Summary
I denna rapport beskriver vi ett enkelt protokoll för att studera påverkar utväxt i embryonala råtta kortikala neuroner genom Co-transfecting med egfp och proteinet av intresse.
Abstract
Neurite utväxt är en grundläggande händelse i bildandet av neurala kretsar under nervsystemets utveckling. Svår neurit skador och synaptisk dysfunktion förekommer i olika neurodegenerativa sjukdomar och åldersrelaterade degeneration. Utredning av de mekanismer som reglerar påverkar utväxt skulle inte bara kasta värdefullt ljus över hjärnans utvecklingsprocesser utan också på sådana neurologiska sjukdomar. På grund av den låga transfektion effektivitet, det är för närvarande utmanande att studera effekten av ett specifikt protein på neurit utväxt i primära däggdjurs nervceller. Här beskriver vi en enkel metod för utredning av påverkar utväxt av co-transfektion av primära råtta kortikala neuroner med egfp och ett protein av intresse (POI). Denna metod gör det möjligt att identifiera POI transfekterade nervceller genom egfp signalen, och därmed effekten av POI på påverkar utväxt kan bestämmas exakt. Denna egfp-baserade analysen ger en bekväm metod för utredning av vägar som reglerar påverkar utväxt.
Introduction
Neuriter, inklusive både axoner och dendriter, är projektionerna från nervceller inblandade i inrättandet av neurala nätverk. Den dynamiska utväxten av neuriter är avgörande för neuroutveckling. De bakomliggande regleringsmekanismerna under förblir dock oklara. I synnerhet, neurit skador observeras ofta i olika neurodegenerativa sjukdomar och efter hjärnskador1. Därför, utredning av roller av förmodade molekyler i olika påverkar utväxt reglerings vägar skulle förbättra vår förståelse av processen. Dessutom kan det avslöja nya terapeutiska mål för olika neurologiska sjukdomar. Neuronala cellinjer är värdefulla modeller för att studera neuronala processer inklusive påverkar utväxt eftersom de är lätta att manipulera och transfect2,3. Emellertid, genetisk drift har rapporterats förekomma i vissa vanligen använda cellinjer, vilket kan leda till variationer i deras fysiologiska svar4. Dessutom, Differentiellt proteinuttryck har visats mellan neuronala cellinjer och primära nervceller. Till exempel, PC12, en neuronala cellinjer härrör från råtta binjurar som ofta används för att studera neurit utväxt2,3, inte uttrycker NMDA-receptorer5. Dessutom har det föreslagits att den minskade lyhördhet mus neuroblastom linje neuro-2A till neurotoxiner i jämförelse med primära nervceller beror på avsaknaden av uttryck för vissa membran receptorer och jonkanaler6. Därför, primära nervceller är en mer önskvärd och representativ modell för utredning av neurit utväxt. Emellertid, användningen av primära nervceller hindras av deras låga transfektion effektivitet7.
Här beskriver vi en metod som involverar Co-transfektion av proteinet av intresse (POI) och EGFP till primär råtta kortikala neuroner. Egfp fungerar som en morfologisk markör för identifiering av framgångsrikt transfekterade nervceller och tillåter mätning av neuriter. Vi validerade denna metod genom att använda föreningar/molekyler som har rapporterats att modulera påverkar utväxt. Dessutom, FE65, en neuronala adapter protein som har visat sig stimulera påverkar utväxt, användes för att illustrera detta tillvägagångssätt8,9. Detta protokoll innebär (1) isolering av primära kortikala neuroner från embryonala dag 18 (E18) råtta embryon, (2) Co-transfektion av nervceller med EGFP och POI (FE65 i denna studie) och (3) avbildning och analys av nervceller med hjälp av bildbehandling programvara ImageJ med NeuronJ plugin10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla tillvägagångssätt följde var i överensstämmelse med de etiska standarderna av den djura experimenterande etikkommittén av det kinesiska universitetar av Hong Kong.
1. beredning av täckglas
- Placera en steril 18 mm cirkulär täckslip i varje brunn av en 12-och vävnadsodling plattan.
