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Developmental Biology

प्राथमिक न्यूरॉन्स में Neurite आउटवृद्धि के अध्ययन के लिए एक बढ़ी हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित परख

Published: October 19, 2019 doi: 10.3791/60031
Automatic Translation
*1, *1,2, *1, 1
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong Special Administrative Region, 2Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen
* These authors contributed equally

Summary

इस रिपोर्ट में, हम EGFP और ब्याज के प्रोटीन के साथ सह-transfecting द्वारा भ्रूण चूहे cortical न्यूरॉन्स में neurite वृद्धि का अध्ययन करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन.

Abstract

न्यूराइट आउटग्रोथ तंत्रिका तंत्र के विकास के दौरान तंत्रिका सर्किट के गठन में एक मौलिक घटना है। गंभीर न्यूराइट क्षति और synaptic रोग विभिन्न neurodegenerative रोगों और उम्र से संबंधित अध: पतन में होते हैं. तंत्र है कि neurite वृद्धि को विनियमित की जांच न केवल मस्तिष्क विकास प्रक्रियाओं पर मूल्यवान प्रकाश डाला जाएगा, लेकिन यह भी इस तरह के मस्तिष्क संबंधी विकारों पर. कम transfection दक्षता के कारण, यह वर्तमान में प्राथमिक स्तनधारी न्यूरॉन्स में neurite outgrowth पर एक विशिष्ट प्रोटीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण है. यहाँ, हम EGFP और ब्याज की एक प्रोटीन (POI) के साथ प्राथमिक चूहे cortical न्यूरॉन्स के सह-परिवर्तन द्वारा neurite वृद्धि की जांच के लिए एक सरल विधि का वर्णन. इस विधि EGFP संकेत के माध्यम से POI transfected न्यूरॉन्स की पहचान की अनुमति देता है, और इस प्रकार neurite outgrowth पर POI के प्रभाव ठीक निर्धारित किया जा सकता है. इस EGFP आधारित परख neurite आउटवृद्धि को विनियमित रास्ते की जांच के लिए एक सुविधाजनक दृष्टिकोण प्रदान करता है.

Introduction

Neurites, दोनों axons और dendrites सहित, तंत्रिका नेटवर्क की स्थापना में शामिल न्यूरॉन्स से अनुमानों रहे हैं. तंत्रिका विकास के लिए न्यूराइट की गतिशील वृद्धि आवश्यक है। हालांकि, नीचे अंतर्निहित नियामक तंत्र स्पष्ट नहीं है। विशेष रूप से, न्यूराइट क्षति अक्सर विभिन्न neurodegenerative रोगों में और मस्तिष्क की चोटों के बादमनाया जाता है 1. इसलिए, विभिन्न न्यूराइट आउटग्रोथ नियामक रास्ते में putative अणुओं की भूमिका की जांच प्रक्रिया की हमारी समझ में सुधार होगा. इसके अलावा, यह विभिन्न न्यूरोलॉजिकल विकारों के लिए उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्य प्रकट कर सकते हैं. तंत्रिका कोशिका रेखाएं तंत्रिका प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान मॉडल हैं जिनमें न्यूराइट आउटग्रोथ भी शामिल है क्योंकि उनमें हेरफेर और ट्रांसफेक्ट2,3में आसानी होती है . तथापि, आनुवंशिक बहाव कुछ सामान्य रूप से प्रयुक्त कोशिका लाइनों में होने की सूचना मिली है, जो उनकी शारीरिक प्रतिक्रियाओं में बदलाव का कारण बन सकतीहै 4. इसके अलावा, अंतर प्रोटीन अभिव्यक्ति न्यूरॉन सेल लाइनों और प्राथमिक न्यूरॉन्स के बीच दिखाया गया है. उदाहरण के लिए, पीसी 12, चूहे अधिवृक्क ग्रंथि से व्युत्पन्न एक न्यूरोनल सेल लाइन जो व्यापक रूप से न्यूराइट आउटग्रोथ2,3, NMDA रिसेप्टर्स5व्यक्त नहीं करता है के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है। इसके अलावा, यह प्रस्ताव किया गया है कि प्राथमिक न्यूरॉन्स की तुलना में neurotoxins के लिए माउस neuroblastoma लाइन neuro-2a की कम प्रतिक्रिया कुछ झिल्ली रिसेप्टर्स और आयन चैनलों की अभिव्यक्ति की कमी के कारण है6. इसलिए, प्राथमिक न्यूरॉन्स neurite वृद्धि की जांच के लिए एक अधिक वांछनीय और प्रतिनिधि मॉडल हैं. हालांकि, प्राथमिक न्यूरॉन्स का उपयोग उनके कम transfection दक्षता7द्वारा बाधित है.

