Summary
In questa relazione, descriviamo un semplice protocollo per studiare la escrescenza di neurite nei neuroni corticali embrionali del ratto co-traducendo con EGFP e la proteina di interesse.
Abstract
L'escrescenza di Neurite è un evento fondamentale nella formazione dei circuiti neurali durante lo sviluppo del sistema nervoso. Gravi danni ai neuriti e disfunzioni sinaptiche si verificano in varie malattie neurodegenerative e degenerazione legata all'età. Lo studio dei meccanismi che regolano l'escrescenza neurite non solo getterebbe luce preziosa sui processi di sviluppo cerebrale, ma anche su tali disturbi neurologici. A causa della bassa efficienza di trasfezione, è attualmente difficile studiare l'effetto di una proteina specifica sulla escrescenza di neurite nei neuroni dei mammiferi primari. Qui, descriviamo un metodo semplice per lo studio dell'escrescenza neurite dalla co-trasfezione dei neuroni corticali del ratto primario con EGFP e una proteina di interesse (POI). Questo metodo consente l'identificazione dei neuroni trafettati POI attraverso il segnale EGFP, e quindi l'effetto del POI sulla crescita di neurite può essere determinato con precisione. Questo saggio basato su EGFP fornisce un approccio conveniente per lo studio dei percorsi che regolano la crescita neurite.
Introduction
Neuriti, compresi sia assoni che dendriti, sono le proiezioni dei neuroni coinvolti nella creazione delle reti neurali. La crescita dinamica dei neuriti è essenziale per il neurosviluppo. Tuttavia, i meccanismi normativi sottostanti rimangono poco chiari. In particolare, il danno neurite è spesso osservato in varie malattie neurodegenerative e dopo lesioni cerebrali1. Pertanto, lo studio dei ruoli delle molecole putative in vari percorsi normativi di escrescenza neurite migliorerebbe la nostra comprensione del processo. Inoltre, può rivelare nuovi bersagli terapeutici per vari disturbi neurologici. Le linee cellulari neuronali sono modelli preziosi per studiare i processi neuronali tra cui l'escrescenza di neurite in quanto sono facili da manipolare e trasfect2,3. Tuttavia, deriva genetica è stata segnalata per verificarsi in alcune linee cellulari comunemente utilizzate, che potrebbero portare a variazioni nelle loro risposte fisiologiche4. Inoltre, è stata mostrata un'espressione differenziale di proteina tra le linee cellulari neuronali e i neuroni primari. Per esempio, PC12, una linea cellulare neuronale derivata dalla ghiandola surrenale del ratto che è ampiamente utilizzata per studiare la crescita neurite2,3, non esprime i recettori NMDA5. Inoltre, è stato proposto che la ridotta reattività della linea neuroblastoma del topo neuro-2a alle neurotossine rispetto ai neuroni primari è dovuta alla mancanza di espressione di alcuni recettori della membrana e canali ionici6. Pertanto, i neuroni primari sono un modello più desiderabile e rappresentativo per lo studio della escrescenza di neurite. Tuttavia, l'uso di neuroni primari è ostacolato dalla loro bassa efficienza di trasfezione7.
Qui, descriviamo un metodo che comporta la co-trasfezione della proteina di interesse (POI) e EGFP ai neuroni corticali del ratto primario. L'EGFP agisce come marcatore morfologico per l'identificazione di neuroni trasfettati con successo e permette la misurazione dei neuriti. Abbiamo convalidato questo metodo utilizzando composti/molecole che sono stati segnalati per modulare la crescita dei neurite. Inoltre, FE65, una proteina adattatrice neuronale che ha dimostrato di stimolare la crescita neurite, è stata utilizzata per illustrare questo approccio8,9. Questo protocollo prevede (1) l'isolamento dei neuroni corticali primari dagli embrioni del giorno embrionale 18 (E18) sugli embrioni di ratto, (2) la co-trasfezione dei neuroni con EGFP e poi (FE65 in questo studio) e (3) l'imaging e l'analisi dei neuroni utilizzando l'elaborazione delle immagini software ImageJ con il plugin NeuronJ10,11.
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Protocol
Tutte le procedure seguite erano conformi agli standard etici del comitato etico per la sperimentazione animale dell'Università Cinese di Hong Kong.
