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Genetics

Einführung eines Gene Knockout direkt in die Amastigote-Phase von Trypanosoma cruzi mit dem CRISPR/Cas9-System

Published: July 31, 2019 doi: 10.3791/59962
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Einführung eines Genknockouts in den extrazellulären Amastigot von Trypanosoma cruzi, mit dem CRISPR/Cas9-System. Dem Wachstumsphänotyp kann entweder durch Zellzählung der axtischen Amastigotenkultur oder durch Proliferation intrazellulärer Amastigoten nach der Invasion der Wirtszelle gefolgt werden.

Abstract

Trypanosoma cruzi ist ein pathogener Protozoenparasit, der die Chagas-Krankheit hauptsächlich in Lateinamerika verursacht. Um ein neuartiges Wirkstoffziel gegen T. cruzizu identifizieren, ist es wichtig, die Wesentlichkeit des Zielgens im Säugetierstadium des Parasiten, des Amastigots, zu validieren. Amastigotes von T. cruzi replizieren sich in der Wirtszelle; daher ist es schwierig, ein Knockout-Experiment durchzuführen, ohne andere Entwicklungsstadien zu durchlaufen. Kürzlich berichtete unsere Gruppe von einem Wachstumszustand, in dem sich der Amastigot für bis zu 10 Tage axenisch replizieren kann, ohne seine amastigotähnlichen Eigenschaften zu verlieren. Durch die Verwendung dieser zeitlichen axikonischen Amastigotenkultur führten wir erfolgreich gRNAs direkt in die Cas9-extierende Amastigote ein, um Genknockouts zu verursachen, und analysierten ihre Phänotypen ausschließlich im Amastigot-Stadium. In diesem Bericht beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von in vitro abgeleiteten extrazellulären Amastigoten und zur Nutzung der axtischen Kultur in einem CRISPR/Cas9-vermittelten Knockout-Experiment. Der Wachstumsphänotyp von Knockout-Amastigoten kann entweder anhand der Zellzahl der Axtkultur oder durch Replikation des intrazellulären Amastigots nach der Invasion der Wirtszelle bewertet werden. Diese Methode umgeht die Parasitenstadiumdifferenzierung, die normalerweise bei der Herstellung eines transgenen oder knockout amastigote beteiligt ist. Die Nutzung der zeitlichen aatonischen Amastigotenkultur hat das Potenzial, die experimentelle Freiheit bühnenspezifischer Studien in T. cruzi zu erweitern.

Introduction

Trypanosoma cruzi ist der Erreger der Chagas-Krankheit, die vor allem in Lateinamerika vorherrscht1. T. cruzi hat auf der Reise zwischen einem Insektenvektor und einem Säugetierwirt2unterschiedliche Lebenszyklusstadien. T. cruzi repliziert als Epimastigot im Mittelgut eines blutsaugenden Triatomin-Bugs und differenziert sich in seinem Hintergut zu einem infektiösen metazyklischen Trypomastigot, bevor er auf einem menschlichen oder tierischen Wirt abgelagert wird. Sobald der Trypomastigot durch die Bissstelle oder durch eine Schleimhaut in den Wirtskörper gelangt, dringt der Parasit in eine Wirtszelle ein und verwandelt sich in eine flagellalose runde Form, die als Amastigot bezeichnet wird. Der Amastigot repliziert sich innerhalb der Wirtszelle und differenziert sich schließlich in Trypomastigote, das aus der Wirtszelle platzt und in den Blutkreislauf eintritt, um eine andere Wirtszelle zu infizieren.

Da derzeit verfügbare Chemotherapeutika, Benznidazol und Nifurtimox Nebenwirkungen verursachen und in der chronischen Phase der Krankheit3unwirksam sind, ist es von großem Interesse, neuartige Wirkstoffziele gegen T. cruzi zu identifizieren. In den letzten Jahren hat sich das CRISPR/Cas9-System zu einem leistungsfähigen Werkzeug entwickelt, um Gen Knockout in T. cruzieffektiv durchzuführen, entweder durch Transfektion von separaten oder einzelnen Plasmiden, die gRNA und Cas94enthalten, durch stabile Expression von Cas9 und Einführung von gRNA5,6,7 oder Transkriptionsschablon von gRNA8, oder durch Elektroporation des vorgeformten gRNA/Cas9 RNP-Komplexes7,9. Dieser technologische Fortschritt wird mit Spannung erwartet, um die Drogenzielforschung bei der Chagas-Krankheit zu beschleunigen.