यहाँ, हम एक विधि है कि ब्याज के प्रोटीन के सह संक्रमण शामिल का वर्णन (POI) और प्राथमिक चूहे cortical न्यूरॉन्स के लिए EGFP. EGFP सफलतापूर्वक transfected न्यूरॉन्स की पहचान के लिए एक रूपात्मक मार्कर के रूप में कार्य करता है और neurites की माप परमिट. हमने इस विधि को उन यौगिकों/अणुओं का उपयोग करके मान्य किया है जिनकी सूचना न्यूराइट आउटग्रोथ को मॉड्युलेट करने के लिए सूचित की गई है। इसके अलावा, FE65, एक न्यूरॉन एडेप्टर प्रोटीन है कि neurite वृद्धि को प्रोत्साहित करने के लिए दिखाया गया है, इस दृष्टिकोण को समझाने के लिए इस्तेमाल किया गया था8,9. इस प्रोटोकॉल शामिल है (1) भ्रूण दिन से प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स के अलगाव 18 (E18) चूहे भ्रूण, (2) EGFP और POI के साथ न्यूरॉन्स के सह-परिवर्तन (इस अध्ययन में FE65) और (3) इमेजिंग और छवि प्रसंस्करण का उपयोग करके न्यूरॉन्स के विश्लेषण NeuronJ प्लगइन10,11के साथ सॉफ्टवेयर ImageJ .

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं का पालन हांगकांग के चीनी विश्वविद्यालय के पशु प्रयोग नैतिकता समिति के नैतिक मानकों के अनुसार थे.

1. कवरलिप्स की तैयारी

  1. एक बाँझ 18 मिमी परिपत्र कवरपर्ची एक 12 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में रखें.
  2. कम से कम 1 ज के लिए एक आर्द्र ीकृत 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5 डिग्री/एमएल पॉली-डी-लाइसिन समाधान के साथ कवरस्लिप को कोट करें।
  3. ऊतक संस्कृति प्लेट से पॉली-डी-लाइसिन समाधान को प्रेरित करें और बाँझ पानी के साथ एक बार लेपित कवरलिप्स को कुल्ला करें।