- Täck täckslip med 5 μg/mL Poly-D-lysin lösning i en fuktad 37 ° c inkubator i minst 1 h.
- Aspirera Poly-D-lysin lösning från vävnaden kultur plattan och skölj de belagda täckglas en gång med sterilt vatten.
2. råtta Embryoneuron dissektion
- Offra en tidsinställd gravid Sprague-Dawley råtta vid en gestationsålds 18 dagar (E18) av antingen cervikal dislokation eller CO2 kvävning.
Anmärkning: Vänligen kontrollera lokala föreskrifter för offret av dräktiga råttor. - Öppna bukhålan av den gravida råtta med dissekera sax och överföra livmodern till en 10 cm petriskål.
- Öppna livmodern och fostersäcken noggrant med små dissekera sax och ta bort moderkakan från råtta embryot med hjälp av små dissekera sax. Överför hela embryot till en 10 cm petriskål med förkyld fosfat buffrad saltlösning kompletterad med glukos (PBS-glukos, 10 mM natriumfosfater, 2,68 mM kaliumklorid, 140 mM natriumklorid och 3 g/L glukos) med ett par små pinkoppar.
- Skär längs skallen sagittal suturen och öppna den försiktigt med ett par små dissekera sax. Överför den embryonala hjärnan med en liten platt spatel till en 10 cm petriskål med iskallt PBS-glukos.
- Separera de två hjärnhalvorna från lillhjärnan och hjärnstammen med hjälp av två #5 pincetter under en dissektion Mikroskop.
Anmärkning: Se referens12 för strukturen av råtta hjärnan. - Ta bort hjärnhinnorna med #5 pincett.
- Isolera cortex från hjärnhalvorna med två raka #5 pincetter.
- Överför den isolerade cortex till iskall PBS-glukos i ett 15 mL centrifugrör.
3. primär kortikal neuron kultur
Anmärkning: Alla procedurer i steg 3 och 4 utförs i ett biosäkerhetsskåp av klass II.
- Reglera isolerade cortex med tyngdkraften vid 4 ° c i 5 min och aspirera PBS-glukos.
- Tillsätt 1 mL 0,05% trypsin-EDTA till den isolerade cortex och blanda försiktigt genom att knacka och inkubera vävnaden i en 37 ° c vattenbad för 10 min för att möjliggöra enzymatisk matsmältning. Knacka försiktigt på röret för att blanda varje 2 min.
- Tillsätt 4 mL underhålls medium (t. ex. Neurobasal medium) till blandningen av vävnad/trypsin.
Anmärkning: Allt underhålls medium som används i detta protokoll kompletteras med penicillin-streptomycin och B-27 supplement13. - Separera vävnaden försiktigt genom triturering med en 1 mL pipett.
- Pelleten de separerade cellerna genom centrifugering vid 200 x g i 5 min. aspirera på supernatanten.
- Upprepa steg 3,5 till 3,7 två gånger.
- Omsuspendera cellpelleten i 1 mL underhålls medium.
- Tillsätt 10 μL 0,4% Trypan Blue-lösning till 10 μL cellsuspension för räkning av livskraftiga celler av en hemocytometer.
- Platta nervceller på en densitet av 65000/cm2 (livskraftiga celler) i 1 ml underhålls medium per brunn i en 12-brunn tallrik.
4. cell transfektion och fixering
- Vid 2 dagar in vitro (DIV2), transfect 0,5 μg EGFP konstruera (pEGFP-C1) till neuroner tillsammans antingen med eller utan av 0,5 μg POI genom att använda 1 μL av transfektionsreagens (t. ex. Lipofectamin 2000). Använd tillverkarens anvisningar.
Anmärkning: Däggdjurs uttryck konstruktioner bereddes med hjälp av en endotoxin fri plasmid Beredningssats. Behandling med kemikalier/molekyler (i detta manuskript cytochalasin D (CYTO D) och nervtillväxtfaktor (NGF) användes) kan göras vid 6 h efter transfektion. - Aspirera på odlingsmediet 24 h efter transfektion och tvätta de transfekterade cellerna en gång med 37 ° c PBS (10 mm natriumfosfater, 2,68 mm kaliumklorid, 140 mm natriumklorid).