Um mit der Arzneimittelentwicklung fortzufahren, ist es entscheidend, die Wesentlichkeit des Zielgens oder die Wirksamkeit von Wirkstoff-Kandidatenverbindungen im Amastigot von T. cruzizu validieren, da es sich um die Replikationsstufe des Parasiten im Säugetierwirt handelt. Dies ist jedoch eine schwierige Aufgabe, da Amastigoten aufgrund des Vorhandenseins einer obstruktiven Wirtszelle nicht direkt manipuliert werden können. In Leishmaniawurde ein eng verwandter protozoischer Parasit zu T. cruzientwickelt, eine axenische Amastigote-Kultivierungsmethode entwickelt und in den Arzneimittelscreening-Assays10,11,12 , 13. Obwohl es einige Unterschiede in der Anfälligkeit für Verbindungen zwischen axtischen Amastigoten und intrazellulären Amastigoten14gibt, bietet die Fähigkeit, die axenische Kultur aufrechtzuerhalten, dennoch wertvolle experimentelle Werkzeuge, um die Grundbiologie des klinisch relevanten Stadiums von Leishmania15,16. Im Fall von T. cruzistammen Literaturen über das Vorhandensein natürlich vorkommender extrazellulärer Amastigoten (EA)17 und die In-vitro-Produktion von EA17,18,19 Jahrzehnten. Darüber hinaus ist EA bekannt, eine infektiöse Fähigkeit20haben , wenn auch weniger als die von Trypomastigote, und der Mechanismus der amastigote Host Invasion wurde in den letzten Jahren aufgeklärt (rezensiert von Bonfim-Melo et al.21). Im Gegensatz zu Leishmaniawar EA jedoch nicht als Versuchswerkzeug in T. cruziverwendet worden, vor allem weil EA als obligate intrazellulärer Parasit angesehen worden war und daher in einer praktischen Form nicht als "replikative Form" betrachtet worden war. sinn.

Kürzlich schlug unsere Gruppe vor, EA von T. cruzi als zeitliche axenische Kultur zu nutzen22. Amastigotes des T. cruzi Tulahuen Stammes können sich bis zu 10 Tage lang frei von Wirtszellen in LIT-Medium bei 37 °C replizieren, ohne dass eine größere Verschlechterung oder Verlust amastigotähnlicher Eigenschaften entsteht. Während der wirtfreien Wachstumsphase wurde EA erfolgreich für die exogene Genexpression durch konventionelle Elektroporation, Arzneimitteltitrationstest mit trypanocidalen Verbindungen und CRISPR/Cas9-vermittelten Knockout gefolgt von einer Wachstumsphänotypüberwachung eingesetzt. In diesem Bericht beschreiben wir das detaillierte Protokoll zur Herstellung von in vitro abgeleiteten EA und zur Nutzung des axtischen Amastigots in Knockout-Experimenten.

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Protocol

HINWEIS: Eine Übersicht über den gesamten experimentellen Fluss ist in Abbildung 1dargestellt.

Figure 1
Abbildung 1: Übersicht über das Knockout-Experiment mit EA. Gewebekultur-abgeleitete Trypomastigoten werden geerntet und in EA differenziert. gRNA wird durch Elektroporation in Cas9-exektierende Amastigoten transfiziert, und der Wachstumsphänotyp des Knockout-Amastigots wird entweder durch axtische Replikation oder durch intrazelluläre Replikation nach der Invasion der Wirtszelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Parasitenkultur präparate