2. चूहा भ्रूण तंत्रिका विच्छेदन

  1. या तो ग्रीवा अव्यवस्था या सीओ2 asphyxiation द्वारा 18 दिन (E18) की एक गर्भावधि उम्र में एक समय पर गर्भवती Sprague-Dawley चूहे बलिदान.
    नोट: गर्भवती चूहों के बलिदान के लिए स्थानीय नियमों की जाँच करें.
  2. गर्भवती चूहे के पेट की गुहा को कैंची से काट कर 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  3. गर्भाशय और एमनियोटिक थैली को छोटे विच्छेदन कैंची से सावधानी से खोलें और छोटे विच्छेदन कैंची का उपयोग करके चूहे के भ्रूण से प्लेसेंटा को हटा दें। ग्लूकोज (पीबीएस-ग्लूकोज, 10 एमएम सोडियम फॉस्फेट, 2.68 एमएम पोटेशियम क्लोराइड, 140 एमएम सोडियम क्लोराइड और 3 जी/एल ग्लूकोज) के साथ पूरे भ्रूण को 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  4. खोपड़ी के सैगिटल सीवन के साथ कट और छोटे विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी के साथ इसे ध्यान से खोलें। एक छोटे से फ्लैट spatula के साथ भ्रूण मस्तिष्क स्थानांतरण बर्फ ठंडा पीबीएस-ग्लूकोज के साथ एक 10 सेमी पेट्री डिश के लिए.
  5. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत दो #5 tweezers का उपयोग कर सेरिबैलम और मस्तिष्क स्टेम से दो मस्तिष्क गोलार्द्धों अलग.
    नोट: कृपया चूहे मस्तिष्क की संरचना के लिए संदर्भ12 देखें.
  6. #5 च्नेकाओं का उपयोग कर meninges निकालें.
  7. दो सीधे #5 चमटी के साथ सेरेब्रल गोलार्द्धों से प्रांतस्था अलग.
  8. एक 15 एमएल अपकेंद्रण ट्यूब में बर्फ ठंडा पीबीएस-ग्लूकोज के लिए अलग प्रांतस्था स्थानांतरण.

3. प्राथमिक Cortical न्यूरोन संस्कृति

नोट: चरण 3 और 4 में सभी प्रक्रियाओं एक द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर प्रदर्शन कर रहे हैं.

  1. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर गुरुत्वाकर्षण द्वारा अलग प्रांतस्था बसाएं और पीबीएस-ग्लूकोज को प्रेरित करें।
  2. अलग प्रांतस्था के लिए 0.05% Trypsin-EDTA के 1 एमएल जोड़ें और दोहन और एंजाइमी पाचन की अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में ऊतक incubate द्वारा धीरे मिश्रण. हर 2 मिनट मिश्रण करने के लिए धीरे ट्यूब टैप करें।
  3. रखरखाव माध्यम के 4 एमएल जोड़ें (उदा., Neurobasal मध्यम) ऊतक /
    नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सभी रखरखाव माध्यम पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और बी-27 पूरक13के साथ पूरक है।
  4. 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके त्रितुरण द्वारा ऊतक को धीरे से अलग करें।
  5. 5 मिनट के लिए 200 x g पर centrifugation द्वारा अलग कोशिकाओं को गोली.
  6. चरणों को दोहराएँ 3.5 से 3.7 दो बार.
  7. रखरखाव माध्यम के 1 एमएल में सेल गोली को पुन: निलंबित करें।
  8. एक हेमोसाइटोमीटर द्वारा व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती के लिए सेल निलंबन के 10 डिग्री सेल्सियस के लिए 0.4% Trypan ब्लू समाधान के 10 $L जोड़ें।
  9. एक 12 अच्छी तरह से प्लेट में अच्छी तरह से रखरखाव माध्यम के 1 एमएल में 65,000 डिग्री सेमी2 (व्यवहार्य कोशिकाओं) के घनत्व पर न्यूरॉन्स प्लेट.