- Fixera cellerna med 4% PARAFORMALDEHYD i PBS i 10 minuter i mörker vid rumstemperatur.
- Tvätta de fasta cellerna tre gånger med PBS.
- Tillsätt en minimal mängd fluorescensmontage medium på ett Mikroskop glas Slide. Överför försiktigt täckglaset från den 12-välta plattan till monterings mediet med provet vänd mot glas bilden.
Anmärkning: Försegla kanten på täckslip med nagellack om ett vattenhaltigt monteringsmedium används.
5. mätning av Neuritutväxt
- Använd en 40x mål för att fånga bilder med ett EPI-fluorescerande Mikroskop.
- Ta bilder från minst 40 intakt neuroner med EGFP signal per transfektion.
- Öppna den tagna bilden i ImageJ programvara med NeuronJ plugin11 för att mäta längden på den längsta neuriten, från cellen kroppen till spetsen av tillväxt konen, av varje avbildas neuron.
- Analysera de data som erhållits med programvaran för att avgöra effekten av de riktade proteiner i neurit utväxt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att testa denna metod, vi använde CYTO D och nervtillväxtfaktor NGF, som har visat sig hämma och stimulera neurit utväxt respektive14,15,16. Neuritlängden av neuroner som transfekterade med egfp mättes efter behandling med CYTO D eller NGF. Den transfektion effektivitet EGFP till nervceller var 2,7% (1 068 nervceller räknas). Som visas i figur 1A, undertryckt CYTO D neurit förlängning på ett dosberoende sätt. Omvänt var påverkar utväxt potentieras i de nervceller som behandlats med NGF (figur 1B).
Därefter undersökte vi nyttan av detta system genom att transfecting den neuronala adaptern FE65, som har visat sig främja påverkar utväxt. Primär råtta kortikala nervceller var Co-transfected med FE65 och EGFP. Trots den låga transfektion effektivitet, Immuno-fluorescensanalys visade att över 80% av nervceller framgångsrikt Co-transfected med EGFP och FE65 (figur 2a). Liknar tidigare rapporter8,9, FE65 stimulerade signifikant påverkar utväxt med 2x (figur 2B). Vi analyserade också uttrycket av EGFP och FE65 vid olika tidpunkter av Western blot-analys. Som framgår av figur 2Cupptäcktes egfp och FE65 6 h respektive 12 h efter transfektion. Liknande uttrycks nivåer av proteinerna observerades i 1 d till 7 d post-transfektion nervceller. Detta indikerar att analysen av påverkar utväxt kan göras så tidigt som 6 h post-transfektion eller i mer mogna nervceller. Tillsammans, dessa data tyder på att det nämnda protokollet är lämplig för att fastställa den roll som förmodade påverkar utväxt reglerande proteiner genom klassisk transfektion.
Vi övervakade också effekten av gen dosering på neurit utväxt genom transfecting primära råtta kortikala nervceller med olika mängder FE65 plasmid DNA. Som framgår av figur 2Dobserverades en dosberoende ökning av neuritförlängningen från 0-0,5 μg FE65 plasmid-DNA. Emellertid, det fanns ingen signifikant skillnad mellan neuroner transfekterade med antingen 0,5 μg eller 1 μg plasmid DNA (figur 2D).