1. Preparazione di Coverslips
- Collocare uno scivolo circolare sterile da 18 mm in ogni pozzetto di una piastra di coltura dei tessuti a 12 pozze.
- In un'incubatrice umidizzata da 37 gradi centigradi per almeno 1 h, rivestire la coverslip con una soluzione poli-D-lisina a 5 g/mL/mL.
- Aspirare la soluzione poli-D-lysina dalla piastra di coltura dei tessuti e risciacquare i copricapi rivestiti una volta con acqua sterile.
2. Dissezione del neurone embrionale del ratto
- Sacrificare un ratto Sprague-Dawley a tempo all'età gestazionale di 18 giorni (E18) per lussazione cervicale o asfissia di CO2.
NOT: Si prega di controllare le norme locali per il sacrificio di ratti incinte. - Aprire la cavità addominale del ratto incinta con forbici dissetanti e trasferire l'utero in un piatto Petri di 10 cm.
- Aprire con cura l'utero e il sacco amniotico con piccole forbici dissettive e rimuovere la placenta dall'embrione di ratto utilizzando piccole forbici dissettive. Trasferire l'intero embrione in una parabola Petri di 10 cm con salina tamponata pre-raffreddata con supplemento di glucosio (PBS-glucosio, 10 mM fosfati di sodio, 2,68 mM di cloruro di potassio, 140 mM di cloruro di sodio e 3 g/L di glucosio) utilizzando un paio di piccole pinze.
- Tagliare lungo la sutura sagittale del cranio e aprirlo con attenzione con un paio di piccole forbici dissetanti. Trasferire il cervello embrionale con una piccola spatola piatta in un piatto Petri di 10 cm con PBS-glucosio ghiacciato.
- Separare i due emisferi cerebrali dal cervelletto e dal tronco encefalico utilizzando due pinzette #5 al microscopio di dissezione.
NOT: Si prega di vedere il riferimento12 per la struttura del cervello del ratto. - Rimuovere le meningi utilizzando le #5 pinzette.
- Isolare la corteccia dagli emisferi cerebrali con due pinzette di #5 dritte.
- Trasferire la corteccia isolata in PBS-glucosio ghiacciato in un tubo di centrifuga di 15 mL.
3. Cultura primaria dei neuroni corticali
NOT: Tutte le procedure nei passaggi 3 e 4 vengono eseguite all'interno di un armadietto di biosicurezza di classe II.
- Apposta la corteccia isolata per gravità a 4 gradi centigradi per 5 min e aspira il PBS-glucosio.
- Aggiungere 1 mL di 0,05% Trypsin-EDTA alla corteccia isolata e mescolare delicatamente toccando e incubare il tessuto in un bagno d'acqua di 37 gradi per 10 min per consentire la digestione enzimatica. Toccare delicatamente il tubo per mescolare ogni 2 min.
- Aggiungere 4 mL di mezzo di manutenzione (ad esempio, Mezzo Neurobasal) alla miscela di tessuto/trypsin.
NOT: Tutto il mezzo di manutenzione utilizzato in questo protocollo è integrato con Penicillina-Streptomycin e B-27 supplemento13. - Dissociare delicatamente il tessuto mediante triturazione utilizzando una pipetta da 1 mL.
- Pellet le cellule dissociate per centrifugazione a 200 x g per 5 min. Aspirate il sovratalante.
- Ripetere i passaggi da 3,5 a 3,7 due volte.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo di manutenzione.
- Aggiungete 10 L dello 0,4% di soluzione Trypan Blue a 10 litri di sospensione cellulare per il conteggio delle cellule vitali con un emocitometro.
- Piastra i neuroni ad una densità di 65,000 /cm2 (cellule vitali) in 1 mL di mezzo di manutenzione per bene in una piastra di 12 pozzetti.
4. Trasfezione e fissaggio delle celle
- A 2 giorni in vitro (DIV2), transfect 0,5 g di costrutto EGFP (pEGFP-C1) ai neuroni insieme con o senza 0,5 g di POI utilizzando 1 :L di reagente di trasfezione (ad esempio, Lipofectamine 2000). Utilizzare le istruzioni del produttore.