4. सेल ट्रांसेक्शन और फिक्सेशन

  1. इन विट्रो (DIV2) में 2 दिनों में, ईजीएफपी निर्माण (पीईजीएफपी-सी 1) के ट्रांसफेक्ट 0.5 डिग्री ग्राम न्यूरॉन्स के साथ या तो 0.5 डिग्री पी ओ आई के बिना ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक के 1 $L का उपयोग करके (उदाहरण के लिए, लिपोफेक्टैमाइन 2000)। निर्माता के निर्देशों का उपयोग करें.
    नोट: मैमली अभिव्यक्ति निर्माण एक एंडोटॉक्सिन मुक्त प्लाज्मिड तैयारी किट का उपयोग करके तैयार किए गए थे। रसायनों/अणुओं के साथ उपचार (इस पांडुलिपि साइटोचलसिन डी (साइटो डी) और तंत्रिका विकास कारक (एनजीएफ) में उपयोग किया गया था) ट्रांसफेक्शन के बाद 6 एच पर किया जा सकता है।
  2. संस्कृति माध्यम 24 एच पोस्ट-ट्रांसफेक्शन को प्रेरित करें और ट्रांसफेक्ड कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस (10 एमएम सोडियम फॉस्फेट, 2.68 एमएम पोटेशियम क्लोराइड, 140 एमएम सोडियम क्लोराइड) के साथ एक बार धो लें।
  3. कमरे के तापमान पर अंधेरे में 10 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
  4. निश्चित कोशिकाओं को पीबीएस से तीन बार धो लें।
  5. एक माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड पर फ्लोरोसेंट बढ़ते मध्यम की एक न्यूनतम राशि जोड़ें। कांच स्लाइड का सामना कर रहे नमूने के साथ बढ़ते माध्यम पर 12-वेल प्लेट से कवरस्लिप को सावधानी से स्थानांतरित करें।
    नोट: अगर एक जलीय बढ़ते माध्यम का उपयोग किया जाता है तो नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के किनारे को सील करें।

5. न्यूराइट आउटग्रोथ का मापन

  1. एक epi-fluorescent माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों पर कब्जा करने के लिए एक 40x उद्देश्य का प्रयोग करें.
  2. ट्रांसफेक्शन प्रति EGFP संकेत के साथ कम से कम 40 बरकरार न्यूरॉन्स से छवियों पर कब्जा.
  3. NeuronJ प्लगइन11 के साथ ImageJ सॉफ्टवेयर में कब्जा कर लिया छवि खोलें सबसे लंबे समय तक neurite की लंबाई को मापने के लिए, सेल शरीर से विकास शंकु की नोक करने के लिए, प्रत्येक छवि वाले न्यूरॉन की.
  4. neurite आउटग्रोथ में लक्षित प्रोटीन के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए सॉफ्टवेयर के साथ प्राप्त डेटा का विश्लेषण करें।

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Representative Results

इस पद्धति का परीक्षण करने के लिए, हमने साइटो डी और तंत्रिका वृद्धि कारक एनजीएफ का उपयोग किया, जो क्रमशः14,15,16को बाधित और प्रोत्साहित करने के लिए दिखाया गया है. न्यूरॉन्स के neurite लंबाई EGFP के साथ transfected Cyto डी या NGF के साथ उपचार के बाद मापा गया. न्यूरॉन्स के लिए EGFP के transfection दक्षता 2.7% (1,068 न्यूरॉन्स गिना गया था). जैसा कि चित्र 1एमें दिखाया गया है, साइटो डी ने एक खुराक-निर्भर तरीके से न्युराइट एक्सटेंशन को दबा दिया। इसके विपरीत, एनजीएफ (चित्र 1ठ)के साथ उपचारित न्यूरॉन्स में न्यूराइट वृद्धि को प्रबल किया गया था।

अगले, हम न्यूरोनल एडेप्टर FE65 transfecting द्वारा इस प्रणाली की उपयोगिता की जांच की, जो neurite वृद्धि को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है. प्राथमिक चूहे cortical न्यूरॉन्स FE65 और EGFP के साथ सह transfected थे. कम transfection दक्षता के बावजूद, इम्यूनो-fluorscence विश्लेषण से पता चला कि न्यूरॉन्स के 80% से अधिक सफलतापूर्वक EGFP और FE65 के साथ सह-transfected थे (चित्र 2ए). पिछलीरिपोर्टों कीतरह ही 8,9, एफई 65 ने न्यूराइट की वृद्धि को 2x (चित्र 2ख) से काफी प्रेरित किया था । हम भी पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा अलग अलग समय अंक पर EGFP और FE65 की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया. जैसा कि चित्र 2गमें दिखाया गया है, ईजीएफपी और एफई65 क्रमशः 6 ज और 12 एच पोस्ट-ट्रांसफेक्शन पाए गए। प्रोटीन की इसी तरह की अभिव्यक्ति के स्तर में मनाया गया 1 d करने के लिए 7 डी के बाद transfection न्यूरॉन्स. यह इंगित करता है कि न्यूराइट आउटग्रोथ का विश्लेषण 6 एच पोस्ट-ट्रांसफेक्शन या अधिक परिपक्व न्यूरॉन्स में किया जा सकता है। साथ में, इस डेटा का सुझाव है कि उल्लेख प्रोटोकॉल शास्त्रीय transfection द्वारा putative neurite आउटग्रोथ नियामक प्रोटीन की भूमिका का निर्धारण करने के लिए उपयुक्त है.

