Isolering af makrofag-undergrupper og stromale celler fra humane og muse Myokardie prøver
Summary
Præsenteret her er en protokol til at isolere forskellige undergrupper af makrofager og andre ikke-immunceller fra menneske og mus myokardiet ved at forberede en enkelt cellesuspension gennem enzymatisk fordøjelse. Gating ordninger for flow cytometri baseret identifikation og karakterisering af isolerede makrofager er også præsenteret.
Abstract
Makrofager repræsenterer de mest heterogene og rigelige immuncelle populationer i hjertet og er centrale i kørsel betændelse og reparative reaktioner efter hjerte skade. Hvordan forskellige undergrupper af makrofager orkestrat immunresponser efter hjerte skade er et aktivt område af forskning. Præsenteret her er en simpel protokol, som vores laboratorium udfører rutinemæssigt, til udvinding af makrofager fra mus og humant myokardiet prøver opnået fra raske og syge individer. Kort, denne protokol indebærer enzymatisk fordøjelse af hjernevæv til at generere en enkelt cellesuspension, efterfulgt af antistof farvning, og flow cytometry. Denne teknik er velegnet til funktionelle assays udført på sorterede celler samt bulk og enkelt celle RNA Sequencing. En stor fordel ved denne protokol er dens enkelhed, minimal dag til dag variation og bred anvendelighed tillader undersøgelse af makrofag heterogenitet på tværs af forskellige musemodeller og menneskelige sygdoms enheder.
Introduction
Makrofager repræsenterer den mest udbredte immuncelle type i hjertet, og de spiller en betydelig rolle i at generere robuste inflammatoriske og reparative reaktioner efter hjerte skade1,2,3,4. Tidligere identificerede vores gruppe to store undergrupper af makrofager i murine hjertet afledt af distinkte udviklingsmæssige oprindelser5,6. Bredt, forskellige populationer af væv residente hjerte makrofag undergrupper kan identificeres baseret på cellens overflade ekspression af CCR2 (C-C Motif chemokine receptor 2). CCR2– makrofager (celleoverflade udtryk: CCR2–MHCIIlav og CCR2–mhciihøj) er af embryonale oprindelse (primitive og erythromyeloid lineages), i stand til at selv forny, og repræsentere en dominerende befolkning under homeostatiske forhold. Residente CCR2+ makrofager er af endelig hæmatopoietisk oprindelse, opretholdes gennem rekruttering fra cirkulerende monocytter, og repræsenterer en mindre population under homeostatiske forhold. Funktionelt, CCR2– makrofager genererer minimal inflammation og er afgørende for koronar udvikling neonatal hjerte regenerering5,7. I modsætning hertil initierer CCR2+ makrofager robuste inflammatoriske reaktioner efter hjertets fornærmelser og bidrager til sikkerhedsstillelse kardiomyocyt skade, negativ remodeling af venstre ventrikel, og hjertesvigt progression8,9.
For nylig har vi vist, at det menneskelige myokardiet også indeholder to særskilte undergrupper af makrofager, der er identificeret på samme måde som enten CCR2– eller CCR2+8. Genekspression og funktionelle analyser afslørede, at humane CCR2– og CCR2+ makrofager repræsenterer funktionelt divergerende delsæt og er funktionelt analoge med CCR2– og CCR2+ makrofager, der findes i muse hjertet. Humane CCR2– makrofager udtrykker robuste niveauer af vækstfaktorer, herunder IGF1, PDGF, CYR61 og HB-EGF. CCR2+ makrofager er beriget med kemo okiner og cytokiner, der fremmer inflammation, såsom Il-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 og TNF-a. Stimuleret CCR2+ makrofager udskiller markant højere niveauer af den inflammatoriske cytokin interleukin-1β (Il-1β) i kulturen. Hvordan disse undergrupper differentielt bidrage til vævsreparation og venstre ventrikel (LV) remodeling i forbindelse med hjerte skade er fortsat et område med aktiv forskning.
Flow-cytometri-baseret analyse af makrofag heterogenitet i mus og menneskelige hjerte kræver at fordøje hjertevæv og generere en enkelt cellesuspension efterfulgt af flow cytometrisk analyse eller celle sortering for yderligere downstream processer såsom bulk RNA sekventering/enkelt celle RNA sekventering eller dyrkning cellerne for funktionelle assays. Den oprindelige protokol for at gøre en enkelt cellesuspension fra murine hjerter blev først rapporteret af Nahrendorf gruppe i Nahrendorf et al. 200710. Vores laboratorium har tilpasset og modificeret protokollen til at udtrække makrofager fra den menneskelige myokardiet. Ved hjælp af samme protokol, men med mindre modifikation i farvning og gating ordning, kan CD45– stromale celler fra det menneskelige myokardiet også høstes. Præsenteret her, i tekst og video, er en protokol, der udføres rutinemæssigt til udvinding af makrofager eller stromale fra det menneskelige myokardiet.
Kardiale vævsprøver fås hos voksne patienter med dilateret kardiomyopati (DCM: idiopatisk eller familiær) eller iskæmisk kardiomyopati (ICM), der gennemgår implantation af venstre ventrikel assistent (LVAD) eller hjertetransplantation. Forklarende hjerter eller LVAD-kerner er Intravaskulært perfekteret med koldt saltvand, før fordøjelses proceduren påbegyndes. Det er vigtigt at bemærke, at “kvalitet” af væv prøve bestemt i form af ardannelse eller fedtvæv infiltration kan i høj grad påvirke udbyttet af makrofager. Hjerte prøver med store områder af ardannelse vil have meget lavere celle udbytte og kan udgøre en alvorlig teknisk begrænsning, når det ønskes downstream analysemetoder kræver in vitro-celledyrkning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen giver mulighed for udvinding af forskellige makrofag undergrupper fra humant myokardiet. Protokollen er enkel og tager 3 til 4 timer til at forberede enkelt cellesuspension klar til FACS analyse. Selv om protokollen er relativt enkel at udføre, er der visse tekniske aspekter, der skal overvejes, som vil minimere variabilitet. For det første er det nødvendigt at arbejde rettidigt med humant væv for at opnå optimal cellelevedygtighed. Det er vigtigt at holde vævet i koldt saltvand/HBSS for at minimere cel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev muliggjort ved finansiering fra children’s Discovery Institute of Washington University og St. Louis children’s Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), Foundation of Barnes-Jewish Hospital (8038-88), og NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. understøttes af NIH K08 HL123519 og Burroughs Welcome Fund (1014782).
Materials
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petridishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