  1. Tulahuen Stamm von Trypanosoma cruzi wird während dieses Berichts verwendet. Epimastigoten von T. cruzi in LIT-Medium pflegen (10% FCS, siehe Zusatztabelle 1). Schließen Sie die Kappe sicher und halten Sie den Kulturkolben bei 28 °C.
  2. Generieren Sie einen transgenen Stamm von T. cruzi, der die Cas9 Endonuklease beherbergt. Beispiele für die Expressionplasmide, die Cas9-Kodierungssequenz und G418 (neor) Selektionsmarker enthalten, finden Sie in Lander et al.4 und Peng et al.5
    1. Transfect das obige Plasmid in Epimastigot durch Elektroporation, mit dem Kit in der Tabelle der Materialienaufgeführt . Für 1 Küvette 2 x 107 Zellen nach unten drehen, den Überstand entsorgen und mit 100 l Elektroporationspuffer, der die mitgelieferte Ergänzungslösung enthält, wieder aufsetzen.
      HINWEIS: Der Elektroporationspuffer kann durch EM-Puffer24 (3:1-Mischung aus Cytomix25 und Phosphat-Sucrose-Puffer) ersetzt werden.
    2. Fügen Sie 20-40 g Plasmid hinzu und übertragen Sie das Gemisch in eine 2 mm Spalt-Elektroporationsküvette. Tragen Sie den Puls mit einem Elektroporationsgerät auf (siehe Materialtabelle),mit dem X-14-Programm26.
    3. Übertragen Sie den Küvetteninhalt in einen T-25-Kolben mit 5 ml LIT-Medium (10% FCS). Den Kolben bei 28 °C für 24 h inkubieren.
    4. G418 auf eine Endkonzentration von 250 g/ml geben und die Inkubation bei 28 °C fortsetzen. Es dauert etwa 1 Woche, um die nicht transfizierten Epimastigoten abzutöten. Sobald die G418-resistente Population beginnt, sich zu erholen, durchdiestobdiele die Kultur ein- bis zweimal pro Woche, um Sättigung zu vermeiden und die abgestorbenen Zellen zu verdünnen. Die Einrichtung einer stabilen Zelllinie dauert in der Regel insgesamt 4 Wochen.
      HINWEIS: Wenn die konstitutive Expression von Cas9 eine Belastung für die Zelle5ist, machen Sie den Ausdruck spezifisch für das Amastigot-Stadium, indem Sie die 3'-UTR des Amastin-Gens unmittelbar unterhalb des offenen Lesrahmens Cas9 konjugieren27. Die detaillierte Beschreibung des amastigotspezifischen Cas9-Expressionsplasmids findet sich in Takagi et al.22
  3. Etablieren Sie eine Wirtsparasiten-Kokultur von Cas9-exezierenden T. cruzi und Säugetier-Wirtszellen. Verwenden Sie in diesem Bericht 3T3-Schweizer Albino-Fibroblastenzellen als Wirt.
    1. Exzessen T. cruzi epimastigotes in metazyklische Trypomastigoten. Bestimmen Sie die Zelldichte der Epimastigotenkultur mit einem Hämozytometer und sammeln Sie 5 x 107 Zellen durch Zentrifugation für 15 min bei 2.100 x g. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit 10 ml RPMI-Medium wieder auf. Inkubieren Sie den Parasiten bei 28 °C für 1 Woche28.
    2. Sammeln Sie metazyklische Trypomastigoten in RPMI Medium. Neigen Sie den Kolben vorsichtig und pipet die Lösung heraus, ohne die an der Bodenoberfläche haftenden Parasiten zu stören. Das Medium für 15 min bei 2.100 x g in ein konisches Rohr und eine Zentrifuge übertragen. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie den Parasiten mit 5 ml DMEM (10% FCS) wieder aus.
      HINWEIS: Die Parasitenpopulation ist eine Mischung aus metazyklischen Trypomastigoten, Epimastigoten und einigen Zwischenformen. Obwohl nicht notwendig, können Sie Trypomastigote durch DEAE Ionenaustauschchromatographie29isolieren. Alternativ können Epimastigoten eliminiert werden, indem die Parasiten mit aktivem Serum inkubiert werden, um sie der Lyse30zu ergänzen.
    3. Samen 3T3-Schweizer Albino-Fibroblastenzelle auf 60-70% Konfluenz oder etwa 1,7-2,0 x 106 Zellen in 5 ml DMEM (10% FCS) in T-25-Kulturkolben. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und wenden Sie die Parasitenmischung aus Schritt 1.3.2 an. 24 h bei 37 °C unter 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator inkubieren, um eine Infektion zu etablieren.
    4. Entfernen Sie die Parasiten, die außerhalb der Host-3T3-Zellen verbleiben, indem Sie die Co-Kultur zweimal mit DMEM (10% FCS) waschen.
    5. Sobald die Kokultur gesättigt ist, Durchgang amastigot-infizierten Wirtszellen durch Trypsinisierung. Aspirieren Sie das Medium und spülen Sie die Kultur einmal mit PBS. Tragen Sie 1 ml 0,05% Trypsin-Lösung auf, um die gesamte Kulturoberfläche abzudecken, und bebrüten Sie einige Minuten bei Raumtemperatur, bis sich die angeschlossenen Wirtszellen lösen. Lösen Sie die Zellen von der Kolbenoberfläche, indem Sie 3 ml DMEM (10% FCS) über die Zellen spülen.
    6. Abgetrennte Wirtszellen in ein konisches Rohr und Zentrifuge für 3 min bei 300 x g übertragen. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit 3 ml frischem DMEM (10% FCS) wieder aus. Dieser Schritt hilft, verbleibende Epimastigoten zu beseitigen. Alles in einen sauberen T-75-Kolben mit 9 ml DMEM (10% FCS) übertragen. Fahren Sie mit der Kultivierung fort, bis Trypomastigote in den Kulturüberstand entlassen wird.
    7. Bewahren Sie die Co-Kultur, indem Sie zweimal pro Woche mit Trypsinisierung übergeben. Sobald 70-80% der Wirtspopulation infiziert sind, fügen Sie regelmäßig nicht infizierte Wirts-3T3-Zellen im Verhältnis 5:1 (Übertrag:frisch) hinzu, um eine Verschlechterung der Kultur zu vermeiden. Trypomastigote geht kontinuierlich aus, wenn das Gleichgewicht zwischen Wirtszellen und T. cruzi ordnungsgemäß aufrechterhalten wird.

