ヒトおよびマウスの心筋標本からのマクロファージサブセットおよび間質細胞の分離
Summary
ここで提示するプロトコルは、酵素消化を介して単一細胞懸濁液を調製することにより、マクロファージおよび他の非免疫細胞の様々なサブセットをヒトおよびマウスの心筋から単離するプロトコルである。単離されたマクロファージのフローサイトメトリーベースの同定および特性評価のためのゲーティングスキームも提示される。
Abstract
マクロファージは、心臓の中で最も異種で豊富な免疫細胞集団を表し、心損傷後の炎症および修復応答を駆動する中心的存在である。マクロファージの様々なサブセットが心損傷後の免疫応答をどのように調整するかについては、研究の活発な領域である。ここで提示されるのは、健康で病気の個体から得られたマウスおよびヒト心筋標本からのマクロファージの抽出のために、私たちの研究室が日常的に行う簡単なプロトコルです。簡単に言えば、このプロトコルは、単一細胞懸濁液を生成するために心臓組織の酵素消化を伴い、続いて抗体染色、およびフローサイトメトリーを生成する。この技術は、並べ替えられた細胞に対して行われる機能アッセイ、バルクおよび単一細胞RNAシーケンシングに適しています。このプロトコルの主な利点は、そのシンプルさ、日々の変動を最小限に抑え、広い適用性を備えており、さまざまなマウスモデルおよびヒト疾患エンティティにわたるマクロファージの不均一性を調査することができます。
Introduction
マクロファージは心臓の中で最も豊富な免疫細胞型を表し、心損傷1、2、3、4に続く堅牢な炎症および修復応答を生成する上で重要な役割を果たす。以前、私たちのグループは、異なる発達起源5、6に由来するマウス心臓におけるマクロファージの2つの主要なサブセットを同定した。広く、組織常駐心臓マクロファージサブセットの異なる集団は、CCR2(C−Cモチーフケモカイン受容体2)の細胞表面発現に基づいて同定することができる。CCR2–マクロファージ(細胞表面発現:CCR2-MHCII低およびCCR2-MHCII高)は胚起源(原始およびエリスロ骨髄系統)であり、自己再生することができ、恒主状態下で支配的な集団を表すことができる。居住者CCR2+マクロファージは、決定的な造血起源であり、循環単球からのリクルートを通じて維持され、恒静学的条件下でのマイナーな集団を表す。機能的には、CCR2–マクロファージは最小限の炎症を発生し、冠動脈発生新生児心臓再生5、7に不可欠である。対照的に、CCR2+マクロファージは、心侮辱に続いて強固な炎症反応を開始し、心筋細胞損傷、左心室の有害な改造、および心不全進行8、9に寄与する。
最近、ヒト心筋には、CCR2-またはCCR2+8のいずれかとして同様に同定されたマクロファージの2つの異なるサブセットも含まれていることが示されている。遺伝子発現および機能解析は、ヒトCCR2-およびCCR2+マクロファージが機能的に発散したサブセットを表し、マウス心臓に見られるCCR2およびCCR2+マクロファージに機能的に類似していることを明らかにした。ヒトCCR2–マクロファージは、IGF1、PDGF、Cyr61、およびHB-EGFを含む成長因子の堅牢なレベルを発現する。CCR2+マクロファージは、IL-1b、IL-6、CCL-2、CCL-7、およびTNF-aなどの炎症を促進するケモカインおよびサイトカインに富む。刺激されたCCR2+マクロファージは、培養中の炎症性サイトカインインターロイキン-1β(IL-1β)の著しく高いレベルを分泌する。これらのサブセットが、心損傷の文脈における組織修復および左心室(LV)改造にどのように寄与するかを、依然として活発な研究の領域である。
マウスおよびヒト心臓におけるマクロファージ不均一性のフローサイトメトリーベースの分析では、心臓組織を消化し、単一細胞懸濁液を生成し、続いてバルクRNAシーケンシング/単一細胞RNAシーケンシングや機能アッセイのための細胞の培養などのさらなる下流プロセスのためのフローサイトメトリック分析または細胞選別を生成する必要があります。マウスの心臓から単一の細胞懸濁液を作るための元のプロトコルは、最初にナレンドルフらのナレンドルフグループによって報告されました 200710.私たちの研究室は、ヒト心筋からマクロファージを抽出するためにプロトコルを適応させ、改変しました。同じプロトコルを使用するが、染色およびゲーティングスキームにわずかな変更を加えて、ヒト心筋からの間質細胞のCD45も収穫することができる。ここで提示される、テキストおよびビデオにおいて、ヒト心筋からのマクロファージまたは間質の抽出のために日常的に行われるプロトコルである。
心臓組織標本は、拡張型心筋症(DCM:特発性または家族性)または虚血性心筋症(ICM)を受けた左心室補助装置(LVAD)移植または心臓移植を有する成人患者から得られる。励起された心臓またはLVADコアは、消化手順を開始する前に冷たい生理食リンで血管内に浸透する。瘢痕化または脂肪組織浸潤の程度の観点から決定される組織標本の「品質」は、マクロファージの収率に大きく影響を与えることができることに注意することが重要です。瘢痕の広い領域を有する心臓標本は、はるかに低い細胞収率を有し、所望の下流の分析方法がインビトロ細胞培養を必要とする場合に深刻な技術的制限を提起することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、ヒト心筋からの種々のマクロファージサブセットの抽出を可能にする。プロトコルはシンプルで、FACS分析の準備が整った単一細胞懸濁液の準備に3~4時間かかります。プロトコルの実行は比較的簡単ですが、変動を最小限に抑える技術的な側面を考慮する必要があります。第一に、最適な細胞生存率を得るには、ヒト組織をタイムリーに働かすことができます。細胞死を最…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、ワシントン大学の小児発見研究所とセントルイス小児病院(CH-II-2015-462、CH-II-2017-628)、バーンズ・ユダヤ病院財団(8038-88)、NHLBI(R01)から提供された資金によって可能になりました。HL138466、 R01 HL139714)。K.J.L.は、NIH K08 HL123519およびバロウズウェルカムファンド(1014782)によってサポートされています。
Materials
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petridishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
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