia, l'efficacia di questo approccio è stata testata solo nel ceppo Tulahuen finora. Poiché i ceppi di T. cruzi sono abbastanza diversi, l'applicabilità di questo protocollo ad altri ceppi deve essere studiata.

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Disclosures

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da divulgare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato in parte da JSPS KAKENHI Grant numero 18K15141 a Y.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20% formalin solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 068-03863 fixing cells
25 cm2 double seal cap culture flask AGC Techno Glass 3100-025
75 cm2 double seal cap culture flask AGC Techno Glass 3110-075
All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X710
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for Control) IDT custom made target sequence = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcCGM1) IDT custom made target sequence = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcPAR1) IDT custom made target sequence = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA IDT 1072532 to anneal with crRNA
Amaxa Nucleofector device LONZA AAN-1001 electroporation
Basic Parasite Nucleofector Kit 2 LONZA VMI-1021 electroporation
BSA Sigma-Aldrich A3294 component of the medium for in vitro amastigogenesis
Burker-Turk disposable hemocytometer Watson 177-212C cell counting
Coster 12-well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3513
DMEM FUJIFILM Wako Pure Chemical 044-29765 culture medium
Fetal bovine serum, Defined Hyclone SH30070.03 heat-inactivate before use
G-418 Sulfate Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 077-06433 selection of transformant
Hemin chloride Sigma-Aldrich H-5533 component of LIT medium
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570 staining of nuclei
Liver infusion broth, Difco Becton Dickinson 226920 component of LIT medium
MES FUJIFILM Wako Pure Chemical 349-01623 component of the medium for in vitro amastigogenesis
PBS (–) FUJIFILM Wako Pure Chemical 166-23555
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4864-10ML staining of dead cells
RPMI 1646 Sigma-Aldrich R8758 medium for metacyclogenesis

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References

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Genetica Numero 149 CRISPR/Cas9 gene knockout stage-specific Trypanosoma cruzi Malattia di Chagas parassita kinetoplastid bersaglio di droga coltura axenica amastigote
Presentazione di un Gene Knockout direttamente nello stadio Amastigote di <em>Trypanosoma cruzi</em> Utilizzando il sistema CRISPR/Cas9
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Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K.,… More

Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K., Takagi, Y. Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (149), e59962, doi:10.3791/59962 (2019).

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