Summary
Aquí, describimos un protocolo para introducir un knockout genético en el amastigote extracelular de Trypanosoma cruzi, utilizando el sistema CRISPR/Cas9. El fenotipo de crecimiento puede ser seguido ya sea por el recuento celular de la cultura axenic amastigote o por la proliferación de amastigotes intracelulares después de la invasión de la célula huésped.
Abstract
El trypanosoma cruzi es un parásito protozoario patógeno que causa la enfermedad de Chagas principalmente en América Latina. Con el fin de identificar un nuevo objetivo farmacológico contra T. cruzi, es importante validar la esencialidad del gen diana en la etapa de mamíferos del parásito, el amastigote. Amastigotes de T. cruzi se replican dentro de la célula anfitriona; por lo tanto, es difícil llevar a cabo un experimento eliminatorio sin pasar por otras etapas del desarrollo. Recientemente, nuestro grupo informó de una condición de crecimiento en la que el amastigote puede replicar axenéticamente hasta 10 días sin perder sus propiedades similares a amastigote. Mediante el uso de este cultivo axenic amastigote temporal, introdujimos con éxito gRNAs directamente en el amastigote expreso de Cas9 para causar nocauts genéticos y analizar sus fenotipos exclusivamente en la etapa de amastigote. En este informe, describimos un protocolo detallado para producir acomodatigotes extracelulares derivados in vitro, y para utilizar el cultivo axenético en un experimento de nocaut mediado por CRISPR/Cas9. El fenotipo de crecimiento de los amastigotes knockout puede ser evaluado ya sea por recuento saldeo celular del cultivo axenico, o por la replicación del amastigote intracelular después de la invasión de la célula huésped. Este método evita la diferenciación de la etapa del parásito normalmente implicada en la producción de un atigote transgénico o de nocaut. La utilización de la cultura axenic amastigote temporal tiene el potencial de ampliar la libertad experimental de estudios específicos de etapa en T. cruzi.
Introduction
El trypanosoma cruzi es el agente causante de la enfermedad de Chagas, que es frecuente principalmente en América Latina1. T. cruzi tiene etapas distintivas del ciclo de vida,ya que viaja entre un vector de insectos y un huésped de mamíferos 2. T. cruzi se replica como un epimastigote en el intestino medio de un insecto triatomina chupa sangre y se diferencia en un trippomastigono metacíclico infeccioso en su intestino posterior antes de ser depositado en un huésped humano o animal. Una vez que el trippomastigoto entra en el cuerpo del huésped a través del sitio de la picadura o a través de una membrana mucosa, el parásito invade una célula huésped y se transforma en una forma redonda sin flagelado llamada acomodatigote. El amastigote se replica dentro de la célula huésped y finalmente se diferencia en trippomastigote, que sale de la célula huésped y entra en el torrente sanguíneo para infectar a otra célula huésped.
Dado que actualmente se dispone de agentes quimioterápicos, benznazol y nifurtimox, causan efectos secundarios adversos y son ineficaces en la fase crónica de la enfermedad3,es de gran interés identificar nuevos objetivos farmacológicos contra T. cruzi. En los últimos años, el sistema CRISPR/Cas9 se ha convertido en una poderosa herramienta para realizar eficazmente el knockout genético en T. cruzi,ya sea transfectando plásmidos separados o individuales que contengan gRNA y Cas9 4, mediante la expresión estable de Cas9 y posteriores introducción de gRNA5,6,7 o plantilla de transcripción de gRNA8, o por electroporación del complejo preformado gRNA/Cas9 RNP7,9. Se prevé que este avance tecnológico acelere la investigación del objetivo de fármacos en la enfermedad de Chagas.
Para proceder con el desarrollo del fármaco, es crucial validar la esencialidad del gen objetivo o la eficacia de los compuestos candidatos a fármacos en el amastigote de T. cruzi,ya que es la etapa de replicación del parásito en el huésped de mamíferos. Sin embargo, esta es una tarea difícil, porque los amastigotes no se pueden manipular directamente debido a la presencia de una célula huésped obstructiva. En Leishmania, un parásito protozoario estrechamente relacionado con T. cruzi, se desarrolló un método de cultivo axenic amastigote y se ha utilizado en ensayos de detección de drogas10,11,12, 13. Aunque hay algunas discrepancias en la susceptibilidad a los compuestos entre axenic amastigotes y amastigotes intracelulares14, la capacidad de mantener la cultura axenica, sin embargo, proporciona valiosas herramientas experimentales para estudiar el biología básica de la etapa clínicamente relevante de Leishmania15,16. En el caso de T. cruzi, las literaturas sobre la presencia de aamastítas extracelulares (EA)17 de origen natural y la producción in vitro de EA17,18,19 se remontan a hace décadas. Además, EA es conocido por tener una capacidad infecciosa20, aunque menor que la de trypomastigote, y el mecanismo de invasión de host amastigote se ha aclarado en los últimos años (revisado por Bonfim-Melo et al.21). Sin embargo, a diferencia de Leishmania, EA no había sido utilizado como una herramienta experimental en T. cruzi, principalmente porque EA había sido considerado como un parásito intracelular obligado, y por lo tanto no había sido considerado como "forma replicativa" en una práctica Sentido.
