Summary
Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um verschiedene Teilmengen von Makrophagen und anderen nicht-immunen Zellen aus menschlichem und Mausmyokard zu isolieren, indem eine einzelzellige Suspension durch enzymatische Verdauung vorbereitet wird. Gating-Schemata für die Strömungszytometrie basierende Identifizierung und Charakterisierung isolierter Makrophagen werden ebenfalls vorgestellt.
Abstract
Makrophagen stellen die heterogensten und reichlichsten Immunzellpopulationen im Herzen dar und sind von zentraler Bedeutung bei der Förderung von Entzündungen und reparativen Reaktionen nach Herzverletzungen. Wie verschiedene Teilmengen von Makrophagen die Immunantworten nach einer Herzverletzung orchestrieren, ist ein aktives Forschungsgebiet. Präsentiert hier ist ein einfaches Protokoll, das unser Labor routinemäßig durchführt, für die Extraktion von Makrophagen von Maus und menschlichen Myokardproben von gesunden und kranken Personen erhalten. Kurz gesagt beinhaltet dieses Protokoll die enzymatische Verdauung von Herzgewebe, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen, gefolgt von Antikörperfärbung und Durchflusszytometrie. Diese Technik eignet sich für funktionelle Assays, die an sortierten Zellen durchgeführt werden, sowie für die Massen- und Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Ein großer Vorteil dieses Protokolls ist seine Einfachheit, minimale tägliche Variation und breite Anwendbarkeit, die die Untersuchung der Makrophagenheterogenität über verschiedene Mausmodelle und menschliche Krankheitsentitäten ermöglicht.
Introduction
Makrophagen stellen den häufigsten Immunzelltyp im Herzen dar und spielen eine wichtige Rolle bei der Erzeugung robuster entzündlicher und reparativer Reaktionen nach Einer Herzerkrankung1,2,3,4. Zuvor identifizierte unsere Gruppe zwei Hauptteile von Makrophagen im murinen Herz, die von unterschiedlichen Entwicklungsursprungsherden abgeleitet wurden5,6. Auf der Grundlage der Zelloberflächenexpression von CCR2 (C-C-Motiv Chemokinrezeptor 2) können im Großen und Ganzen unterschiedliche Populationen von geweberesidenten Kardialmakrophagen-Untergruppen identifiziert werden. CCR2- Makrophagen (Zelloberflächenexpression: CCR2-MHCIIniedrig und CCR2-MHCIIhoch) sind embryonalen Ursprungs (primitive und erythromyeloidale Linien), die sich selbst erneuern können und eine dominante Population unter omöostatischen Bedingungen darstellen. Resident CCR2+ Makrophagen sind definitiv hämatopoetischen Ursprungs, werden durch Rekrutierung aus zirkulierenden Monozyten aufrechterhalten und stellen eine kleine Population unter omöostatischen Bedingungen dar. Funktionell, CCR2- Makrophagen erzeugen minimale Entzündungen und sind entscheidend für die koronare Entwicklung neonatale Herzregeneration5,7. Im Gegensatz dazu initiieren CCR2+ Makrophagen robuste Entzündungsreaktionen nach Herzbeleidigungen und tragen zu Kollateralkardiomyozytenverletzungen, einer negativen Umgestaltung des linken Ventrikels und der Herzinsuffizienzprogression8,9bei.
Kürzlich haben wir gezeigt, dass das humane Myokard auch zwei verschiedene Teilmengen von Makrophagen enthält, die entweder als CCR2- oder CCR2+8identifiziert wurden. Genexpression und funktionelle Analysen ergaben, dass menschliche CCR2- und CCR2+ Makrophagen funktionell divergierende Teilmengen darstellen und funktional analog zu CCR2sind - und CCR2+ Makrophagen im Mausherz. Human CCR2- Makrophagen drücken robuste Wachstumsfaktoren aus, einschließlich IGF1, PDGF, Cyr61 und HB-EGF. CCR2+ Makrophagen sind in Chemokine und Zytokine angereichert, die Entzündungen fördern, wie IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 und TNF-a. Stimulierte CCR2+ Makrophagen sekrese deutlich höhere Konzentrationen des entzündlichen Zytokininterleukin-1s (IL-1) in der Kultur ab. Wie diese Teilmengen differenziell zur Gewebereparatur und zur linksventrikulären (LV) Umgestaltung im Zusammenhang mit Herzverletzungen beitragen, bleibt ein Bereich aktiver Forschung.