हम भी FE65 प्लाज्मिड डीएनए के विभिन्न मात्रा के साथ प्राथमिक चूहे cortical न्यूरॉन्स transfecting द्वारा neurite आउटग्रोथ पर जीन खुराक के प्रभाव की निगरानी की. जैसा कि चित्र 2डीमें दिखाया गया है, न्यूराइट एक्सटेंशन में खुराक-निर्भर वृद्धि 0 - 0.5 ग्राम से FE65 द्रव्यों के डीएनए में देखी गई थी। तथापि, न्यूरॉनों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था जो या तो 0ण्5 ग्राम अथवा प्लाज्मिड डीएनए का 1 डिग्री ग्राम (चित्र 2ड) के साथ ट्रांसफेक्टेड होता है।

Figure 1
चित्र 1: न्यूराइट आउटग्रोथ साइटो डी और एनजीएफ द्वारा संग्राहक है। E18 चूहा cortical न्यूरॉन्स एक EGFP अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ DIV2 पर transfected थे. 6 ज पोस्ट-ट्रांसफेक्शन, कोशिकाओं के साथ इलाज किया गया (ए) 0-0.5 ग्राम/एमएल साइटो डी या (बी) 0-100 एनजी / फिर न्यूरॉन्स तय कर रहे थे और तदनुसार छवि. छवियाँ 40x उद्देश्य के साथ कब्जा कर लिया गया एक epi-fluorscence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर और विकास शंकु की नोक करने के लिए सेल शरीर से सबसे लंबे समय तक neurite की लंबाई NeuronJ प्लगइन के साथ ImageJ का उपयोग करके मापा गया था. तीन स्वतंत्र प्रयोगों प्रदर्शन किया गया और कम से कम 40 न्यूरॉन्स प्रत्येक समूह में मापा गया. बार चार्ट मतलब neurite लंबाई में गुना परिवर्तन दिखाया. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए अयुग्मित टी-परीक्षण अपनाया गया था। *पी एंड एलटी; 0.001, * *पी और एलटी; 0.05. त्रुटि पट्टियाँ - S.E.M. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: FE65 न्यूराइट आउटग्रोथ को उत्तेजित करता है। E18 चूहा cortical न्यूरॉन्स या तो खाली वेक्टर नियंत्रण (EV) या FE65 एक EGFP अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ साथ DIV2 पर transfected थे. कोशिकाओं को स्थिर किया गया और ट्रांसफेक्शन के बाद 24 एच की छवि की गई। (ए) ट्रांसफेक्टेड न्यूरॉन्स को एंटी-एफई65 एंटीबॉडी के साथ प्रति-द-ड-फेसड किया गया था और ईजीएफपी या एफई65 के साथ कोशिकाओं की संख्या तथा ईजीएफपी + एफई65 सह-ट्रांसफेक्टेड की गणना की गई थी। तीन स्वतंत्र प्रयोग किए गए और प्रत्येक प्रयोग में कम से कम 100 कक्षों की गणना की गई. डेटा EGFP और EGFP + FE65 संकेतों के साथ कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किए गए थे. * पी एंड एलटी; 0.001. त्रुटि सलाखों - एस.डी. (बी) विकास शंकु की नोक करने के लिए सेल शरीर से सबसे लंबे समय तक neurite की लंबाई NeuronJ प्लगइन के साथ ImageJ का उपयोग करके मापा गया था. प्रतिनिधि न्यूरॉन छवियों सही पैनल में दिखाया गया. FE65 एक बकरी विरोधी FE65 एंटीबॉडी द्वारा दाग के रूप में वर्णित8,17था . तीन स्वतंत्र प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया और कम से कम 40 न्यूरॉन्स transfection प्रति मापा गया. बार चार्ट मतलब neurite लंबाई में गुना परिवर्तन दिखाया. अयुग्मित टी-परीक्षण द्वारा डेटा का विश्लेषण किया गया था। * पी एंड एलटी; 0.001. त्रुटि सलाखों ] S.E.M. स्केल बार $ 10 डिग्री m. (C) EGFP और FE65 के स्तर की अभिव्यक्ति के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के रूप में संकेत दिया पोस्ट-रूपांतरण समय बिंदुओं पर. EGFP और FE65 माउस विरोधी GFP और विरोधी myc द्वारा पाया गया (FE65 सी-टर्मिनल myc टैग करने के लिए), क्रमशः. (घ)न्यूरॉन्स की औसत न्यूराइट लंबाई, जैसा कि दर्शाया गया है, एफई65 प्लाज्मिड डीएनए की विभिन्न मात्रा में ट्रांसफेक्टेड होता है। सांख्यिकीय विश्लेषण Bonferroni पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ एक तरह से ANOVA परीक्षण का उपयोग किया गया. *पी एंड एलटी; 0.001, * *पी और एलटी; 0.05. त्रुटि पट्टियाँ ] S.E.M. स्केल बार ] 10 m. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