Recientemente, nuestro grupo propuso utilizar EA de T. cruzi como una cultura axenica temporal22. Los acomodatos de la cepa T. cruzi Tulahuen pueden replicarse libres de células huésped en medio LIT a 37 oC durante un máximo de 10 días sin deterioro importante o pérdida de propiedades similares a amastigote. Durante el período de crecimiento sin anfitrión, EA fue utilizado con éxito para la expresión génica exógena por electroporación convencional, ensayo de valoración de fármacos con compuestos trippanocidas, y eliminación mediada por CRISPR/Cas9 seguido de monitoreo de fenotipo de crecimiento. En este informe, describimos el protocolo detallado para producir EA derivado in vitro y para utilizar el axenic amastigote en experimentos eliminatorios.
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Protocol
NOTA: En la Figura 1se muestra una descripción general de todo el flujo experimental.
Figura 1: Descripción general del experimento knockout con EA. Los trippomastigotes derivados del cultivo de tejidos se cosechan y se diferencian en EA. gRNA se transfectó en acomodatos expresos cas9 por electroporación, y el fenotipo de crecimiento del amastigote de nocaut se evalúa ya sea por replicación axenica o por replicación axenica o por replicación axenica o por replicación axenica o por replicación axenica o por replicación axenica o por replicación axenica o por replicación axenica o por replicación axenica o por replicación axenica o por replicación axenica o por replicación axenica o por replicación axenica o por replicación axenica o por replicación axenica o por replicación axenica o por replicación ax replicación intracelular después de la invasión de la célula del huésped. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. Preparaciones de la cultura del parásito
- Cepa Tulahuen de Trypanosoma cruzi se utiliza a lo largo de este informe. Mantener los emastigotes de T. cruzi en medio LIT (10% FCS, ver Tabla Suplementaria 1). Cierre firmemente la tapa y mantenga el matraz de cultivo a 28 oC.
- Generar una cepa transgénica de T. cruzi que alberga la endonucleasa Cas9. Ejemplos de los plásmidos de expresión que contienen la secuencia de codificación Cas9 y el marcador de selección G418 (neor) se pueden encontrar en Lander et al.4 y Peng et al.5
- Transfectar el plásmido anterior en epimastigote por electroporación, utilizando el kit listado en la Tabla de Materiales. Para 1 cubeta, gire hacia abajo 2 x 107 células, deseche el sobrenadante, y resuspenda con 100 l de tampón de electroporación que contiene la solución de suplemento proporcionada.
NOTA: El tampón de electroporación se puede sustituir por el tampón EM24 (3:1 mezcla de citomix25 y tampón fosfato-sucrose). - Añadir 20-40 g de plásmido y transferir la mezcla a una cubeta de electroporación de 2 mm. Aplicar el pulso con un dispositivo de electroporación (ver Tabla de Materiales), utilizando el programa X-1426.
- Transfiera el contenido de la cubeta a un matraz T-25 que contenga 5 ml de medio LIT (10% FCS). Incubar el matraz a 28oC durante 24 h.
- Añadir G418 a una concentración final de 250 g/ml y continuar la incubación a 28oC. Se tarda aproximadamente 1 semana en matar a los epimastigotes no transinfectados. Una vez que la población resistente al G418 comience a recuperarse, pasa el cultivo una o dos veces por semana para evitar la saturación y diluir las células muertas. El establecimiento de una línea celular estable suele tardar un total de 4 semanas.