Die strömungszytometriebasierte Analyse der Makrophagenheterogenität in der Maus und im menschlichen Herzen erfordert die Verdauung des Herzgewebes und die Erzeugung einer einzelzelligen Suspension, gefolgt von einer zytometrischen Durchflussanalyse oder Zellsortierung für weitere nachgelagerte Prozesse wie Massen-RNA-Sequenzierung/Einzelzell-RNA-Sequenzierung oder Kultivierung der Zellen für funktionelle Assays. Das ursprüngliche Protokoll zur Herstellung einer Einzelzellsuspension aus murinen Herzen wurde zuerst von der Nahrendorf-Gruppe in Nahrendorf et al. 200710berichtet. Unser Labor hat das Protokoll angepasst und modifiziert, um Makrophagen aus dem menschlichen Myokard zu extrahieren. Mit dem gleichen Protokoll, aber mit leichten Modifikationen im Färbe- und Gatingschema, können auch CD45- Stromalzellen aus dem menschlichen Myokard geerntet werden. Hier, in Text und Video, wird ein Protokoll vorgestellt, das routinemäßig für die Extraktion von Makrophagen oder Stromal aus dem menschlichen Myokard durchgeführt wird.
Herzgewebeproben werden von erwachsenen Patienten mit erweiterter Kardiomyopathie (DCM: idiopathisch oder familiär) oder ischämischer Kardiomyopathie (ICM) gewonnen, die sich einer linksventrikulären Assist-Einrichtung (LVAD) implantation oder einer Herztransplantation unterziehen. Explantierte Herzen oder LVAD-Kerne werden vor Beginn des Verdauungsverfahrens intravaskulär mit kalter Saline durchdrungen. Es ist wichtig zu beachten, dass die "Qualität" der Gewebeprobe, die in Bezug auf den Grad der Narbenbildung oder der Infiltration von Fettgewebe bestimmt wird, die Ausbeute von Makrophagen stark beeinflussen kann. Herzproben mit großen Narbenflächen haben eine viel geringere Zellausbeute und können schwerwiegende technische Einschränkungen darstellen, wenn gewünschte nachgelagerte Analysemethoden eine In-vitro-Zellkultivierung erfordern.
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Protocol
Das vorgelegte Protokoll wurde von der Washington University in St. Louis Institutional Review Board (#201305086) genehmigt. Alle Probanden geben vor der Probenentnahme eine informierte Einwilligung ab, und die Experimente werden in Übereinstimmung mit dem genehmigten Studienprotokoll durchgeführt. Das vorgestellte Protokoll wird mit Zustimmung des Institutional Animal Care and Use Committee an der Washington University School of Medicine durchgeführt und folgt den Richtlinien, die im NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren beschrieben sind.
1. Vorbereitung menschlicher Herzgewebeproben
- Spülen Sie explantierte Herzen durch Konserven der linken und rechten koronaren Arterie Ostia und durchdringen sie mit 200 ml kalter Saline.
- Spülen Sie LVAD-apikal entkernte Gewebe, indem Sie ein Epikardialgefäß cannulating und mit 50 ml kalter Saline durchdringen.
- Sezieren Sie Gewebeproben von der apikalen oder seitlichen Wand des linken Ventrikels in kalter Saline oder HBSS mit einer sterilen Schere.
- Sezieren Sie sorgfältig epikardiales Fett und Chordaetendineae aus der Probe mit feiner Schere.
- Sezieren Sie Gewebestücke in Stücke mit einem Gewicht von etwa 200 mg mit Hilfe einer sterilen Klinge oder Schere.
2. Vorbereitung des Mausherzes
- Euthanisieren Sie die Maus durch CO2-Erstickung oder Zervixdislokation.
