Summary
Neste relatório, nós descrevemos um protocolo simples para estudar o conseqüência do neurite em neurônios corticais do rato embrionário cotransfecting com EGFP e a proteína do interesse.
Abstract
O conseqüência do neurite é um evento fundamental na formação dos circuitos neural durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Dano de neurite severo e disfunção sináptica ocorrem em várias doenças neurodegenerativas e degeneração relacionada à idade. A investigação dos mecanismos que regulam o conseqüência do neurite não somente derramaria a luz valiosa em processos desenvolventes do cérebro mas igualmente em tais desordens neurológicas. Devido à baixa eficiência do transfection, é atualmente desafiante estudar o efeito de uma proteína específica no conseqüência do neurite em neurônios mamíferos preliminares. Aqui, nós descrevemos um método simples para a investigação do conseqüência do neurite pelo co-transfection de neurônios corticais do rato preliminar com EGFP e uma proteína do interesse (POI). Este método permite a identificação de neurônios transfected do POI através do sinal de EGFP, e assim o efeito do POI no conseqüência do neurite pode ser determinado precisamente. Este ensaio baseado em EGFP fornece uma aproximação conveniente para a investigação dos caminhos que regulam o outgrowth do neurite.
Introduction
Neurites, incluindo os axônios e dendritos, são as projeções de neurônios envolvidos no estabelecimento das redes neurais. O crescimento dinâmico dos neuritos é essencial para o neurodesenvolvimento. No entanto, os mecanismos regulamentares subjacentes permanecem pouco claros. Em particular, o dano de neurite é freqüentemente observado em várias doenças neurodegenerativas e após lesões cerebrais1. Portanto, a investigação dos papéis de moléculas putativas em várias vias regulatórias de crescimento de neurite melhoraria nossa compreensão do processo. Além disso, pode revelar alvos terapêuticos novos para várias desordens neurológicas. As linhas celulares neuronais são modelos valiosos para estudar processos neuronais, incluindo o crescimento de neurite, pois são fáceis de manipular e transfecção2,3. No entanto, a deriva genética tem sido relatada a ocorrer em algumas linhas celulares comumente usadas, o que pode levar a variações em suas respostas fisiológicas4. Além disso, a expressão diferencial da proteína foi mostrada entre linhas de pilha neuronal e neurônios preliminares. Por exemplo,PC12, umalinha celular neuronal derivada da glândula adrenal do rato que é amplamente utilizada para estudar o conseqüência do neurite2,3, nãoexpressa receptores NMDA5. Além disso, tem sido proposto que a responsividade reduzida da linha neuro-2a neuroblastoma mouse para neurotoxinas em comparação com os neurônios primários é devido à falta de expressão de certos receptores de membrana e canais iônicos6. Conseqüentemente, os neurônios preliminares são um modelo mais desejável e representativo para a investigação do outgrowth do neurite. No entanto, o uso de neurônios primários é dificultado pela sua baixa eficiência de transfecção7.
Aqui, nós descrevemos um método que envolva o co-Transfection da proteína do interesse (POI) e do EGFP aos neurônios corticais principais do rato. O EGFP atua como um marcador morfológico para a identificação de neurônios transfectados com sucesso e permite a mensuração de neuritos. Nós validamos este método usando compostos/moléculas que foram relatadas para modular o outgrowth do neurite. Além disso, FE65, uma proteína do adaptador neuronal que seja mostrada para estimular o outgrowth do neurite, foi usada para ilustrar esta aproximação8,9. Este protocolo envolve (1) o isolamento de neurônios corticais primários de embriões de ratos do dia embrionário 18 (E18), (2) a cotransfecção de neurônios com EGFP e o POI (FE65 neste estudo) e (3) a imagem e análise dos neurônios usando o processamento de imagens software ImageJ com o plugin NeuronJ10,11.
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Protocol
Todos os procedimentos seguidos estavam de acordo com os padrões éticos do Comitê de ética em experimentação animal da universidade chinesa de Hong Kong.
1. preparação de COVERSLIP
- Coloque uma lamínula circular estéril de 18 mm em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 12 poços.