2. Differenzierung von Trypomastigoten in EA

  1. Entfernen Sie am Tag vor diesem Experiment das Wachstumsmedium der Wirtsparasiten-Co-Kultur und fügen Sie frisches DMEM (10% FCS) hinzu, um EA und Trypomastigotes, die bereits in den vorherigen Tagen aus den Wirtszellen freigesetzt worden waren, wegzuwaschen. Regelmäßige Experimente erfordern mindestens zwei T-75-Flaschen konfluenter Kokultur.
  2. Sammeln Sie Kultur überstand in eine konische Röhre, um frisch entstandene Trypomastigoten zu ernten. Überprüfen Sie die Probe unter dem Mikroskop (10x oder 20x Objektivlinse) auf die Qualität. Wenn es Wirtzellablagerungen gibt, zentrieren Sie die Probe kurz und übertragen Sie den Überstand in ein neues Rohr. Wenn es eine signifikante Anzahl von EAs gibt, isolieren Trypomastigotes durch das folgende Ausschwimmverfahren.
    1. Die Mischung aus Trypomastigoten und Amastigoten 15 min bei 2.100 x g abdrehen. Entsorgen Sie den größten Teil des Überstandes und lassen Sie 0,5-1,0 ml Medium in der Röhre zurück.
      HINWEIS: Das Reduzieren des Volumes ist optional, erleichtert jedoch den folgenden Schritt.
    2. Inkubieren Sie das Pellet bei 37 °C für 1-2 h, so dass aktive Trypomastigoten aus dem Pellet schwimmen können (Abbildung 2).
    3. Übertragen Sie den Überstand, der Trypomastigoten enthält, in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
  3. Zentrifugieren Sie das konische Rohr für 15 min bei 2.100 x g, um Trypomastigoten zu sammeln. Wenn das Schwimmen durchgeführt wurde oben durchgeführt wurde, zentrifugieren Sie das 1,5 ml Rohr für 2 min bei 4.000 x g, um das Trypomastigot ekeln. Entsorgen Sie den Überstand.
  4. Das Pellet mit 5 ml DMEM gepuffert mit 20 mM MES (pH 5.0), ergänzt mit 0,4% BSA19,wieder aufsetzen. Übertragen Sie den Parasiten in einen T-25-Kulturkolben. Lassen Sie die Kappe locker. Die Zelldichte muss um oder unter 1 x 107 Zellen/ml liegen, da eine Übersättigung die Wahrscheinlichkeit eines Zelltodes erhöht.
    HINWEIS: Die Farbe des DMEM muss gelb und nicht orange sein. Wenn das ursprüngliche DMEM eine hohe Pufferkapazität hatte, reichen 20 mM MES (pH 5.0) nicht aus, um den pH-Wert zu senken. Der pH-Wert des Mediums muss in diesem Fall durch Zugabe von HCl angepasst werden. Das saure Medium kann bei 4 °C gehalten werden, jedoch nicht länger als 1 Monat.
  5. Inkubieren Sie den Kulturkolben bei 37 °C unter 5% CO2 in einem befeuchteten Inkubator. Rund 95% der Parasiten unterscheiden sich nach 24 h in Amastigoten.

3. Elektroporation von EA

  1. Bereiten Sie gRNA für die Elektroporation vor. Dies kann durch In-vitro-Transkription oder einfach durch den Kauf synthetischer RNA-Oligonukleotide von einem Hersteller erfolgen. In diesem Bericht werden crRNA und tracrRNA von Integrated DNA Technologies, Inc. verwendet.
  2. Zentrifugieren Sie die Kultur der EAs für 15 min bei 2.100 x g. Entsorgen Sie Überstand.
  3. Setzen Sie das Pellet mit Elektroporationspuffer mit bereitgestellter Ergänzungslösung für die endgültige Zelldichte von 1 x 108 Zellen/ml wieder auf.
    ANMERKUNG: EM-Puffer verursacht mehr Zellsterblichkeit im Vergleich zu dem in der Materialtabelleaufgeführten Elektroporationspuffer; daher wird es nicht für amastigote Transfektion empfohlen (Ergänzungsfigur 1).
  4. Aliquot 100 l resuspendierte Parasiten (1 x 107 Zellen) in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren. Fügen Sie 5-10 gRNA hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren.
  5. Übertragen Sie das Gemisch auf eine 2 mm Spalt-Elektroporationsküvette. Tragen Sie den Puls mit dem Elektroporationsgerät auf, indem Sie das X-14-Programm verwenden.
  6. Übertragen Sie den Küvetteninhalt in einen T-25-Kolben mit 5 ml vorgewärmten LIT-Medium (10% FCS). Lassen Sie die Kappe locker und brüten Sie den Kolben bei 37 °C unter 5%CO2.
  7. Überwachen Sie das Zellwachstum entweder durch Fortsetzung der axtischen Kultivierung (Abschnitt 4) oder als intrazelluläre Amastigoten nach einer Wirtszellinfektion (Abschnitt 5).

4. Überwachung des Wachstums von Knockout-Zellen als Axenic Amastigotes

  1. EAs setzen sich am unteren Ende des Kulturmediums an, schütteln Sie den Kolben also sanft, um sie in die Lösung zurückzusetzen. Das Waschen der Kolbenoberfläche durch Pipetten hilft, da einige Zellen an den Kolben kleben.
  2. Mischen Sie die Propidiumjodid-Lösung (PI) mit 20 l Amastigotenkultur.
    HINWEIS: Lassen Sie den Kulturkolben nicht länger als nötig außerhalb des Inkubators. Die Temperatur ist einer der Faktoren, die axenische Proliferationermöglicht 22.
  3. Tragen Sie die Probe auf das Hämozytometer auf und beobachten Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop. PI ist auf beschädigte Zellmembran, aber von lebenden Zellen ausgeschlossen. Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Amastigoten, die nicht von PI gefärbt sind (ex/em 570 nm/602 nm).