- Öffnen Sie die Brusthöhle mit Hilfe einer scharfen Schere. Verwenden Sie stumpfe Hämostate, um das Herz nach oben zu heben. Durchnässen Sie das Herz mit kaltem PBS mit einer 25 G Nadel, die an einer 5 ml Spritze befestigt ist. Durchdringen, bis das Herz in Farbe blanchiert erscheint.
- Entfernen Sie das Herz und legen Sie es in eine sterile Petrischale auf Eis.
3. Vorbereitung der Einzelzellsuspension
- Legen Sie menschliche Herzgewebebrocken (ca. 200 mg) oder murines Herz in eine sterile Petrischale. Das Gewebe mit einer sterilen Klinge oder Schere fein zerkleinern.
- Richten Sie die Verdauungen ein:
- Verwenden Sie ein endgültiges Verdauungsvolumen von 3 ml pro menschlichem Herzgewebebrock (200 mg) oder pro einem murinen Herzen. Die endgültigen Enzymkonzentrationen sind wie folgt: Collagenase1 (450 U/ml), DNase1 (60 U/ml), Hyaluronidase (60 U/ml).
- Für jede Verdauungsreaktion DMEM und alle Enzyme in ein 15 ml konisches Rohr geben. Mit Hilfe sauberer Zangen das fein gehackte Gewebe in jedes Reaktionsrohr legen. Durch sanftes Wirbeln gut mischen.
- 1 h bei 37 °C in einem Schüttelinkubator auf eine niedrige bis mittlere Rührgeschwindigkeit aufwerten.
- Nach 1 h Verdauung die Schläuche aus dem Brutkasten nehmen und auf Eis legen. Richten Sie 50 ml konische Röhren mit einem 40 m Zellsieb obendrauf ein. Befeuchten Sie die Filter mit 2 ml Enzymdeaktivierungspuffer (ED).
- Deaktivieren Sie die Verdauungsenzyme, indem Sie jedem Verdauungsröhrchen 8 ml ED-Puffer hinzufügen. Dann gießen Sie die resultierende 13 ml Gesamtmischung durch das 40 m Zellsieb in die 50 ml konischen Röhren. Die Proben in einem frischen 15 ml konischen Rohr zurückgeben. Dies ermöglicht eine optimale Zellpelletierung und minimiert den Zellverlust während der Zentrifugation.
- Drehen Sie die Proben bei 400 x g für 6 min (Zentrifuge auf 4 °C eingestellt). Entsorgen Sie den Überstand und lassen Sie 0,5 ml Medien übrig. Setzen Sie das Zellpellet durch sanftes Pipettieren wieder auf und fügen Sie 1 ml ACK-Lysepuffer hinzu. Wirbeln Sie das Rohr sanft und brüten Sie bei Raumtemperatur für 5 min, um rote Blutkörperchen (RBC) Lyse durchzuführen.
- Nach 5 min im ACK-Puffer 9 ml DMEM zur Probe hinzufügen. Setzen Sie den Deckel wieder auf die Rohre und kehren Sie die Rohre vorsichtig um, um sie zu mischen, und filtern Sie durch ein 40 m großes Zellsieb. Sammeln Sie das Filtrat in 15 ml konischen Rohren.
- Zentrifugieren Sie die Rohre bei 400 x g für 6 min und entsorgen Sie den Überstand.
- Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer hinzu und setzen Sie das Pellet wieder auf. Dann in den Zellen im FACS-Puffer in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen. Zentrifuge wieder bei 400 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 100 l FACS Buffer wieder auf. Eine Einzelzellsuspension ist nun bereit für die Antikörperfärbung.
4. Antikörperfärbung
- Ein typisches menschliches Antikörper-Panel besteht aus folgenden Antikörpern: CD45-PercpCy5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. Siehe Tabelle 1. Fügen Sie alle Antikörper zu den Herzproben bei 1:50 Verdünnung hinzu und brüten Sie für 30-40 min bei 4 °C im Dunkeln. Fahren Sie mit Schritt 4.4 weiter.