- Cubra a lamínula com 5 μg/mL de solução de poli-D-lisina em uma incubadora humidificada de 37 ° c por pelo menos 1 h.
- Aspirar a solução de poli-D-lisina da placa de cultura do tecido e enxaguar as coberturas revestidas uma vez com água estéril.
2. dissecção do Neuron embrionário do rato
- Sacrifique um rato de Sprague-Dawley cronometrado-grávido em uma idade gestational de 18 dias (E18) pela deslocação cervical ou pelo Asphyxiation do CO2 .
Nota: Por favor, verifique os regulamentos locais para o sacrifício de ratos grávidas. - Abra a cavidade abdominal do rato grávido com tesouras de dissecação e transfira o útero a um prato de Petri de 10 cm.
- Abra o útero e o saco amniótico com cuidado com as tesouras de dissecação pequenas e remova a placenta do embrião do rato usando tesouras de dissecação pequenas. Transfira todo o embrião para uma placa de Petri de 10 cm com soro pré-resfriado com tampão de fosfato suplementado com glicose (PBS-glicose, 10 mM fosfatos de sódio, cloreto de potássio 2,68 mM, cloreto de sódio de 140 mM e 3 g/L de glicose) usando um par de fórceps pequeno.
- Corte ao longo da sutura sagital do crânio e abra-o com cuidado com um par de tesouras de dissecação pequenas. Transfira o cérebro embrionário com uma pequena espátula plana para um prato de Petri de 10 cm com PBS-glicose gelada.
- Separe os dois hemisférios cerebrais do cerebelo e do tronco cerebral usando duas pinças #5 um microscópio de dissecção.
Nota: Por favor, veja referência12 para a estrutura do cérebro de rato. - Retire as meninges usando a pinça #5.
- Isole o córtex dos hemisférios cerebrais com duas pinças #5 retas.
- Transfira o córtex isolado para a PBS-glicose gelada em um tubo de centrífuga de 15 mL.
3. cultura primária do Neuron cortical
Nota: Todos os procedimentos nas etapas 3 e 4 são realizados dentro de um gabinete de biossegurança classe II.
- Liquidar o córtex isolado por gravidade a 4 ° c por 5 min e aspirar a PBS-glicose.
- Adicione 1 mL de 0, 5% de Trypsin-EDTA ao córtex isolado e misture suavemente tocando e incubar o tecido em um banho de água de 37 ° c por 10 min para permitir a digestão enzimática. Bata suavemente no tubo para misturar a cada 2 min.
- Adicionar 4 mL de meio de manutenção (por exemplo, meio Neurobasal) à mistura tecido/tripsina.
Nota: Todo o meio de manutenção utilizado neste protocolo é complementado com penicilina-estreptomicina e B-27 suplemento13. - Dissociar o tecido suavemente por trituração usando uma pipeta de 1 mL.
- Pellet as células dissociadas por centrifugação em 200 x g por 5 min. aspirar o sobrenadante.
- Repita as etapas 3,5 a 3,7 duas vezes.
- Ressuscitem o pellet celular em 1 mL de meio de manutenção.
- Adicionar 10 μL de 0,4% de solução de trypan Blue a 10 μL de suspensão celular para contagem de células viáveis por um hemociômetro.
- Placa os neurônios em uma densidade de 65.000/cm2 (células viáveis) em 1 ml de meio de manutenção por poço em uma placa de 12 poços.
4. transfection e fixação da pilha
- Aos 2 dias in vitro (DIV2), transfecção 0,5 μg do construto de EGFP (pegfp-C1) aos neurônios junto com ou sem de 0,5 μg de POI usando 1 μl do reagente do transfection (por exemplo, Lipofectamine 2000). Use as instruções do fabricante.
Nota: Construções de expressão de mamíferos foram preparadas usando um kit de preparação de plasmídeo livre de endotoxina. O tratamento com produtos químicos/moléculas (Neste manuscrito citocalasina d (cyto d) e fator de crescimento do nervo (NGF) foi usado) pode ser feito em 6 h após o transfection. - Aspirar o meio de cultura 24 h pós-transfecção e lavar as células transfectadas uma vez com 37 ° c PBS (10 mM fosfatos de sódio, cloreto de potássio 2,68 mM, cloreto de sódio 140 mM).