5. Überwachung des Wachstums von Knockout-Zellen als intrazelluläre Amastigoten

  1. Seed Host 3T3 Zellen in einer 12-Well-Platte mit DMEM (10% FCS). Passen Sie die Zelldichte auf 70-80% Konfluenz oder etwa 3 x 105 Zellen pro Brunnen an.
    HINWEIS: Da Amastigoten nicht motil sind, verbessert die Abdeckung des größten Teils der Wachstumsfläche durch die Wirtszellen die Infektionseffizienz.
  2. Sammeln Sie Knockout-Amastigoten aus Schritt 3.6 durch Zentrifugation einen Tag nach der Elektroporation. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie den Parasiten mit 2 ml DMEM (10% FCS) wieder aus.
  3. Entfernen Sie medium aus der Hostzellenkultur, und wenden Sie resuspendierte Amastigoten an. Die Vielzahl der Infektionen sollte 20 oder höher sein. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C unter 5% CO2 für 2 Tage, damit Amastigoten eine Infektion feststellen können.
    HINWEIS: Die Infektionsdauer kann je nach Zweck 1 Tag betragen.
  4. Wash away EAs blieb mit DMEM (10% FCS) zweimal außerhalb der Hostzellen.
  5. Fügen Sie der Wirts-Parasiten-Kokultur frisches DMEM (10% FCS) hinzu und setzen Sie die Inkubation bei 37 °C für weitere 2 Tage fort.
  6. Um die Infektionseffizienz zu bewerten, visualisieren Sie Diekerne der Wirtszellen und intrazellulären Amastigoten.
    HINWEIS:     Kerne neigen dazu, sich in gesättigter Kokultur zu überlappen. Die Neubeschichtung der Zellen bei geringerer Zelldichte (z. B. 1:5 Verdünnung) vor fixierender und färbung hilft, Die Kerne leichter zu zählen.
    1. Entfernen Sie das Kulturmedium und wenden Sie 1 ml 10% Formalinlösung in PBS an, um die Zellen zu reparieren. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    2. Ersetzen Sie die Formalinlösung durch 1 ml PBS mit 1 g/ml Hoechst 33342 und 0,1% Triton X-100. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Entfernen Sie die Hoechst-Lösung und spülen Sie die Zellen einmal mit PBS. Fügen Sie 1 ml frische PBS hinzu.
  7. Beobachten Sie unter Fluoreszenzmikroskop und identifizieren Wirtszellkerne, die mit kleineren Parasitenkernen verbunden sind (Abbildung 4). Wirtszellen, die mehr als 2 Amastigoten enthalten, sollten als infiziert betrachtet werden, nicht um eine unproduktive Erstinfektion oder ungewaschene EAs einzubeziehen.

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Representative Results

Isolierung von Trypomastigoten durch das Ausschwimmverfahren

Um frische Trypomastigoten aus der Kontamination alter EAs durch Swim-out-Verfahren zu ernten, müssen Zellpellets mindestens für 1 h inkubiert werden. Abbildung 2B). In diesem speziellen Experiment betrug der Prozentsatz der Trypomastigoten in der ursprünglichen Mischung 38 %, und der Prozentsatz nach dem Ausschwimmen lag zu einem bestimmten Zeitpunkt über 98 %. Aus zwei T-75-Flaschen konfluenter Kokultur erhalten wir routinemäßig 3-4 x 107 Zellen reiner Trypomastigote durch dieses Ausschwimmprotokoll.

Wachstumsüberwachung von Knockout amastigote als axtische Kultur

Im Gegensatz zu anderen Entwicklungsstadien von T. cruzisind flagellarlose Amastigoten praktisch statisch. So hilft die Färbung mit PI, lebende Amastigoten von Toten zu unterscheiden. PI ist undurchlässig für die intakte Zellmembran, dringt aber leicht in abgestorbene Zellen ein (Abbildung 3A). Amastigotes transfiziert mit gRNA gegen das essentielle Gen, TcCGM1 (TcCLB.511807.80), zeigte einen signifikanten Wachstumsfehler im Vergleich zu der Kontrollgruppe, die gRNA erhielt, die nicht homolog zum T. cruzi Genom (Abbildung 3B) war.

Wachstumsüberwachung von Knockout-Parasiten als intrazelluläre Amastigoten

Die Wesentlichkeit des Zielgens im Amastigot-Stadium kann auch durch Die Auswertung des Wachstumsphäpnotyps von Knockout T. cruzi als intrazellulärer Amastigotnachgewiesen werden (Abbildung 4). Der Anteil der Wirtskerne, die mit kleineren T. cruzi-Kernen assoziiert sind, war in der TcCGM1-KO-Gruppeim Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant niedriger.

Knockout eines stufenspezifischen Gens verursacht phänotikische Unterschiede in Amastigot- und Trypomastigot-Stadien

Paraflagellar-Stabkomponente PAR1 ist in der Trypomastigot-Stufe stark exprimiert, wird aber in der amastigote Phase von T. cruzi22,31nach unten reguliert. Tatsächlich hat die Transfektion von gRNA gegen TcPAR1 (TcCLB.506755.20) das Wachstum von EA nach 4 Tagen axtischer Kultivierung nicht signifikant beeinflusst (Abbildung 5B). gRNA-Transfektion gefolgt von Wirtszellinvasion zeigte auch, dass TcPAR1-KO das Wachstum von intrazellulären Amastigoten nicht hemmt, in Bezug auf den Anteil infizierter Wirtszellen an 4 Tagen nach der Infektion (Abbildung 5C). Die Anzahl der Parasiten innerhalb der einzelnen Wirtszelle schien auch nicht durch den Knockout beeinflusst zu werden (Ergänzende Abbildung 2). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TcPAR1 in der Amastigot-Phase von T. cruzi nicht wesentlich ist.