NOT: I costrutti di espressione dei mammiferi sono stati preparati utilizzando un kit di preparazione del plasmide endotossina. Il trattamento con sostanze chimiche/molecole (in questo manoscritto sono stati utilizzati cytochalasin D (Cyto D) e fattore di crescita del nervo (NGF) può essere fatto a 6 h dopo la trasfezione. - Aspirare il mezzo di coltura 24 h post-trasfezione e lavare le cellule traste una volta con 37 pbS (10 mM fosfati di sodio, 2,68 mM di cloruro di potassio, 140 mM di cloruro di sodio).
- Fissare le cellule con 4% paraformaldeide in PBS per 10 min al buio a temperatura ambiente.
- Lavare le celle fisse tre volte con PBS.
- Aggiungere una quantità minima di supporto di montaggio a fluorescenza su un vetrino di vetro al microscopio. Trasferire con attenzione il coperchio dalla piastra a 12 piani sul supporto di montaggio con il campione rivolto verso il vetrino.
NOT: Sigillare il bordo della coverslip con smalto se viene utilizzato un mezzo di montaggio acquoso.
5. Misurazione di Neurite Outgrowth
- Utilizzare un obiettivo 40x per catturare immagini utilizzando un microscopio epi-fluorescente.
- Cattura immagini da almeno 40 neuroni intatti con il segnale EGFP per trasfezione.
- Aprire l'immagine catturata nel software ImageJ con il plugin NeuronJ11 per misurare la lunghezza della neurite più lunga, dal corpo cellulare alla punta del cono di crescita, di ogni neurone immagine.
- Analizzare i dati ottenuti con il software per determinare l'effetto delle proteine mirate nella escrescenza di neurite.
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Representative Results
Per testare questa metodologia, abbiamo usato Cyto D e il fattore di crescita del nervo NGF, che hanno dimostrato di inibire e stimolare rispettivamente la crescita di neurite14,15,16. La lunghezza neurite dei neuroni trasincati con EGFP è stata misurata dopo il trattamento con Cyto D o NGF. L'efficienza di trasfezione di EGFP ai neuroni è stata del 2,7% (1.068 neuroni contati). Come mostrato nella Figura 1A, Cyto D ha soppresso l'estensione del neurite in modo dipendente dalla dose. Al contrario, l'escrescenza di neurite è stata potenziata nei neuroni trattati con NGF (Figura 1B).
Successivamente, abbiamo studiato l'utilità di questo sistema traducendo l'adattatore neuronale FE65, che ha dimostrato di promuovere la crescita del neurite. I neuroni corticali primari del ratto sono stati co-transfettati con FE65 ed EGFP. Nonostante la bassa efficienza di trasfezione, l'analisi dell'immuno-fluorescenza ha rivelato che oltre l'80% dei neuroni è stato co-transfettato con EGFP e FE65 (Figura 2A). Simile alle precedenti relazioni8,9, FE65 ha stimolato significativamente la escrescenza di neurite di 2x (Figura 2B). Abbiamo anche analizzato l'espressione di EGFP e FE65 in diversi momenti mediante l'analisi delle macchie occidentali. Come illustrato nella Figura 2C, EGFP e FE65 sono stati rilevati rispettivamente 6 h e 12 h dopo la trasfezione. Livelli di espressione simili delle proteine sono stati osservati nei neuroni da 1 d a 7 d post-trasfezione. Ciò indica che l'analisi dell'escrescenza di neurite potrebbe essere fatta già da 6 h dopo la trasfezione o in neuroni più maturi. Insieme, questi dati suggeriscono che il protocollo citato è adatto per determinare il ruolo della sottigliezza delle proteine regolatorie mediante la trasfezione classica.
Abbiamo anche monitorato l'effetto del dosaggio genico sulla escrescenza di neurite traducendo i neuroni corticali del ratto primario con diverse quantità di DNA plasmide FE65. Come mostrato nella Figura 2D, è stato osservato un aumento dipendente dalla dose nell'estensione dei neuriti da 0 a 0,5 g di DNA plasmide FE65. Tuttavia, non c'era alcuna differenza significativa tra i neuroni trastati con 0,5 g o 1 g di DNA plasmide (Figura 2D).