- Fixe as pilhas com o paraformaldeído de 4% em PBS por 10 minutos no escuro na temperatura ambiente.
- Lave as células fixas três vezes com PBS.
- Adicione uma quantidade mínima de meio de montagem de fluorescência em uma corrediça de vidro do microscópio. Transfira cuidadosamente a lamínula da placa de 12 poços para o meio de montagem com a amostra virada para a corrediça de vidro.
Nota: Sele a borda do lamela com lustrador de prego se um meio de montagem aquoso é usado.
5. medição de neurite outgrowth
- Use um objetivo de 40x para capturar imagens usando um microscópio EPI-fluorescente.
- Capture imagens de pelo menos 40 neurônios intactos com sinal de EGFP por transfecção.
- Abra a imagem capturada no software ImageJ com o plugin NeuronJ11 para medir o comprimento do neurite mais longo, do corpo da célula até a ponta do cone de crescimento, de cada Neuron imaged.
- Analise os dados obtidos com o software para determinar o efeito das proteínas alvejadas no crescimento do neurite.
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Representative Results
Para testar essa metodologia, utilizou-se o fator NGF de crescimento do cito D e do nervo, que demonstrou inibir e estimular o crescimento doneurite, respectivamente,14,15,16. O comprimento do neurite dos neurônios transfected com EGFP foi medido após o tratamento com cyto D ou NGF. A eficiência do transfection de EGFP aos neurônios era 2,7% (1.068 neurônios contados). Como mostrado na Figura 1a, o cyto D suprimiu a extensão do neurite em uma maneira dose-dependente. Inversamente, o crescimento do neurite foi potenciado nos neurônios tratados com NGF (Figura 1B).
Em seguida, nós investigamos a utilidade deste sistema transfecting o adaptador neuronal FE65, que foi mostrado para promover o outgrowth do neurite. Os neurônios corticais principais do rato foram co-transfected com FE65 e EGFP. Apesar da baixa eficiência do transfection, a análise da imuno-fluorescência revelou que sobre 80% dos neurônios estiveram cotransfected com sucesso com o EGFP e o FE65 (Figura 2A). Semelhante aos relatos anteriores8,9, FE65estimulou significativamenteo crescimento do neurite por 2x (Figura 2B). Também analisamos a expressão de EGFP e FE65 em diferentes pontos temporais por meio da análise Western Blot. Como mostrado na Figura 2C, o EGFP e o FE65 foram detectados 6 h e 12 h pós-transfecção, respectivamente. Os níveis de expressão similares das proteínas foram observados em 1 d a 7 d neurônios do borne-transfection. Isto indica que a análise do conseqüência do neurite poderia ser feita tão cedo quanto o borne-transfection de 6 h ou em uns neurônios mais maduros. Junto, estes dados sugerem que o protocolo mencionado seja apropriado para determinar o papel de proteínas reguladoras do conseqüência do neurite putativo pelo transfection Classical.
Nós igualmente monitoramos o efeito da dosagem do gene no conseqüência do neurite transfecting neurônios corticais preliminares do rato com quantidades diferentes de ADN do plasmídeo FE65. Como mostrado na Figura 2D, um aumento dose-dependente na extensão do neurite foi observado de 0-0,5 μg do ADN do plasmídeo FE65. No entanto, não houve diferença significativa entre os neurônios transfectados com 0,5 μg ou 1 μg de DNA plasmídeo (Figura 2D).