Allerdings war die Anzahl der Trypomastigoten, die nach einer Infektion 5 Tage nach der Infektion aus den Wirtszellen hervorgingen, in der Kokultur Von TcPAR1-KO im Vergleich zur Kontrollkokultur (Abbildung5D) signifikant niedriger. Auch, differenzierte Trypomastigoten innerhalb Host 3T3 Zelle vor der Egression schien ziemlich aktiv in der Kontrollgruppe (Supplemental Movie 1) aber schien träge in TcPAR1-KO-Gruppe (Supplemental Movies 2). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TcPAR1 eine wichtige Rolle in der trypomastigote Phase von T. cruzispielt, vermutlich durch die Bereitstellung von Beweglichkeit, um die Austretung zu helfen, trotz seiner Nicht-Essentialität in amastigote Stadium.

Figure 2
Abbildung 2: Isolierung von Trypomastigoten durch Ausschwimmvorgang. (A) Schematische Darstellung des Protokolls. Rot = Vorhandensein von Trypomastigot. (B) Die Anzahl der Trypomastigoten, die zu angegebenen Zeitpunkten aus dem Pellet geschwommen sind. Die ersten Pellets enthielten insgesamt 3 x 107 Parasiten, von denen 38% Trypomastigoten waren und der Rest Amastigoten waren. Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt, und mittelwerte Werte (SD) werden aufgezeichnet. Die Reinheit der Trypomastigoten in Lösung lag zu einem bestimmten Zeitpunkt über 98%. (C) Mikroskopiebilder von Parasiten vor dem Ausschwimmen (links), Trypomastigoten, die aus einem Pellet (Mitte) geschwommen sind, und Parasiten, die nach 1 h Inkubation in einem Pellet (rechts) verbleiben. Skalenbalken = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Wachstumsüberwachung von axtischem Amastigot. (A) Propidiumiodid (PI) Ausschlussassay. Mikroskopiebilder von EA auf einem Hämozytometer im hellen Feld (links), Fluoreszenzkanal (Mitte) und überlagertes Bild (rechts). Gelbe Pfeile zeigen PI-befleckte tote Zellen an. Skalenstäbe = 20 m (B) Zellanzahl von Cas9-exemittierenden Amastigoten nach Transfektion mit gRNAs gegen TcCGM1 (offener Kreis) und KontrollgRNA ohne Homologie zum T. cruzi Genom (geschlossener Kreis). Elektroporationen wurden in Triplicaten durchgeführt, und Mittelwerte (SD) werden geplottet. (**p < 0,01 durch Welchs t-Test). Diese Abbildung wurde von Takagi et al.22geändert.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Wachstum von Knockout-Amastigoten nach der Host-Invasion. (A) Nukleare Färbung der Wirtsparasiten-Kokultur nach intrazellulärer Replikation von amastigotes transfiziert mit gRNAs gegen TcCGM1 und Kontrolle gRNA. gRNA-transfizierte EAs wurden 1 Tag nach der Elektroporation auf 3T3-Zellen aufgetragen und konnten Wirtszellen 2 Tage lang infizieren. Amastigotes, die außerhalb der Wirtszellen verblieben, wurden weggespült, und die Wirts-Parasiten-Kokultur wurde für weitere 2 Tage inkubiert. Skalenbalken = 20 m. Diese Zahl wurde von Takagi et al.22 (B) Prozentsatz der wirt 3T3 Zellen durch Kontrollamastigoten (schwarzer Balken) und TcCGM1-KO Amastigotes (grauer Balken) infiziert modifiziert. Der Mittelwert von drei Infektionsexperimenten wird dargestellt (**p < 0,01, Welchs t-Test). Diese Abbildung wurde von Takagi et al.22geändert.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Phenotypic Unterschied zwischen Knockout amastigote und differenziertem Trypomastigote. (A) Schematische Darstellung der experimentellen Zeitlinie. (B) Zellzählungen von axtischen Amastigoten bei 4 Tagen nach der Transfektion für Kontrollamastigoten (schwarzer Balken) und TcPAR1-KO-Amastigoten (grauer Balken). Die Mittelwerte von drei Elektroporationsexperimenten werden dargestellt (n.s.: nicht signifikant, Mann-Whitney U-Test). (C) Prozentsatz der infizierten Wirts-3T3-Zellen nach 4 Tagen nach der Infektion durch Kontrolle amastigote (schwarzer Balken) und TcPAR1-KO amastigote (grauer Balken). Mittelwerte von drei Kulturbrunnen werden geplottet (n.s.: nicht signifikant, Mann-Whitney U-Test). (D) Anzahl der Trypomastigoten, die nach einer Infektion nach einer Infektion zur Kontrolle der Kokultur (schwarzer Balken) und der Kokultur TcPAR1-KO (grauer Balken) in das Kulturmedium freigesetzt wurden. Mittelwerte von drei Kulturbrunnen werden geplottet (*p < 0.05, Mann-Whitney U-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Tabelle 1: Zusammensetzung des LIT-Mediums. LIT-Medium wurde nach ATCC 1029 hergestellt, mit Ausnahme der Menge an Dinatriumhydrogenphosphat. Bitte klicken Sie hier, um die Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Wirkung des Elektroporationspuffers auf die Lebensfähigkeit von Amastigotenzellen. EA wurde entweder im Elektroporationspuffer oder im EM-Puffer elektropoiert. Amastigote wurde nach 24 h mit PI befleckt, um die Anzahl der lebenden und toten Amastigotes zu zählen. Prozentsätze der abgestorbenen Zellen in jeder Gruppe und in der Gruppe "Keine" werden dargestellt. Gezeigt wird der Mittelwert von drei Elektroporationsexperimenten (*p < 0,05, n.s.: nicht signifikant, Kruskal-Wallis-Test). Bitte klicken Sie hier, um die Figur herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Mikroskopiebilder von kerngeflecktem TcPAR1-KO und Kontrolle intrazellulärer Amastigoten. Die Co-Kultur von Wirts-3T3-Zellen und transfizierten Amastigoten wurde nach einer Infektion an 4 Tagen fixiert und befleckt. Maßstabsbalken: 20 m. Bitte klicken Sie hier, um die Figur herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Wachstumsphänotyp von Cas9-exemittierendem Epimastigot. Zellzählungen von Wildtyp-Epimastigoten (WT), Epimastigoten, die konstitutiv Cas9-EGFP (Cas9-EGFP) ausdrücken, und Epimastigoten, die Cas9-EGFP unter der Regulierung von amastigote-spezifischem 3'-UTR (Cas9-EGFP-AmaUTR) ausdrücken, werden im Log-Maßstab dargestellt. Epimastigoten wurden im LIT-Medium (10% FCS) bei 28°C angebaut. Die Parasitenzelldichte wurde an Tag 0 auf 1 x 106 Zellen/ml angepasst. Die kumulierten Zellzahlen werden als Zelldichte multipliziert mit dem gesamten Verdünnungsfaktor berechnet. Es wird der Mittelwert von drei Kulturkolben angezeigt (*p<0.05, n.s.: nicht signifikant, Kruskal-Wallis-Test). Bitte klicken Sie hier, um die Figur herunterzuladen.