जैसा कि पहले कहा गया है, पीसी 12 और इसके सबक्लोन को न्यूराइट एक्सटेंशन का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से नियोजित किया जाता है क्योंकि उनके पास उत्कृष्ट ट्रांसफेक्शन दक्षता2,3है । इसके विपरीत, प्राथमिक न्यूरॉन्स एक कम transfection दर है, जो transfection7द्वारा neurite बहिर्विकास नियामकों का अध्ययन करने के लिए एक प्रमुख बाधा है. यहाँ, हम प्राथमिक न्यूरॉन्स में neurite वृद्धि की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सुविधाजनक प्रोटोकॉल का वर्णन. कम समग्र transfection दक्षता के बावजूद, ट्रांसफेक्टेड न्यूरॉन्स के 80% से अधिक सफलतापूर्वक दो प्रोटीन के साथ सह-transfected थे: FE65 और EGFP (चित्र 2ए). अतः ईजीएफपी लेबल न्यूरॉन्स का विश्लेषण करके, न्युराइट आउटग्रोथ पर FE65 का प्रभाव ठीक से निर्धारित किया जा सकता है (चित्र 2ठ)।

EGFP आधारित दृष्टिकोण का एक और लाभ वर्णित है कि इम्यूनोफ्लोरेसी धुंधला छोड़ा जा सकता है. टज 1 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग, एक न्यूरॉन-विशिष्ट वर्ग III -tubulin, व्यापक रूप से एक आकृतिविज्ञान मार्कर के रूप में कार्यरत है जब neurite दीर्घीकरण18,19,20,21का अध्ययन . टज 1 के अतिरिक्त, ट्रांसफेक्टेड न्यूरॉन्स19,22,23की पहचान के लिए पीओआई के दाग लगाना आवश्यक है . यह ज्ञात है कि इम्यूनोफ्लोरेसी धुंधला की स्थिरता, जो न्यूराइट आउटग्रोथ माप के लिए महत्वपूर्ण है, नमूना तैयारी और एंटीबॉडी24सहित कई कारकों से प्रभावित होती है। इसलिए, EGFP आधारित विधि की समग्र सादगी परख की सटीकता में सुधार कर सकता है.