Figura 1: Escrescenza Neurite è modulata da Cyto D e NGF. I neuroni corticali del ratto E18 sono stati transinfettati su DIV2 con un vettore di espressione EGFP. 6 h dopo la trasfezione, le cellule sono state trattate con (A) 0-0,5 g/mL Cyto D o(B)0-100 ng/mL NGF per 24 h. Poi i neuroni sono stati fissati e immagine di conseguenza. Le immagini sono state catturate con obiettivo 40x utilizzando un microscopio epi-fluorescenza e la lunghezza della neurite più lunga dal corpo cellulare alla punta del cono di crescita è stata misurata utilizzando ImageJ con il plugin NeuronJ. Sono stati eseguiti tre esperimenti indipendenti e sono stati misurati almeno 40 neuroni in ogni gruppo. Il grafico a barre mostra la variazione di piega nella lunghezza media di neurite. Per l'analisi statistica è stato adottato un test t non accoppiato. < 0,001, < 0,05. Barre di errore - S.E.M. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: FE65 stimola l'escrescenza neurite. I neuroni corticali del ratto E18 sono stati transinfettati su DIV2 con un controllo vettoriale vuoto (EV) o FE65 insieme a un vettore di espressione EGFP. Le cellule sono state fissate e immagini 24 h dopo la trasfezione. (A) I neuroni trasettati sono stati controcontaminati con anticorpi anti-FE65 e il numero di cellule con EGFP o FE65 trascate da solamente e EGFP - FE65 co-transfected sono stati contati. Sono stati effettuati tre esperimenti indipendenti e sono state contate almeno 100 cellule in ogni esperimento. I dati sono stati espressi come percentuale di celle con segnali EGFP e EGFP - FE65. < 0,001. Barre di errore - S.D. (B) La lunghezza della neurite più lunga dal corpo cellulare alla punta del cono di crescita è stata misurata utilizzando ImageJ con il plugin NeuronJ. Le immagini dei neuroni rappresentativi sono state mostrate nel pannello di destra. FE65 è stato macchiato da un anticorpo capra anti-FE65 come descritto8,17. Sono stati eseguiti tre esperimenti indipendenti e sono stati misurati almeno 40 neuroni per trasfezione. Il grafico a barre mostra la variazione di piega nella lunghezza media di neurite. I dati sono stati analizzati da un t-test non accoppiato. < 0,001. Barre di errore - S.E.M. Barra della scala - 10 m. (C) Analisi commerciale della macchia dell'espressione dei livelli di EGFP e FE65 nei punti temporali di post-trasfezione come indicato. EGFP e FE65 sono stati rilevati rispettivamente da mouse anti-GFP e anti-myc (a FE65 C-terminal myc tag). (D) La lunghezza media dei neuriti dei neuroni trasfettati con varie quantità di DNA plasmide FE65 come indicato. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando test ANOVA unidirezionali con test post-hoc Di Bonferroni. < 0,001, < 0,05. Barre di errore - S.E.M. Barra della scala - 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Come detto prima, PC12 e i suoi subclone sono ampiamente impiegati per studiare l'estensione neurite perché hanno un'eccellente efficienza di trasfezione2,3. Al contrario, i neuroni primari hanno un basso tasso di trasfezione, che è un grande ostacolo per studiare i regolatori di escrescenza neurite per trasfezione7. Qui, descriviamo un protocollo conveniente per quantificare la crescita dei neuriti nei neuroni primari. Nonostante la bassa efficienza di trasfezione complessiva, oltre l'80% dei neuroni trasfettati è stato co-trasvenuto con successo le due proteine: FE65 ed EGFP (Figura 2A). Pertanto, analizzando i neuroni etichettati EGFP, l'effetto di FE65 sull'escrescenza neurite potrebbe essere determinato con precisione (Figura 2B).
Un altro vantaggio dell'approccio basato su EGFP descritto è che la colorazione dell'immunofluorescenza può essere omessa. Immunofluorescenza colorazione di Tuj 1, una classe neurona-specifica III z-tubulina, è ampiamente impiegato come marcatore morfologico quando si studia l'allungamento neurite18,19,20,21. Oltre a Tuj 1, la colorazione del POI è necessaria per l'identificazione dei neuroni trafetti19,22,23. È noto che la coerenza della colorazione dell'immunofluorescenza, che è cruciale per la misurazione dell'escrescenza neurite, è influenzata da molti fattori tra cui la preparazione del campione e gli anticorpi24. Di conseguenza, la semplicità complessiva del metodo basato su EGFP potrebbe migliorare l'accuratezza del saggio.