NOTA: Si la expresión constitutiva de Cas9es una carga para la celda 5, haga que la expresión sea específica para la etapa de amastigote conjugando el gen 3'-UTR del gen de la amastina inmediatamente aguas abajo del marco de lectura abierto de Cas927. La descripción detallada del plásmido de expresión Cas9 específico de amastigote se puede encontrar en Takagi et al.22
- Transfectar el plásmido anterior en epimastigote por electroporación, utilizando el kit listado en la Tabla de Materiales. Para 1 cubeta, gire hacia abajo 2 x 107 células, deseche el sobrenadante, y resuspenda con 100 l de tampón de electroporación que contiene la solución de suplemento proporcionada.
- Establecer un cocultivo huésped-parásito de las células huésped de T. cruzi y mamíferos que expresan La Cas9. En este informe, utilice la célula fibroblasta albino 3T3-Suiza como huésped.
- Diferenciar los epimastigotes de T. cruzi en metacíclicos trypomastigotes. Determinar la densidad celular del cultivo de epimastigote utilizando un hemocitómetro y recoger 5 x 107 células por centrifugación durante 15 min a 2.100 x g. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células con 10 ml de medio RPMI. Incubar el parásito a 28oC durante 1 semana28.
- Recoger trippomastigotes metacíclicos en medio RPMI. Incline cuidadosamente el matraz y pipetee la solución sin molestar a los parásitos adheridos a la superficie inferior. Transfiera el medio a un tubo cónico y centrífuga durante 15 min a 2.100 x g. Deseche el sobrenadante y resuspenda el parásito con 5 ml de DMEM (10% FCS).
NOTA: La población de parásitos es una mezcla de trippomastigotes metacíclicos, epimastigotes y algunas formas intermedias. Aunque no es necesario, puede aislar el trypomastigote mediante la cromatografía de intercambio iónico DEAE29. Alternativamente, los epimastigotes pueden eliminarse incubando los parásitos con suero activo para someterlos a complementar la lisis30. - Semilla 3T3-Célula de fibroblasto sin suiza a 60-70% de confluencia, o alrededor de 1.7-2.0 x 106 células en 5 mL de DMEM (10% FCS) en el matraz de cultivo T-25. Retire el medio de crecimiento y aplique la mezcla de parásitos del paso 1.3.2. Incubar durante 24 h a 37oC por debajo del 5% deCO2 en una incubadora humidificada para establecer la infección.
- Retire los parásitos que quedan fuera de las células 3T3 anfitrionas lavando el cocultivo con DMEM (10% FCS) dos veces.
- Una vez que el cocultivo está saturado, pasa las células huésped infectadas con amastigote por trippsinización. Aspirar el medio y enjuagar el cultivo una vez con PBS. Aplique 1 ml de solución de trippsina al 0,05% para cubrir toda la superficie de cultivo e incubar durante unos minutos a temperatura ambiente hasta que las células huésped conectadas se aflojen. Separe las células de la superficie del matraz lavando 3 ml de DMEM (10% FCS) sobre las celdas.
- Transfiera las células huésped separadas en un tubo cónico y centrífuga durante 3 min a 300 x g. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células con 3 ml de DMEM fresco (10% FCS). Este paso ayuda a eliminar los epimastigotes restantes. Transfiera todo a un matraz T-75 limpio que contenga 9 ml de DMEM (10% FCS). Continúe cultivando hasta que el trypomastigote se libere en el sobrenadante de la cultura.
- Mantener la cocultura mediante el paso con trippsinización dos veces por semana. Una vez que el 70-80% de la población huésped se infecta, agregue regularmente células huésped 3T3 no infectadas a la proporción de 5:1 (transporte:fresco), con el fin de evitar el deterioro del cultivo. Trypomastigote sale continuamente si el equilibrio entre las células huésped y T. cruzi se mantiene correctamente.
2. Diferenciación de los trypomatigotes en EA
- El día anterior a este experimento, elimine el medio de crecimiento del cocultivo host-parásito y agregue DMEM fresco (10% FCS) para lavar el EA y los trypomastigotes que ya habían sido liberados de las células anfitrionas en días anteriores. Los experimentos regulares requieren al menos dos matraces T-75 de cocultivo confluente.
-
Recoger el sobrenadante de cultivo en un tubo cónico para cosechar trippomastigotes recién surgidos. Compruebe la calidad de la muestra bajo un microscopio (lente objetivo de 10x o 20x). Si hay desechos de células huésped, centrifugar brevemente la muestra y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Si hay un número significativo de EAs, aísle los trypomastigotes mediante el siguiente procedimiento de natación.
- Gire hacia abajo la mezcla de trypomastigotes y amastigotes durante 15 min a 2.100 x g. Deseche la mayor parte del sobrenadante, dejando 0,5-1,0 ml de medio en el tubo.