हमारे प्रोटोकॉल में, न्यूरॉन्स neurite माप के लिए तय कर रहे हैं 24 एच के बाद transfection. इस प्रकार, न्यूरॉन्स 24 ज के लिए transfection अभिकर्मक के संपर्क में हैं. यह लंबे समय से ज्ञात है कि ट्रांसफेक्शन अभिकर्मककोशिकाओं 25को विषाक्त कर रहे हैं . यदि neurite विस्तार पर POI के प्रभाव DIV3 से परे निर्धारित करने की जरूरत है, ताजा मध्यम पुनःपूर्ति विषाक्तता को कम करने में मदद मिल सकती है. इसके अतिरिक्त, वैकल्पिक जीन वितरण विधियों पर विचार किया जा सकता है जैसे कै2+ फॉस्फेट सह-वर्षा और नाभिकता, दोनों को कोशिकाओं26पर कम विषाक्त प्रभाव दिखाई दिया जाता है। इसके अतिरिक्त, हम यहाँ दिखाते हैं कि न्यूराइट आउटवृद्धि पर FE65 का उच्चतम प्रभाव उस 0.5 डिग्री के साथ transfected न्यूरॉन्स में मनाया जाता है FE65 के और 0.5 g EGFP प्लाज्मिड का उपयोग करके 1 $L transfection अभिकारक. अन्य POIs के लिए, प्लाज्मिड डीएनए और ट्रांसफेलेशन अभिकर्मकों की इष्टतम मात्रा निर्धारित की जानी चाहिए क्योंकि प्रोटीन में व्यापक रूप से अलग-अलग कारोबार दरें हैं।

जीन वितरण विधि के अलावा, सेल घनत्व एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर पर विचार किया जाना है. यदि न्यूरॉन घनत्व बहुत अधिक है, यह neurites के मूल की पहचान के रूप में वे एक दूसरे के साथ ओवरलैप होगा मुश्किल हो जाता है. हालांकि एक कम घनत्व पर चढ़ाना कोशिकाओं इस मुद्दे को हल कर सकते हैं, प्राथमिक न्यूरॉन्स के अस्तित्व में काफी कम सेल घनत्व27पर कम हो जाएगा. प्राथमिक रैट हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स को 40,000 से 100,000/सेमी 228 के बीच घनत्व पर स्वस्थ रूप से विकसित करने के लिए दिखाया गया है . इस प्रोटोकॉल में, चूहे cortical न्यूरॉन्स के 65,000/cm2 का घनत्व प्रयोग किया जाता है. फिर भी, यह विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार के लिए उपयुक्त सेल घनत्व निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है.

चूहा प्राथमिक न्यूरॉन्स के विकास के न्यूराइट माप (यानी DIV3 न्यूरॉन्स) यहाँ वर्णित है. तथापि, अधिक परिपक्व न्यूरोनल फीनोटाइप्स DIV329से परे न्यूरॉन्स में देखा जा सकता है। परिपक्व न्यूरॉन्स में neurite विस्तार पर POIs या दवाओं के प्रभाव के रूप में विकासशील न्यूरॉन्स से अलग हो सकता है, विभिन्न चरणों से न्यूरॉन्स का उपयोग करके जांच एक अधिक व्यापक परिप्रेक्ष्य प्रदान करेगा. यह ध्यान देने योग्य है कि हम अभी भी न्यूरॉन्स में EGFP अभिव्यक्ति का निरीक्षण करने में सक्षम थे लायक है 7 डी के बाद transfection. यह परिपक्व न्यूरॉन्स में neurite वृद्धि पर POIs या दवाओं के अध्ययन की सुविधा हो सकती है.