Figur 1: Neurite utväxt moduleras av CYTO D och NGF. E18 råtta kortikala nervceller var transfekterade på DIV2 med en egfp Expression Vector. 6 h post-transfektion, cellerna behandlades med (a) 0-0.5 μg/ml CYTO D eller (B) 0-100 ng/ml NGF för 24 h. Sedan var nervceller fasta och avbildas därefter. Bilder fångades med 40x mål med hjälp av en EPI-fluorescens Mikroskop och längden på den längsta neuriten från cellen kroppen till spetsen av tillväxten konen mättes med hjälp ImageJ med NeuronJ plugin. Tre oberoende experiment utfördes och minst 40 neuroner mättes i varje grupp. Stapeldiagrammet visade Fold förändringen i medelvärdet neurit längd. Ej parade t-test antogs för statistisk analys. * p < 0,001, * * p < 0,05. Felstaplar = S.E.M. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: FE65 stimulerar påverkar utväxt. E18 råtta kortikala nervceller var transfekterade på DIV2 med antingen tomma vektor kontroll (EV) eller FE65 tillsammans med en egfp Expression Vector. Celler var fasta och avbildade 24 h efter transfektion. (A) de transfekterade neuronerna motverkades med anti-FE65-antikropp och antalet celler med egfp eller FE65 var för sig transfekterade och egfp + FE65 Co-transfekterade räknades. Tre oberoende experiment utfördes och minst 100 celler räknades i varje experiment. Data uttrycks som procentandelen celler med EGFP-och EGFP + FE65-signaler. * p < 0,001. Felstaplar = SD (B) längden på den längsta neuriten från cellen kroppen till spetsen av tillväxten konen mättes med hjälp imagej med NeuronJ plugin. Representativa neuron bilder visades i den högra panelen. FE65 färgas av en get anti-FE65 antikropp enligt beskrivningen8,17. Tre oberoende experiment utfördes och minst 40 neuroner mättes per transfektion. Stapeldiagrammet visade Fold förändringen i medelvärdet neurit längd. Data analyserades av ej ihopparad t-test. * p < 0,001. Felstaplar = S.E.M. Scale bar = 10 μm. (C) analys av västerländska blot-uttryck av nivåer av EGFP och FE65 vid tidpunkter efter transfektion enligt indikationen. EGFP och FE65 upptäcktes av Mouse anti-GFP och anti-MYC (till FE65 C-Terminal MYC tag), respektive. Dden genomsnittliga neuritlängden av neuroner som transfekterade med olika mängder FE65 plasmid-DNA enligt indikerat. Statistiska analyser utfördes med enkelriktade ANOVA-tester med Bonferroni post-hoc-test. * p < 0,001, * * p < 0,05. Felstaplar = S.E.M. Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som nämnts tidigare, PC12 och dess subkloner är allmänt anställda för att studera påverkar förlängning eftersom de har utmärkta transfektion effektivitet2,3. I motsats, primära nervceller har en låg transfektion hastighet, vilket är ett stort hinder för att studera påverkar utväxt regulatorer genom transfektion7. Här beskriver vi ett bekvämt protokoll för att kvantifiera påverkar utväxt i primära nervceller. Trots den låga totala transfektion effektivitet, mer än 80% av de transfekterade nervceller framgångsrikt Co-transfekterade med de två proteinerna: FE65 och egfp (figur 2a). Därför, genom att analysera egfp-märkta neuroner, effekten av FE65 på påverkar utväxt kunde bestämmas exakt (figur 2B).
En annan fördel med den EGFP-baserade metoden som beskrivs är att färgning av immunofluorescensteknik kan utelämnas. Immunofluorescensfärgning av tuj 1, en neuron-specifik klass III β-tubulin, används flitigt som en morfologisk markör när man studerar neuritförlängning18,19,20,21. Förutom tuj 1 krävs färgning av POI för identifiering av transfekterade neuroner19,22,23. Det är känt att konsekvensen av immunofluorescensfärgning, vilket är avgörande för påverkar utväxt mätning, påverkas av många faktorer, inklusive provberedning och antikroppar24. Därför kan den övergripande enkelheten i EGFP-baserade metoden förbättra noggrannheten i analysen.