Figura 1: o crescimento do neurite é modulado por cyto D e NGF. Os neurônios corticais do rato E18 foram transfected em DIV2 com um vetor da expressão de EGFP. 6 h pós-transfecção, as células foram tratadas com (a) 0-0,5 μg/ml de cyto D ou (B) 0-100 ng/ml de NGF por 24 h. Em seguida, os neurônios foram fixados e imaged em conformidade. As imagens foram capturadas com o objetivo 40x usando um microscópio da EPI-fluorescência e o comprimento do neurite o mais longo do corpo da pilha à ponta do cone do crescimento foi medido usando ImageJ com o plugin de NeuronJ. Três experimentos independentes foram realizados e pelo menos 40 neurônios foram medidos em cada grupo. O gráfico de barras mostrou a mudança de dobra no comprimento médio do neurite. O teste t não pareado foi adotado para a análise estatística. * p < 0, 1, * * p < 0, 5. Barras de erro = M.E.V. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: FE65 estimula o crescimento do neurite. Os neurônios corticais do rato E18 foram transfected em DIV2 com controle de vetor vazio (EV) ou FE65 junto com um vetor da expressão de EGFP. As células foram fixadas e imaged 24 h após a transfecção. (A) os neurônios transfectados foram contracorados com anticorpo FE65 e o número de células com EGFP ou FE65 isoladamente transfected e EGFP + FE65 co-transfected foram contados. Três experimentos independentes foram realizados e pelo menos 100 células foram contabilizadas em cada experimento. Os dados foram expressos como o percentual de células com sinais de EGFP e EGFP + FE65. * p < 0, 1. Barras de erro = S.D. (B) o comprimento do neurite mais longo do corpo da célula até a ponta do cone de crescimento foi medido usando o ImageJ com o plugin do NeuronJ. As imagens representativas do neurônio foram mostradas no painel direito. FE65 foi manchado por um anticorpo anti-FE65 da cabra como descrito8,17. Três experimentos independentes foram realizados e pelo menos 40 neurônios foram medidos por transfecção. O gráfico de barras mostrou a mudança de dobra no comprimento médio do neurite. Os dados foram analisados por teste t não pareado. * p < 0, 1. Barras de erro = M.E.V. barra de escala = 10 μm. (C) Western blot análise da expressão dos níveis de EGFP e FE65 nos pontos de tempo pós-transfecção como indicado. O EGFP e o FE65 foram detectados pelo mouse anti-GFP e anti-Myc (para FE65 C-terminal Myc tag), respectivamente. (D) o comprimento médio do neurite dos neurônios transfected com várias quantidades do ADN do PLASMÍDEO FE65 como indicado. As análises estatísticas foram realizadas por meio de testes ANOVA One-Way com teste post-hoc de Bonferroni. * p < 0, 1, * * p < 0, 5. Barras de erro = M.E.V. barra de escala = 10 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Como afirmado antes, PC12 e seus subclones são amplamente empregados para estudar a extensão do neurite, pois têm excelente eficiênciadetransfecção 2,3. Em contrapartida, os neurônios primários têm uma baixa taxa de transfecção, que é um grande obstáculo para o estudo dos reguladores de crescimento do neurite por transfecção7. Aqui, nós descrevemos um protocolo conveniente para quantificar o conseqüência do neurite em neurônios preliminares. Apesar da baixa eficiência global do transfection, mais de 80% dos neurônios transfected foram co-transfected com sucesso com as duas proteínas: FE65 e EGFP (Figura 2a). Portanto, analisando os neurônios rotulados pelo EGFP, o efeito da FE65 sobre o crescimento do neurite pode ser determinado com precisão (Figura 2B).
Uma outra vantagem da aproximação EGFP-baseada descrita é que a mancha da imunofluorescência pode ser omitida. A coloração da imunofluorescência de Tuj 1, uma classe III β-tubulin do Neuron-específico, é empregada extensamente como um marcador morfológico ao estudar o alongamento do neurite18,19,20,21. Além do Tuj 1, a coloração do POI é necessária para a identificação dos neurônios transfectados19,22,23. Sabe-se que a consistência da coloração da imunofluorescência, que é crucial para a medida do conseqüência do neurite, é afetada por muitos fatores que incluem a preparação da amostra e os anticorpos24. Assim, a simplicidade geral do método baseado em EGFP poderia melhorar a precisão do ensaio.