Nel nostro protocollo, i neuroni sono fissati per la misurazione del neurite 24 h post-trasfezione. Così, i neuroni sono esposti al reagente di trasfezione per 24 h. È noto da tempo che i reagenti di trasfezione sono tossici per le cellule25. Se l'effetto del POI sull'estensione neurite deve essere determinato oltre DIV3, il rifornimento medio fresco può contribuire a ridurre al minimo la tossicità. Inoltre, possono essere considerati metodi alternativi di somministrazione di geni come la coprecipitazioni e la cofezione di fosfato Ca2 o la coforezione, che hanno entrambi un effetto meno tossico sulle cellule26. Inoltre, si mostra qui che l'effetto più alto dell'FE65 sulla escrescenza di neurite si osserva nei neuroni trafettati con quel 0,5 g di FE65 e 0,5 g di plasmidi EGFP utilizzando 1 . Per gli altri PPI, le quantità ottimali di DNA plasmide e reagenti di trasfezione dovrebbero essere determinate poiché le proteine hanno tassi di turnover molto diversi.
Oltre al metodo di somministrazione genica, la densità cellulare è un altro parametro critico da considerare. Se la densità del neurone è troppo alta, diventa difficile identificare le origini dei neuriti come si sovrapporrebbero tra loro. Anche se la placcatura delle cellule a bassa densità può risolvere il problema, la sopravvivenza dei neuroni primari sarebbe significativamente ridotta a bassa densità cellulare27. I neuroni ippocampali primari del ratto hanno dimostrato di crescere in modo sano alla densità tra 40.000 e 100.000 /cm2 28. In questo protocollo, viene utilizzata una densità di 65.000/cm2 di neuroni corticali ratto. Tuttavia, è importante determinare la densità cellulare appropriata per diversi tipi di neuroni in diverse condizioni sperimentali.
La misura neurite dello sviluppo di neuroni primari del ratto (cioè neuroni DIV3) è descritta qui. Tuttavia, fenotipi neuronali più maturi possono essere osservati nei neuroni oltre DIV329. Poiché gli effetti dei POI o dei farmaci sull'estensione dei neuriti nei neuroni maturi possono essere diversi dai neuroni in via di sviluppo, l'indagine utilizzando neuroni provenienti da diversi stadi fornirebbe una prospettiva più completa. Vale la pena notare che siamo stati ancora in grado di osservare l'espressione EGFP nei neuroni 7 d post-trasfezione. Questo può facilitare lo studio di PSI o farmaci sulla escrescenza di neurite nei neuroni maturi.
I neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) sono strumenti preziosi per l'identificazione di nuovi approcci terapeutici. Per esempio, lo studio della escrescenza di neurite in queste cellule potrebbe rivelare nuovi obiettivi nella neurorigenerazione poiché l'uso di neuroni derivati da hiPSC evita le differenze di specie. Simile ai neuroni roditori primari, i neuroni derivati da hiPSC sono difficili da trasfecare30, che possono ridurre l'efficienza di co-trasfezione di EGFP e POI. Di conseguenza, l'uso di vettori di espressione dei mammiferi polcistronici potrebbe garantire che tutte le cellule trasfette esprimano l'intero insieme di geni trasmutati, tra cui EGFP e POI. Inoltre, metodi alternativi di somministrazione genica, come l'elettroporazione, possono migliorare l'efficienza della trasfezione. Ancora una volta, la vitalità cellulare è un problema che deve essere considerato quando si utilizzano tali approcci di somministrazione genica.
È noto che la corteccia cerebrale embrionale del ratto contiene diversi tipi di neuroni tra cui neuroni spinosi stellati, neuroni bipolari e neuroni long-projecting31. Mentre questo protocollo indicato qui può rivelare l'effetto generale dei POI sulla crescita neurite, è possibile che lo stesso POI possa esibire risposte diverse in diversi tipi di neuroni. Ad esempio, la miostatina aumenta il numero di assoni sensoriali ma non quello degli assoni motori32. In tale scenario, la modifica del protocollo è necessaria, come l'isolamento preventivo di specifici tipi di neuroni per citometria di flusso. In alternativa, specifici anticorpi marcatore neuronale possono essere utilizzati per l'identificazione dei tipi richiesti di neuroni durante l'imaging.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse con il contenuto di questo articolo.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del Research Grants Council Hong Kong, Health and Medical Research Fund (Hong Kong), del CUHK direct grant scheme, del Fondo di dotazione dello United College e del TUYF Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
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