NOTA: La reducción del volumen es opcional, pero facilita el siguiente paso. - Incubar el pellet a 37oC durante 1-2 h, permitiendo que los tripatigotes activos naden fuera del pellet (Figura2).
- Transfiera el sobrenadante que contiene trippomastigos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Gire hacia abajo la mezcla de trypomastigotes y amastigotes durante 15 min a 2.100 x g. Deseche la mayor parte del sobrenadante, dejando 0,5-1,0 ml de medio en el tubo.
- Centrifugar el tubo cónico durante 15 minutos a 2.100 x g para recoger los tripatigotos. Si el procedimiento de salida se realizó anteriormente, centrifugar el tubo de 1,5 ml durante 2 minutos a 4.000 x g para peletizar el trippomastigono. Descarta el sobrenadante.
- Resuspender el pellet con 5 mL de DMEM tamponado con 20 mM MES (pH 5.0), complementado con 0.4% BSA19. Transfiera el parásito a un matraz de cultivo T-25. Deja la gorra suelta. La densidad celular debe estar alrededor o por debajo de 1 x 107 células/ml, ya que la sobresaturación aumenta la probabilidad de muerte celular.
NOTA: El color del DMEM debe ser amarillo, no naranja. Si el DMEM original tenía una alta capacidad de almacenamiento en búfer, 20 mM MES (pH 5.0) no es suficiente para bajar el pH. El pH del medio debe ajustarse mediante la adición de HCl en ese caso. El medio ácido se puede mantener a 4 oC, pero no más de 1 mes. - Incubar el matraz de cultivo a 37oC por debajo del 5% deCO2 en una incubadora humidificada. Alrededor del 95% de los parásitos se diferencian en acomodatos después de las 24 h.
3. Electroporación de EA
- Prepare el ARNm para la electroporación. Esto se puede hacer por transcripción in vitro, o simplemente mediante la compra de oligonucleótidos ARN sintéticos de un fabricante. En este informe, se utilizan crRNA y tracrRNA de Integrated DNA Technologies, Inc.
- Centrifugar el cultivo de los EAs durante 15 min a 2.100 x g. Deseche el sobrenadante.
- Resuspenda el pellet con tampón de electroporación que contenga la solución de suplemento proporcionada a la densidad celular final de 1 x 108 células/ml.
NOTA: El tampón EM causa más muertes celulares en comparación con el tampón de electroporación que aparece en la Tabla de Materiales; por lo tanto, no se recomienda para la transfección de amastigote (FiguraSuplementaria 1). - Alícuota 100 l de parásitos resuspendidos (1 x 107 células) en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 5-10 g de gRNA y mezclar suavemente mediante pipeteo.
- Transfiera la mezcla a una cubeta de electroporación de 2 mm. Aplique el pulso con el dispositivo de electroporación, utilizando el programa X-14.
- Transfiera el contenido de la cubeta a un matraz T-25 que contenga 5 ml de medio LIT precalentado (10% FCS). Dejar la tapa suelta e incubar el matraz a 37oC por debajo del 5% deCO2.
- Supervise el crecimiento celular ya sea mediante la continuación del cultivo axenico (sección 4) o como acomodatíquios intracelulares después de la infección de las células huésped (sección 5).
4. Monitoreo del crecimiento de las células knockout como axenic Amastigotes
- Los EAs se asientan en la parte inferior del medio de cultivo, así que agita suavemente el matraz para resuspenderlos en la solución. Lavar la superficie del matraz pipeteando ayuda, ya que algunas células se adhieren al matraz.
- Mezclar 1 l de solución de yoduro de propidium (PI) (20 g/ml) con 20 ml de cultivo de amastigote.
NOTA: No deje el matraz de cultivo fuera de la incubadora durante más tiempo del necesario. La temperatura es uno de los factores que permite la proliferación axenica22. - Aplique la muestra sobre el hemocitómetro y observe bajo un microscopio de fluorescencia. PI está perdestinado a la membrana celular dañada, pero está excluido de las células vivas. Contar el número de acomodaticias viables que no están manchadas por PI (ex/em 570 nm/602 nm).
5. Monitoreo del Crecimiento de las Células Knockout como Acomotigotes Intracelulares
- Las células 3T3 del huésped de la semilla en una placa de 12 pocillos con DMEM (10% FCS). Ajuste la densidad celular a 70-80% de confluencia, o alrededor de 3 x 105 células por pozo.