Ergänzender Film 1: Mikroskopie Videobild der Kontrollkokultur. Anzahl und Aktivität der Trypomastigoten, die sich von kontrollamastigotes unterschieden haben. Videobild nach 5 Tagen nach der Infektion wird gezeigt.  Bitte klicken Sie hier, um den Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 2: Mikroskopie Videobild von TcPAR1-KO Co-Kultur. Anzahl und Aktivität von Trypomastigoten, die sich von TcPAR1-KO-Amastigoten unterschieden haben. Videobild nach 5 Tagen nach der Infektion wird gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um den Film herunterzuladen.

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Discussion

Wir haben gezeigt, dass die axtische Kultur von T. cruzi amastigotes in CRISPR/Cas9-vermitteltem Gen Knockout genutzt werden kann, indem gRNA direkt in Cas9-exemittiert wird. Auf diese Weise kann die Wesentlichkeit des Zielgens speziell im Amastigot-Stadium bewertet werden, ohne andere Entwicklungsstadien durchlaufen zu müssen.

Ein weiterer vorteilhafter Aspekt der Amastigot-Transfektion ist die Bequemlichkeit bei der Prüfung auf eine große Anzahl von Zielgenen. Sobald die Kokultur von Cas9-exezierenden T. cruzi und Wirts-Säugetierzelle etabliert ist, dauert es nur wenige Tage, um die gewebeabgeleiteten Trypomastigoten in EA zu verwandeln und gRNA zu transfekten, um Knockout-Amastigoten zu erhalten. gRNA ist das einzige Material, das auf jedes Zielgen zugeschnitten werden muss, aber synthetische gRNA ist von der Anzahl der Hersteller erhältlich, so dass es einfach gekauft werden kann. Eine alternative Methode zur Analyse der stufenspezifischen Wesentlichkeit von Zielgenen wäre die Einrichtung eines induzierbaren Knockout-Systems32. In diesem Fall müssen Plasmide für jedes Zielgen konstruiert und im Epimastigot-Stadium auf den Parasiten transfiziert werden, um die Wirkstoffauswahl der Transfekten zu ermöglichen, da die Transfektionseffizienz des Plasmids viel niedriger ist als die von gRNA (<15% für Plasmid 26 wie für gRNA22vorgesehen >96 %). Ausgewählte Transfektanten müssen in metazyklische Trypomastigoten differenziert werden, um Wirtszellen zu infizieren, um schließlich einen Knockout bei intrazellulärem Amastigoten auszulösen. Dieser ganze Prozess würde 1-2 Monate dauern.

In diesem Bericht verwendeten wir PI, um abgestorbene Zellen in der axtischen Amastigotenkultur zu unterscheiden, um die Zelldichte mit einem Hämozytometer zu quantifizieren. Alternativ können metabolische Assays wie der Resazurin-Viability-Assay verwendet werden, um die Anzahl der lebenden Amastigoten zu schätzen, was besser für ein Format mit hohem Durchsatz geeignet ist. In unseren Händen liefern 1 x 105 Amastigoten pro Brunnen eine ausreichende Redoxaktivität, um durch einen Resazurin-Assay nach 5 h Inkubation nachgewiesen zu werden.