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (HIPSC) व्युत्पन्न न्यूरॉन्स उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण की पहचान में मूल्यवान उपकरण हैं. उदाहरण के लिए, इन कोशिकाओं में न्यूराइट वृद्धि की जांच neuroregeneration में उपन्यास लक्ष्य प्रकट कर सकता है के रूप में HIPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के उपयोग प्रजातियों मतभेद से बचा जाता है. प्राथमिक कृंतक न्यूरॉन्स के समान, HIPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स30transfect करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं, जो EGFP और POI के सह संक्रमण दक्षता को कम कर सकते हैं. अतः पॉलीसिस्टिक स्तनधारी अभिव्यक्ति सदिशों का उपयोग यह सुनिश्चित कर सकता है कि सभी ट्रांसफेक्टेड कोशिकाएं ईजीएफपी और पीओआई सहित ट्रांसफेक्टेड जीनों के पूरे सेट को व्यक्त करती हैं। इसके अतिरिक्त, वैकल्पिक जीन वितरण विधियों, जैसे इलेक्ट्रोपोरेशन, ट्रांसफेलेशन दक्षता में सुधार कर सकते हैं। फिर, सेल व्यवहार्यता एक ऐसा मुद्दा है जिस पर इस तरह के जीन वितरण दृष्टिकोणों का उपयोग करते समय विचार किए जाने की आवश्यकता है।

यह ज्ञात है कि चूहे भ्रूण मस्तिष्क प्रांतस्था spiny स्टेलेट न्यूरॉन्स सहित न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार शामिल हैं, द्विध्रुवी न्यूरॉन्स और लंबे समय से प्रोजेक्ट न्यूरॉन्स31. हालांकि इस प्रोटोकॉल यहाँ कहा गया है neurite outgrowth पर POIs के सामान्य प्रभाव प्रकट कर सकते हैं, यह संभव है कि एक ही POI न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार में विभिन्न प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, मायोस्टैटिन संवेदी अक्षों की संख्या बढ़ाता है लेकिन मोटर एक्सॉन32की नहीं। ऐसे परिदृश्य में, प्रोटोकॉल का संशोधन आवश्यक है, जैसे प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा न्यूरॉन्स के विशिष्ट प्रकार के पूर्व अलगाव के रूप में. वैकल्पिक रूप से, विशिष्ट न्यूरॉन मार्कर एंटीबॉडी इमेजिंग के दौरान न्यूरॉन्स के आवश्यक प्रकार की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे इस लेख की सामग्री के साथ ब्याज की कोई विरोध नहीं है.

Acknowledgments

इस काम को अनुसंधान अनुदान परिषद हांगकांग, स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान कोष (हांगकांग), सीयूएचके प्रत्यक्ष अनुदान योजना, यूनाइटेड कॉलेज एंडोमेंट फंड और टीयूवाईएफ चैरिटेबल ट्रस्ट से धन द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 tweezers Regine 5-COB
18 mm Circle Cover Slips Thermo Scientific CB00180RA Sterilize before use
B27 Supplement Gibco 17504044
Cytochalasin D Invitrogen PHZ1063 Dissolved in DMSO
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
Dissecting Scissors, 10 cm World Precision Instruments 14393
Dissecting Scissors, 12.5 cm World Precision Instruments 15922
EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12362
Fluorescence Mounting Medium Dako S302380
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668019
Neurobasal Medium Gibco 21103049
NGF 2.5S Native Mouse Protein Gibco 13257019
Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip World Precision Instruments 504489
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
pEGFP-C1 Clontech #6084-1
pCI FE65 Please see references 8 and 15
PBS Tablets Gibco 18912014
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P7280
Spatula Sigma-Aldrich S4147
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300062
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 152 बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन ImageJ माइक्रोस्कोपी न्यूराइट आउटग्रोथ प्राथमिक न्यूरॉन्स transfection
प्राथमिक न्यूरॉन्स में Neurite आउटवृद्धि के अध्ययन के लिए एक बढ़ी हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित परख
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Chan, W. W. R., Li, W., Chau, D. L.… More

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