- Für stromale Zellen (Endothelzellen, Fibroblasten, glatte Muskelzellen) fügen Sie DRAQ5 (1 M Endkonzentration) und CD45-percpCy5.5 hinzu. Siehe Tabelle 1. 30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren. Fahren Sie mit Schritt 4.4 weiter.
- Für murine Herzmakrophagen fügen Sie die folgenden Antikörper hinzu: CD45-PercpCy5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421 und Ly6G-FITC. Siehe Tabelle 2. Fügen Sie alle Antikörper zu den Herzproben bei 1:100 Verdünnung hinzu und brüten Sie für 30-40 min bei 4 °C im Dunkeln. Fahren Sie mit Schritt 4.4 weiter.
- Waschen Sie die Proben zweimal im FACS-Puffer. Für jede Wäsche 1 ml FACS-Puffer, sanftwirbeln und Zentrifugen bei 400 x g für 5 min hinzufügen, in 350 l FACS-Puffer resuspendieren und DAPI (1 M, Endkonzentration) hinzufügen. Die Proben sind nun für die FACS-Analyse/-sortierung bereit.
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Representative Results
Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Isolierung von Makrophagen von Maus und menschlichem Myokard. Mit dem gleichen Protokoll, aber mit einer anderen Färbe- und Gating-Strategie, können Stromalzellen auch aus dem menschlichen Myokard geerntet werden. Die hier vorgestellten FACS-Ergebnisse wurden entweder auf der Plattform BD LSRII oder BD FACS ARIA III erworben. Kompensationskontrollen wurden aus einzelnen Farbkontrollproben von gebeizten Splenozyten generiert. Abbildung 1 zeigt unverarbeiteten und verarbeiteten menschlichen LVAD-Kern. Abbildung 2 zeigt das Gating-Schema für die Durchflusssortierung von CCR2- und CCR2+ humanen Makrophagen. Abbildung 3A zeigt das Gating-Schema für CD45- Stromalzellen aus humanem Myokard und Abbildung 3B zeigt Bilder von Wright-gefärbten FACS-sortierten CD45+ und CD45-Zellen. Abbildung 4 beschreibt das Gating-Schema zum Sortieren von Makrophagen aus einem Mausherz.
Abbildung 1: Der menschliche LVAD-Gewebekern vor und nach der Verarbeitung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Flusszytometrie-Gating-Schema zur Identifizierung und Charakterisierung von kardialen Makrophagenpopulationen in erweiterten Kardiomyopathie-Proben (DCM) oder ischämischer Kardiomyopathie (ICM). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Flusszytometrie-Gating-Schema, um CD45- und CD45+ Stromalzellen aus menschlichen Proben zu isolieren. (A) Flow Cytometry Gating Schema verwendet, um CD45 zu isolieren- stromal encells from human ischeic cardiomyopathy (ICM) or dilated cardiomyopathy (DCM) proben. (B) Wright gebeizt FACS sortiert CD45- und CD45+ Zellen. Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Flusszytometrie-Gating-Schema, um verschiedene Makrophagen-Teilmengen aus dem Mausherz zu isolieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Antigen | Fluorophor | Klon | Hersteller |
| CD45 | PercpCy5.5 | 2D1 | Biolegend |
| CD64 | Fitc | 10.1 | Biolegend |
| CD14 | Pe | M5E2 | Biolegend |
| CCR2 | APC oder BV421 | K036C2 | Biolegend |
| MHCII | APC/Cy7 | L243 | Biolegend |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | ||
| Dapi | Thermo Fisher |
Tabelle 1: Antikörper-Panel für humane Myokardproben.
| Antigen | Fluorophor | Klon | Hersteller |
| CD45 | PercpCy5.5 | 30-F11 | Biolegend |
| CD64 | Apc | X54-5/7.1 | Biolegend |
| Ly6G | PE/Cy7 | 1A8 | Biolegend |
| Ly6C | Fitc | HK1.4 | Biolegend |
| CCR2 | BV421 | SA203G11 | Biolegend |
| MHCII | APC/Cy7 | M5/114.15.2 | Biolegend |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | ||
| Dapi | Thermo Fisher |
Tabelle 2: Antikörper-Panel für Mausherz-Probe.