NOTA: Dado que los amastítesis no son móviles, cubrir la mayor parte de la superficie de crecimiento por las células huésped mejora la eficiencia de la infección. - Recoger amastigotes knockout del paso 3.6 por centrifugación un día después de la electroporación. Deseche el sobrenadante y resuspenda el parásito con 2 ml de DMEM (10% FCS).
- Quite el medio del cultivo de la célula anfitriona y aplique alostigotes resuspendidos. La multiplicidad de infección debe ser de 20 o más. Incubar la placa a 37oC por debajo del 5% de CO2 durante 2 días para permitir que los acomotigotes establezcan la infección.
NOTA: El período de infección puede ser de 1 día, dependiendo del propósito. - Lavar los EA permanecieron fuera de las células huésped dos veces con DMEM (10% FCS).
- Agregue DMEM fresco (10% FCS) a la cocultura host-parásito y continúe la incubación a 37 oC durante 2 días adicionales.
-
Para evaluar la eficiencia de la infección, visualice los núcleos de las células huésped y el amastigote intracelular.
NOTA: Los núcleos tienden a superponerse en la cocultura saturada. Volver a enchapar las células a menor densidad celular (como la dilución 1:5) antes de la fijación y la tinción ayuda a contar los núcleos más fácilmente.- Retire el medio de cultivo y aplique 1 ml de solución de formalina al 10% en PBS para fijar las células. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
- Sustituya la solución de formalina por 1 ml de PBS que contenga 1 g/ml hoechst 33342 y 0,1% Triton X-100. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- Retire la solución Hoechst y enjuague las células una vez con PBS. Añadir 1 mL de PBS fresco.
- Observar bajo el microscopio de fluorescencia e identificar los núcleos de células huésped que están asociados con núcleos de parásitos más pequeños (Figura4). Las células huésped que contienen más de 2 amastigotes deben considerarse infectadas, no para incluir infecciones iniciales no productivas o EAs no lavados.
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Representative Results
Aislamiento de los trippomastigotes por el procedimiento de piscina
Para cosechar trippomastigotes frescos de eAs viejos contaminantes por procedimiento de natación, los pellets celulares necesitan ser incubados al menos durante 1 h. Incubar los pellets durante más de 2 h no aumenta significativamente el número de trippomastitos que nadan en la solución ( Figura 2B). En este experimento en particular, el porcentaje de trippomastigote en la mezcla inicial fue del 38%, y el porcentaje después de la salida de natación fue superior al 98% en un momento dado. A partir de dos matraces T-75 de cocultivo confluente, obtenemos rutinariamente 3-4 x 107 células de trippomastigoto puro por este protocolo de natación.
Monitoreo del crecimiento del acomodato como cultura axenica
A diferencia de otras etapas de desarrollo de T. cruzi,los amastígotes sin flagelador son prácticamente estáticos. Por lo tanto, la tinción con PI ayuda a distinguir los acomodatigotes vivos de los muertos. PI es impermeable a la membrana celular intacta, pero penetra fácilmente las células muertas (Figura3A). Las atigotes transclostes transclosó con el ARNB contra el gen esencial, TcCGM1 (TcCLB.511807.80), mostraron un defecto de crecimiento significativo en comparación con el grupo de control que recibió el ARNNg no homólogo del genoma T. cruzi (Figura3B).
Monitoreo del crecimiento de parásitos noqueantes como acomodatos intracelulares
La esencialidad del gen objetivo en la etapa de amastigote también puede demostrarse mediante la evaluación del fenotipo de crecimiento de knockout T. cruzi como amastigote intracelular (Figura4). La fracción de núcleos de host que están asociados con núcleos T. cruzi más pequeños fue significativamente menor en el grupo TcCGM1-KO en comparación con el grupo de control.
La eliminación de un gen específico de la etapa causa diferencia fenotípica en las etapas de amastigote y trippomastigote
El componente par1 de la varilla paraflagelar se expresa muy bien en la etapa de trypomastigote, pero está regulado en la etapa de amastigote de T. cruzi22,31. De hecho, la transfección del ARNB frente a TcPAR1 (TcCLB.506755.20) no afectó significativamente al crecimiento de EA después de 4 días de cultivo axenés (Figura5B). La transfección de ARNm seguida de una invasión de células huésped también mostró que TcPAR1-KO no inhibe el crecimiento de acomodaticias intracelulares, en términos de la fracción de células huésped infectadas a los 4 días posteriores a la infección (Figura5C). El número de parásitos dentro de la célula huésped individual no parecía verse afectado por el nocaut, ya sea (FiguraSuplementaria 2). Estos resultados indican que TcPAR1 no es esencial en la etapa de amastigote de T. cruzi.