Em nosso protocolo, os neurônios são fixados para a medida do neurite 24 h borne-transfection. Assim, os neurônios são expostos ao reagente de transfecção por 24 h. É sabido por muito tempo que os reagentes do transfection são tóxicos às pilhas25. Se o efeito do POI na extensão do neurite precisa de ser determinado além de DIV3, o reabastecimento médio fresco pode ajudar a minimizar a toxicidade. Além disso, os métodos alternativos da entrega do gene podem ser considerados como a co-precipitação do CA2 + phosphate e o nucleofection, ambo são mostrados para ter um efeito menos tóxico às pilhas26. Adicionalmente, nós mostramos aqui que o efeito o mais elevado de FE65 no conseqüência do neurite é observado nos neurônios transfected com aquele 0,5 μg de FE65 e 0,5 μg de plasmídeos de EGFP usando 1 μl do reagente do transfection. Para outros PIS, as quantidades ideais de DNA plasmídeo e reagentes de transfecção devem ser determinadas, pois as proteínas têm taxas de rotatividade muito diferentes.
Além do que o método da entrega do gene, a densidade da pilha é um outro parâmetro crítico a ser considerado. Se a densidade do neurônio é muito alta, torna-se difícil identificar as origens dos neuritos como eles se sobrepõem uns com os outros. Embora as pilhas de chapeamento em uma baixa densidade possam resolver a edição, a sobrevivência de neurônios preliminares seria reduzida significativamente em uma baixa densidade da pilha27. Os neurônios hippocampal do rato preliminar foram mostrados para crescer saudàvel na densidade entre 40.000 a 100000/cm2 28. Neste protocolo, uma densidade de 65.000/cm2 de neurônios corticais do rato é usada. No entanto, é importante determinar a densidade celular adequada para diferentes tipos de neurônios em diferentes condições experimentais.
A medida do neurite de desenvolver neurônios preliminares do rato (isto é neurônios DIV3) é descrita aqui. No entanto, fenótipos neuronais mais maduros podem ser observados em neurônios além DIV329. Como os efeitos de PIS ou drogas sobre a extensão neurite em neurônios maduros podem ser diferentes dos neurônios em desenvolvimento, a investigação usando neurônios de diferentes estágios proporcionaria uma perspectiva mais abrangente. Vale ressaltar que ainda pudemos observar a expressão do EGFP nos neurônios 7 d pós-transfecção. Isso pode facilitar o estudo de PIS ou drogas sobre o crescimento do neurite em neurônios maduros.
A pilha de haste pluripotente induzida humana (hiPSC)-os neurônios derivados são ferramentas valiosas na identificação de aproximações terapêuticas novas. Por exemplo, a investigação do crescimento do neurite nestas pilhas poderia revelar alvos novos no neuroregeneration enquanto o uso de neurônios hiPSC-derivados evita as diferenças da espécie. Semelhante aos neurônios de roedores primários, os neurônios derivados do hipsc são difíceis de transfecção30, o que pode reduzir a eficiência de cotransfecção de EGFP e o POI. Assim, o uso de vetores de expressão de mamíferos policístrônicos poderia garantir que todas as células transfectadas expressem todo o conjunto de genes transfectados, incluindo EGFP e pis. Adicionalmente, os métodos alternativos da entrega do gene, tais como o electroporation, podem melhorar a eficiência do transfection. Mais uma vez, a viabilidade celular é um problema que precisa ser considerado ao usar tais abordagens de entrega genética.
Sabe-se que o córtex cerebral embrionário do rato contém diferentes tipos de neurônios, incluindo neurônios estelados spiny, neurônios bipolares e neurônios de projeção longa31. Embora este protocolo afirmado aqui possa revelar o efeito geral dos PIS sobre o crescimento do neurite, é possível que o mesmo POI possa apresentar respostas diferentes em diferentes tipos de neurônios. Por exemplo, a Miostatina aumenta o número de axônios sensoriais, mas não o dos axônios motores32. Nesse cenário, é necessária a modificação do protocolo, como o isolamento prévio de tipos específicos de neurônios por citometria de fluxo. Alternativamente, os anticorpos neuronais específicos do marcador podem ser usados para a identificação dos tipos exigidos de neurônios durante a imagem latente.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse com o conteúdo deste artigo.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por fundos do Conselho de auxílios de pesquisa de Hong Kong, saúde e fundo de investigação médica (Hong Kong), regime de subvenção direta da faculdade de administração, o fundo de dotação da United College e o TUYF caridade fiduciário.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
- Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
- Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
- Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
- Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
- Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
- Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
- Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
- Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).
- Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
- He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).
- Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
- Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
- Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).
- Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
- Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).
- Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).