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Discussion
Das Protokoll ermöglicht die Extraktion verschiedener Makrophagen-Teilmengen aus humanem Myokard. Das Protokoll ist einfach und dauert 3 bis 4 Stunden, um einzellige Suspension bereit für FACS-Analyse vorzubereiten. Obwohl das Protokoll relativ einfach durchzuführen ist, gibt es einige technische Aspekte, die berücksichtigt werden müssen, die die Variabilität minimieren. Erstens ist eine zeitnahe Arbeit mit menschlichem Gewebe für eine optimale Zelllebensfähigkeit notwendig. Es ist wichtig, das Gewebe in kalter Saline/HBSS zu halten, um den Zelltod zu minimieren. Es ist auch notwendig, Epikardialfett und anderes Bindegewebe aus der Myokardprobe zu entfernen. Konsistente Gewebeschnitt- und Verdauungszeiten reduzieren die Proben- auf die Probenvariation.
Es gibt sowohl Intra-Assay- als auch Inter-Assay-Variabilität in Gewebeverdauungen und nachfolgenden Zellerträgen. Dies ist eine der Einschränkungen bei der Vorbereitung einer einzelzelligen Suspension aus Geweben. Der wichtigste Weg, dies zu minimieren, besteht darin, sicherzustellen, dass Enzyme relativ neu sind, richtig aliquoted sind und bei -80 °C gespeichert werden. Aliquots sollten nur einmal verwendet werden und nicht wieder gespeichert oder eingefroren werden. Enzyme verwendet werden empfindlich auf Tauwetterzyklen einfrieren. Eine weitere Überlegung ist die Temperatur der Verdauung und Schüttelgeschwindigkeit. Die Verwendung eines thermostatgesteuerten Shakers, der Wärme gleichmäßig verteilt, trägt dazu bei, die Verdauungsvariabilität zu minimieren und die Zelllebensfähigkeit zu verbessern.
Es ist wichtig zu erwähnen, dass die absolute Ausbeute von Makrophagen aus humanem Myokard im Allgemeinen nicht sehr hoch ist. In der Regel variiert die Zellausbeute von 20.000 bis 50.000 Makrophagen pro 1.200-1.500 mg Gewebe. Dies wird eine Herausforderung, wenn die gewünschte nachgelagerte Analysemethode Zellkultur-Assays beinhaltet. Phagozytose, Chemokin/Zytokin-Produktion, Zellstimulation, Morphometrie und Genexpressionsanalysen (Mikroarray, Massen-RNA-Sequenzierung und einzellige RNA-Sequenzierung) können leicht durchgeführt werden. Die Qualität des Gewebes bestimmt auch die einfache Verdauung und die anschließende Zellausbeute. Wenn das Gewebe faserig und vernarbt ist, ist die Verdauungseffizienz suboptimal, und die Makrophagenausbeute ist wahrscheinlich sehr gering.
Ein weiterer Aspekt zu berücksichtigen ist, dass Myokardgewebe Verdauung führt zu erheblichen Trümmerbildung. Dadurch erscheint das Pellet locker. Daher muss man aufpassen, dass man den Überstand nicht während der Waschschritte durch einfaches Dekantieren verwerfen sollte. Die Verwendung eines Saug-/Vakuumabfallsammelkolbens mit einer Pasteur-Pipette zur Erfassung des Überstandes ist ratsam. Auch die Aufrechterhaltung der Zentrifuge bei 4 °C trägt dazu bei, den Zelltod und den Probenverlust zu minimieren.
Obwohl dieses Protokoll eine Möglichkeit beschreibt, Makrophagen aus menschlichen Myokardgewebeproben zu extrahieren, kann eine erfolgreiche Isolierung von Makrophagen-Teilmengen auch von Mausherzen ohne signifikante Änderungen oder Modifikationen erreicht werden.
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Disclosures
Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Möglich wurde dieses Projekt durch Fördermittel des Children es Discovery Institute der Washington University und des St. Louis Children es Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), der Foundation of Barnes-Jewish Hospital (8038-88) und des NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. wird von NIH K08 HL123519 und Burroughs Welcome Fund (1014782) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petri dishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
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