Sin embargo, el número de trippomastigotes emergió de las células huésped a los 5 días posteriores a la infección fue significativamente menor en la cocultura TcPAR1-KO, en comparación con la cocultura de control (Figura5D). Además, los trypomastigotes diferenciados dentro de la célula anfitriona 3T3 antes de la egresión parecían ser bastante activos en el grupo de control (Supplemental Movie 1), pero parecían lentos en el grupo TcPAR1-KO (Supplemental Movies 2). Estos resultados sugieren que TcPAR1 desempeña un papel importante en la etapa trypomastigote de T. cruzi,presumiblemente proporcionando motilidad para ayudar a la egresión, a pesar de su no esencialidad en la etapa amastigote.
Figura 2: Aislamiento del trypomastigote por procedimiento de natación. (A) Representación esquemática del protocolo. Rojo - presencia de trippomastigote. (B) El número de trippomastigotes que han nadado fuera del pellet en los puntos de tiempo indicados. Los pellets iniciales contenían un total de 3 x 107 parásitos, 38% de los cuales eran trypomastigotes y el resto eran amastigotes. Los experimentos se realizaron en valores triplicados y medios (-SD) se trazan. La pureza de los trippomastigotes en solución fue superior al 98% en un momento dado. (C) Imágenes de microscopía de parásitos antes del procedimiento de natación (izquierda), trippomastigotes que han nadado de un pellet (medio) y parásitos que permanecen en un pellet (derecha) después de 1 h de incubación. Barras de escala a 10 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Monitoreo del crecimiento del axenic amastigote. (A) Ensayo de exclusión de yoduro de Propidium (PI). Imágenes de microscopía de EA en un hemocitómetro en campo brillante (izquierda), canal de fluorescencia (medio) e imagen superpuesta (derecha). Las flechas amarillas indican células muertas manchadas de PI. Barras de escala a 20 m.(B) Recuento celular de amasatigotes que expresan Cas9 después de la transfección con gRNA contra TcCGM1 (círculo abierto) y control de gRNA sin homología al genoma de T. cruzi (círculo cerrado). Las electroporaciones se realizaron en triplicados, y se trazan los valores medios (-SD). (**p < 0.01 por la prueba t de Welch). Esta figura ha sido modificada de Takagi et al.22Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Crecimiento de los acomodatos de nocaut después de la invasión del anfitrión. (A) Tinción nuclear del cocultivo huésped-parásito después de la replicación intracelular de acomotigotes transpirados con gRNA contra TcCGM1 y gRNA de control. Los EAs transpirados por el ARNm se aplicaron en células 3T3 1 día después de la electroporación y se les permitió infectar las células huésped durante 2 días. Los acomodatícos que quedaban fuera de las células huésped fueron arrastrados, y el cocultivo del parásito huésped fue incubado durante 2 días adicionales. Barras de escala a 20 m. Esta cifra ha sido modificada de Takagi et al.22 (B) Porcentaje de células anfitrionas 3T3 infectadas por amastigotes de control (barra negra) y TcCGM1-KO amastigotes (barra gris). La media (SD) de tres experimentos de infección se traza (**p < 0.01, prueba t de Welch). Esta figura ha sido modificada de Takagi et al.22Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Diferencia fenotípica entre el amastigote knockout y el trippomastigote diferenciado. (A) Representación esquemática de la línea de tiempo experimental. (B) Recuento celular de axenic amastigote a los 4 días posteriores a la transfección para los amastígodos de control (barra negra) y TcPAR1-KO amastigotes (barra gris). Se trazan los valores medios de tres experimentos de electroporación (n.s.: no significativo, prueba Mann-Whitney U). (C) Porcentaje de células 3T3 de huésped infectadas a los 4 días posteriores a la infección mediante el control amastigote (barra negra) y TcPAR1-KO amastigote (barra gris). Se trazan los valores medios de tres pozos de cultivo (n.s.: no significativo, prueba Mann-Whitney U). (D) Número de trippomastigote liberado en el medio de cultivo a los 5 días posteriores a la infección para el cocultivo de control (barra negra) y TcPAR1-KO co-cultivo (barra gris). Se trazan los valores medios de tres pozos de cultivo (*p < 0,05, prueba Mann-Whitney U). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla Suplementaria 1: Composición del medio LIT. El medio LIT se preparó de acuerdo con ATCC 1029, excepto por la cantidad de fosfato de hidrógeno disódico. Haga clic aquí para descargar la tabla.