Ein Nachteil der Einrichtung einer Cas9-exemittierenden Zelllinie ist die potenzielle Zelllast und unspezifische Spaltung durch Cas9-Überexpression5,33. Es gibt mehrere Berichte, die darauf hindeuten, dass die konstitutive Expression von Cas9 keinen Einfluss auf die Wachstumsrate von T. cruzi4,6,7,8hat. In einem Fall5 und auch in unseren Händen zeigte Der Cas9-exättige Parasit jedoch ein langsames Wachstum im Vergleich zum Wildtyp. Um dieses Problem zu lösen, haben wir die amastigot-spezifische 3'-UTR eingesetzt, um die Expression von Cas9 auf amastigote Stufe22zu beschränken. Die Konjugation von amastin 3'-UTR in den offenen Leserahmen Cas9 stellte die Replikationsrate transgener Parasiten wieder her (Supplemental Abbildung 3), wodurch eine robuste Wirts-Parasiten-Kokultur zur kontinuierlichen Versorgung von Trypomastigoten für in vitro erzeugt wurde. Amastigogenese. Kürzlich haben andere Gruppen gezeigt, dass die Einführung des gRNA/Cas9 RNP-Komplexes in Wildtypparasiten die Genombearbeitung in T. cruzi7,9verursachen kann. Diese Methode sollte als weniger stressiger Ansatz für den Parasiten9untersucht werden, da Untersuchungen an Säugetierzellen darauf hindeuten, dass die Verwendung von RNP aufgrund der kurzen Halbwertszeit des Cas9-Proteins34unerwünschte Off-Target-Genombearbeitung reduziert.

Eine weitere optionale Änderung des Protokolls wäre die Ko-Transfektion der Spender-DNA als Vorlage für eine homologe Rekombination. Es wurde berichtet, dass die Spender-DNA, die homologe Sequenzen vor und nach der Spaltungsstelleenthält, in Form von doppelsträngiger DNA 4,5,8,35 oder einsträngig Oligonukleotid7,9, erleichtert den Reparaturprozess von Doppelstrandedbruch durch Cas9 Nuklease verursacht. Obwohl einige Berichte darauf hindeuten, dass Mikrohomologie vermittelte Endverbindung ohne Spendervorlage die Spaltung reparieren und eine Deletionsmutation5einführen kann, hilft die Einführung der definierten Sequenz auf der Mutationsstelle dennoch, erfolgreiche Genombearbeitung, da es schwierig ist, in einigen Fällen den DNA-Beweis für Gen-Knockout zu zeigen, obwohl die Zielproteinreduktion und das phäkotypische Ergebnis darauf hindeuten, dass das Zielgen mutiert war4.

Cas9/gRNA RNP-Transfektion und Co-Transfektion einer Spender-DNA werden in diesem Bericht nicht nachgewiesen, um die Beschreibung des Protokolls zu vereinfachen und sich auf die Herstellung von EA und die anschließende Verwendung von Axenkultur zu konzentrieren. Wenn man diese Experimente durchführen möchte, kann dies durch einfaches Ersetzen der Komponenten der Elektroporation erfolgen.

Unsere Methode, EA von T. cruzi als experimentelles Werkzeug zu verwenden, ermöglicht potenziell eine Vielzahl von stufenspezifischen Studien, einschließlich der transienten Genexpression durch Plasmidtransfektion und dem Wirksamkeitstest für Arzneimittel22. Die Wirksamkeit dieses Ansatzes wurde bisher jedoch nur im Tulahuen-Stamm getestet. Da die Stämme von T. cruzi sehr unterschiedlich sind, muss die Anwendbarkeit dieses Protokolls auf andere Stämme untersucht werden.

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Disclosures

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde teilweise von JSPS KAKENHI Grant Number 18K15141 an Y.T. unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20% formalin solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 068-03863 fixing cells
25 cm2 double seal cap culture flask AGC Techno Glass 3100-025
75 cm2 double seal cap culture flask AGC Techno Glass 3110-075
All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X710
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for Control) IDT custom made target sequence = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcCGM1) IDT custom made target sequence = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcPAR1) IDT custom made target sequence = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA IDT 1072532 to anneal with crRNA
Amaxa Nucleofector device LONZA AAN-1001 electroporation
Basic Parasite Nucleofector Kit 2 LONZA VMI-1021 electroporation
BSA Sigma-Aldrich A3294 component of the medium for in vitro amastigogenesis
Burker-Turk disposable hemocytometer Watson 177-212C cell counting
Coster 12-well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3513
DMEM FUJIFILM Wako Pure Chemical 044-29765 culture medium
Fetal bovine serum, Defined Hyclone SH30070.03 heat-inactivate before use
G-418 Sulfate Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 077-06433 selection of transformant
Hemin chloride Sigma-Aldrich H-5533 component of LIT medium
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570 staining of nuclei
Liver infusion broth, Difco Becton Dickinson 226920 component of LIT medium
MES FUJIFILM Wako Pure Chemical 349-01623 component of the medium for in vitro amastigogenesis
PBS (–) FUJIFILM Wako Pure Chemical 166-23555
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4864-10ML staining of dead cells
RPMI 1646 Sigma-Aldrich R8758 medium for metacyclogenesis

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References

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Genetik Ausgabe 149 CRISPR/Cas9 Gen Knockout stufenspezifisch Trypanosoma cruzi Chagas-Krankheit Kinetoplastid-Parasiten Wirkstoffziel Axenic-Kultur Amastigote
Einführung eines Gene Knockout direkt in die Amastigote-Phase von <em>Trypanosoma cruzi</em> mit dem CRISPR/Cas9-System
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Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K., Takagi, Y. Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (149), e59962, doi:10.3791/59962 (2019).

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