I vårt protokoll är neuroner fast för påverkar mätning 24 h post-transfektion. Således, neuroner utsätts för transfektion reagens för 24 h. Det är länge känt att transfektionsreagens är giftiga för cellerna25. Om effekten av POI på påverkar förlängning måste bestämmas bortom DIV3, färskt medium påfyllning kan bidra till att minimera toxiciteten. Dessutom kan alternativa gen leveransmetoder övervägas såsom ca2 + fosfat samfällning och nukleofektion, som båda visar sig ha en mindre toxisk effekt på cellerna26. Dessutom visar vi här att den högsta effekten av FE65 på påverkar utväxt observeras i de nervceller som transfekterade med att 0,5 μg FE65 och 0,5 μg egfp plasmider genom att använda 1 μl av transfektionsreagens. För andra intressepunkter bör de optimala mängderna av plasmid-DNA och transfektionsreagens bestämmas eftersom proteiner har mycket olika omsättnings hastigheter.
Förutom gen leveransmetod, celltäthet är en annan kritisk parameter som skall övervägas. Om neuron densitet är för hög, blir det svårt att identifiera ursprunget till neuriter som de skulle överlappa varandra. Även plätering celler vid en låg densitet kan lösa problemet, överlevnaden av primära nervceller skulle minskas avsevärt vid en låg celltäthet27. Primär råtta Hippocampus nervceller har visat sig växa hälsosamt vid densiteten mellan 40 000 till 100000/cm2 28. I detta protokoll, en densitet på 65000/cm2 av råtta kortikala neuroner används. Ändå, det är viktigt att bestämma lämplig celltäthet för olika typer av nervceller under olika experimentella förhållanden.
Den neurit mätning av att utveckla råtta primära nervceller (dvs. DIV3 neuroner) beskrivs här. Emellertid, mer mogna neuronala fenotyper kan observeras i nervceller bortom DIV329. Eftersom effekterna av POIs eller droger på neurit förlängning i mogna nervceller kan skilja sig från att utveckla nervceller, undersökning med hjälp av nervceller från olika stadier skulle ge ett mer omfattande perspektiv. Det är värt att notera att vi fortfarande kunde observera EGFP uttryck i nervceller 7 d post-transfektion. Detta kan underlätta studiet av POI eller droger på påverkar utväxt i mogna nervceller.
Human inducerad pluripotenta stamcells (hiPSC)-härledda nervceller är värdefulla verktyg för identifiering av nya terapeutiska metoder. Till exempel, utredning av neurit utväxt i dessa celler kan avslöja nya mål i neuroregeneration som användningen av hiPSC-härledda nervceller undviker Art skillnader. Liknar primära gnagare nervceller, hiPSC-härledda nervceller är svåra att transfect30, vilket kan minska Co-transfektion effektivitet EGFP och POI. Därför kan användningen av polycistronic däggdjurs uttryck vektorer se till att alla transfekterade celler uttrycker hela uppsättningen av transfekterade gener inklusive egfp och POI. Dessutom kan alternativa gen leveransmetoder, såsom elektroporation, förbättra transfektionseffektiviteten. Återigen är cellernas lönsamhet en fråga som måste beaktas när man använder sådana gen leveransmetoder.
Det är känt att råtta embryonala hjärnbarken innehåller olika typer av nervceller inklusive taggig stellate nervceller, bipolär nervceller och lång-projicera nervceller31. Även om detta protokoll som anges här kan avslöja den allmänna effekten av POIs på påverkar utväxt, är det möjligt att samma POI kan uppvisar olika svar i olika typer av nervceller. Till exempel, myostatin ökar antalet sensoriska axoner men inte som motor axoner32. I ett sådant scenario, modifiering av protokollet är nödvändigt, såsom tidigare isolering av specifika typer av nervceller genom flödescytometri. Alternativt kan specifika neuronala markör antikroppar användas för att identifiera de nödvändiga typerna av nervceller under avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter med innehållet i denna artikel.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av medel från forskningsstipendier rådet Hong Kong, hälso-och sjukvårds forskningsfonden (Hongkong), CUHK direkt bidragssystem, United College donationsfond och TUYF välgörenhets förtroende.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
- Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
- Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
- Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
- Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
- Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
- Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
- Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
- Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).
- Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
- He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).
- Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
- Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
- Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).
- Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
- Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).
- Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).