Figura suplementaria 1: Efecto del tampón de electroporación en la viabilidad celular del amastigote. EA se electroporó ya sea en el tampón de electroporación o en el búfer EM. Amastigote fue manchado con PI después de 24 horas para contar el número de amastigotes vivos y muertos. Se trazan porcentajes de celdas muertas en cada grupo y en el grupo sin pulso. Se muestra la media de tres experimentos de electroporación (*p < 0.05, n.s.: no significativo, prueba Kruskal-Wallis). Haga clic aquí para descargar la figura.
Figura suplementaria 2: Imágenes de microscopía de TcPAR1-KO teñido nuclear y control de acomodatigotes intracelulares. El cocultivo de las células huésped 3T3 y los acomodatos transinfectados se fijaron y se mancharon a los 4 días posteriores a la infección. Barras de escala: 20 m. Por favor, haga clic aquí para descargar la figura.
Figura suplementaria 3: Fenotipo de crecimiento del epimastigote expreso de Cas9. Los recuentos celulares de epimastigotes de tipo salvaje (WT), etilótitos que expresan constitutivamente Cas9-EGFP (Cas9-EGFP), y epimastigotes que expresa Cas9-EGFP bajo la regulación de amastigote-específico 3'-UTR (Cas9-EGFP-AmaUTR) se trazan en escala de troncos. Los epimastigotes se cultivaron en medio LIT (10% FCS) a 28oC. La densidad celular del parásito se ajustó a 1 x 106 células/ml el día 0. Los recuentos de celdas acumulados se calculan como densidad de celdas multiplicada por el factor de dilución total. Se muestra la media de tres matraces de cultivo (*p<0.05, n.s.: no significativo, prueba Kruskal-Wallis). Haga clic aquí para descargar la figura.
Película suplementaria 1: Imagen de vídeo de microscopía de cocultura de control. Número y actividad de los trypomastigotes que se han diferenciado de los acomodatitos de control. Se muestra la imagen de vídeo a los 5 días posteriores a la infección. Haga clic aquí para descargar la película.
Película suplementaria 2: Imagen de vídeo de microscopía de tcpar1-KO cocultivo. Número y actividad de los trypomastigotes que se han diferenciado de los acomotigotes TcPAR1-KO. Se muestra la imagen de vídeo a los 5 días posteriores a la infección. Haga clic aquí para descargar la película.
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Discussion
Demostramos que el cultivo axenico de Los amastigotes de T. cruzi se puede utilizar en el knockout de genes mediado por CRISPR/Cas9, electroportando el ARNM en forma directa en el EA que expresa Cas9. De esta manera, la esencialidad del gen objetivo específicamente en la etapa de amastigote puede ser evaluada sin pasar por otras etapas del desarrollo.
Otro aspecto beneficioso de la transfección de amastigote es la conveniencia en las pruebas para un gran número de genes diana. Una vez que se establece el cocultivo de La Cas9-expresando T. cruzi y la célula de mamífero huésped, se tarda sólo unos días en transformar los trippomatigotes derivados de tejidos en EA y gRNA transfecto para obtener amastigotes knockout. gRNA es el único material que necesita ser adaptado a cada gen objetivo, pero el gRNA sintético está disponible de un número de fabricantes, por lo que simplemente se puede comprar. Un método alternativo para analizar la esencialidad específica de la etapa de los genes diana sería establecer un sistema de eliminación inducible32. En ese caso, los plásmidos deben construirse para cada gen diana y transfigurarse al parásito en la etapa de epimastigote para permitir la selección de fármacos de los transfectuados, ya que la eficiencia de transfección del plásmido es mucho menor que la del ARNm (<15% para el plásmido 26 como se supone que >96% para gRNA22). Los transfectantes seleccionados deben diferenciarse en trippomastigotes metacíclicos para infectar las células huésped para finalmente inducir un knockout en el amastigote intracelular. Todo este proceso tomaría 1-2 meses.
En este informe, usamos PI para distinguir las células muertas en el cultivo axensico de amastigote para cuantificar la densidad celular con un hemocitómetro. Alternativamente, se pueden emplear ensayos metabólicos como el ensayo de viabilidad de resazurina para estimar el número de amastigotes vivos, que es más adecuado para un formato de alto rendimiento. En nuestras manos, 1 x 105 amastigotes por pozo producen suficiente actividad redox para ser detectado por un ensayo de resazurina después de 5 h de incubación.
Un inconveniente de establecer una línea celular que expresa Cas9 es la carga celular potencial yel escote no específico debido a la sobreexpresión de Cas9 5,33. Hay varios informes que indican que la expresión constitutiva de Cas9 no tiene ningún efecto sobre la tasa de crecimiento de T. cruzi4,6,7,8. Sin embargo, en un caso5 y también en nuestras manos, el parásito expreso de Cas9 mostró un crecimiento lento en comparación con el tipo salvaje. Para superar este problema, empleamos el 3'-UTR específico de amastigote para restringir la expresión de Cas9 a la etapa22de amastigote. La conjugación de amastina 3'-UTR al marco de lectura abierto Cas9 restauró la tasa de replicación del parásito transgénico (Figurasuplementaria 3), produciendo así una sólida cocultura host-parásito para suministrar continuamente trypomastigotes para in vitro amastigogénesis. Recientemente, otros grupos han demostrado que la introducción del complejo gRNA/Cas9 RNP al parásito de tipo salvaje puede causar la edición del genoma en T. cruzi7,9. Este método debe ser explorado como un enfoque menos estresante para el parásito9, ya que el estudio en células de mamíferos sugiere que el uso de RNP reduce la edición del genoma fuera del destino no deseado, debido a la corta vida media de la proteína Cas934.
Otra modificación opcional del protocolo sería la co-transfección del ADN del donante como plantilla para la recombinación homóloga. Se ha informado de que el ADN del donante que contiene secuencias homólogas aguas arriba y aguas abajo del sitio de escisión, en forma de ADN de doble cadena4,5,8,35 o de una sola cadena oligonucleótido7,9, facilita el proceso de reparación de rotura de doble cadena causada por la nucleasa Cas9. Aunque algunos informes indican que la microhomología mediaba la unión final sin plantilla de donante puede reparar el escote e introducir una mutación de eliminación5, la introducción de la secuencia definida en el sitio de la mutación, sin embargo, ayuda a confirmar edición exitosa del genoma, porque es difícil mostrar la evidencia de ADN de eliminación genética en algunos casos, a pesar de que la reducción de proteína objetivo y el resultado fenotípico sugieren que el gen objetivo fue mutado4.
Cas9/gRNA RNP transfección y co-transfección de un ADN de donante no se demuestran en este informe para simplificar la descripción del protocolo y centrarse en la preparación de EA y el uso de la cultura axenica a partir de entonces. Si uno desea realizar esos experimentos, se puede hacer simplemente reemplazando los componentes de la electroporación.
Nuestro método de utilización de EA de T. cruzi como una herramienta experimental potencialmente permite una variedad de estudios específicos de la etapa, incluyendo la expresión génica transitoria por transfección de plásmido y prueba de eficacia de fármacos22. Sin embargo, la eficacia de este enfoque se ha probado sólo en la cepa tulahuen hasta el momento. Dado que las cepas de T. cruzi son muy diversas, se debe investigar la aplicabilidad de este protocolo a otras cepas.
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Disclosures
Los autores no tienen conflicto de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por JSPS KAKENHI Grant Number 18K15141 a Y.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20% formalin solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 068-03863 | fixing cells |
| 25 cm2 double seal cap culture flask | AGC Techno Glass | 3100-025 | |
| 75 cm2 double seal cap culture flask | AGC Techno Glass | 3110-075 | |
| All-in One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 | |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for Control) | IDT | custom made | target sequence = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcCGM1) | IDT | custom made | target sequence = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcPAR1) | IDT | custom made | target sequence = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA | IDT | 1072532 | to anneal with crRNA |
| Amaxa Nucleofector device | LONZA | AAN-1001 | electroporation |
| Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | LONZA | VMI-1021 | electroporation |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | component of the medium for in vitro amastigogenesis |
| Burker-Turk disposable hemocytometer | Watson | 177-212C | cell counting |
| Coster 12-well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3513 | |
| DMEM | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 044-29765 | culture medium |
| Fetal bovine serum, Defined | Hyclone | SH30070.03 | heat-inactivate before use |
| G-418 Sulfate Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 077-06433 | selection of transformant |
| Hemin chloride | Sigma-Aldrich | H-5533 | component of LIT medium |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | staining of nuclei |
| Liver infusion broth, Difco | Becton Dickinson | 226920 | component of LIT medium |
| MES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 349-01623 | component of the medium for in vitro amastigogenesis |
| PBS (–) | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 166-23555 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | staining of dead cells |
| RPMI 1646 | Sigma-Aldrich | R8758 | medium for metacyclogenesis |
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