Summary
هنا ، ونحن وصف خليه واحده الطموح الصغير طريقه للفصل بين الأميبا المصابة. [أين وردر تو] فصلت [سوببوبولايشن] فيروسية في [ فرماميبا] [فرميفورليس ] يعدي ب [فوستوفيروس] وحميات عملاقه مجهوله, طور نحن البروتوكول مفصل أدناه ويبرهن قدرته ان يفصل اثنان [لوو-فري] رواية فيروسات عملاقه.
Abstract
خلال عمليه الثقافة المشتركة الأميبا ، قد يتم عزل أكثر من فيروس واحد في بئر واحده. نحن في السابق حل هذه المسالة عن طريق تخفيف نقطه النهاية و/أو الفرز الخلية المنشطة (FACS) تطبيقها علي السكان الفيروسية. ومع ذلك ، عندما يكون للفيروسات في الخليط خصائص مورفولوجيك مماثله واحده من الفيروسات تتكاثر ببطء ، يتم اكتشاف وجود اثنين من الفيروسات في مرحله التجمع الجينوم والفيروسات لا يمكن فصلها لمزيد من التوصيف. ولحل هذه المشكلة ، قمنا بوضع اجراء أحادي الطموح للخلية يسمح بفصل واستنساخ فيروسات متشابهة للغاية. في هذا العمل ، نقدم كيف سمحت لنا هذه الاستراتيجية البديلة لفصل السكان الفرعيين الفيروسية الصغيرة من كلانديستينوفيروس ST1 والفيروسات المغتصبة LCD7 ، والفيروسات العملاقة التي تنمو ببطء ولا تؤدي إلى تحلل الأميبا بالمقارنة مع التحللي وسريع النمو فوستوفيروس. وتم تقييم الرقابة علي النقاء بواسطة تضخيم جيني محدد ، وأنتجت فيروسات لمزيد من التوصيف.
Introduction
الفيروسات الحمضية النووية الكبيرة النواة (NCLDV) متنوعة للغاية ، والتي تحددها أربع عائلات تصيب نواه النوى1. ووصفت الفيروسات الاولي مع الجينوم أعلاه 300 وكانت Phydcodnaviridae, بما في ذلك الفيروس بيرساريا شلوريلا باراسينيوم 1 PBCV12. العزلة والوصف الأول من Mimivirus ، وأظهرت ان حجم الفيروسات تضاعف من حيث حجم الجسيمات (450 نانومتر) وطول الجينوم (1.2 Mb)3. ومنذ ذلك الحين ، تم وصف العديد من الفيروسات العملاقة ، وعاده ما تكون معزولة باستخدام اجراء الأميبا الثقافة المشتركة. يمكن عزل العديد من الفيروسات العملاقة مع المتحولات المختلفة والمحتويات الوراثية من Acanthamoeba sp. الخلايا ، بما في ذلك مرسيليا ، الفيروسات Pandoraviruses ، الفيروسات ، الفيروسات ، الحمى الطفيلية ، الفيروسات ، ومؤخرا فيروس الورم النخاعي4،5،6،7،8،9،10،11،12، 13،14،15،16،17. في الوقت نفسه ، فان عزله vermamoeba vermamoeba يسمح العزلة ووصف الفيروسات العملاقة faustovirus ، kaumoebavirus ، و اورففيروس18،19،20. تم عزل الفيروسات العملاقة الأخرى مع الأطباء المضيفين ، مثل كافتيريا roenbergensis21، aureococcus أنوفاجيفيرينس22، تشريسوتشرومولينا اريك23، والقفطان بودو 24-الآن وكانت جميع هذه العزلات نتيجة لعدد متزايد من الفرق العاملة في العزل وإدخال تحديثات استراتيجية الانتاجيه العالية25،26،27،28، مثل تحسين نظام الثقافة المشتركة مع استخدام التدفق الخلوي.
في 2016 ، استخدمنا استراتيجية ربط الثقافة المشتركة وتدفق الخلوية لعزل الفيروسات العملاقة27. وقد وضعت هذه الاستراتيجية لزيادة عدد العينات الملقحة ، ولتنويع الأطباء الداعمين المستخدمين كدعامات للخلايا ، وللكشف بسرعة عن تحلل دعم الخلايا. تم تحديث النظام عن طريق أضافه خطوه اضافيه لتجنب تحديد البيولوجيا الجزيئية الاوليه والكشف السريع عن السكان الفيروسية غير معروف كما هو الحال في Pacmanvirus29. اقتران تدفق الخلوي لفرز الخلايا يسمح للفصل بين خليط من Mimivirus و Cedratvirus A1130. ومع ذلك ، واجهنا في وقت لاحق قيود الانفصال والكشف عن هذه السكان الفرعية الفيروسية عن طريق تدفق الخلوي. بعد التسلسل ، عندما جمعنا الجينوم من Faustovirus ST125 و FAUSTOVIRUS LCD7 (البيانات غير المنشورة) ، وجدنا بشكل مدهش في كل تجميع اثنين من الجينوم التكميلي لفيروسين جديدين لم يتم تحديدهما في قواعد بيانات الجينوم العام. ومع ذلك ، فان لا تدفق الخلوي ولا انتقال المجهر الكتروني (TEM) أظهرت ان الأميبا كانت مصابه بفيروسين مختلفين ، كلانديستينوفيروس ST1 و مغتصب الفيروسات LCD7. قمنا بتصميم أنظمه PCR محدده لتضخيم فوستوفيروس ، والفيروسات المغتصبة ، وعلامات كلانديستينوفيروس علي التوالي علي أساس الجينوم الخاصة بهم. كان هدفنا ان يكون النظام القائم علي PCR التي تمكن التحقق من نقاء الفيروسات التي يتم فصلها. ومع ذلك ، فشل التخفيف نقطه النهاية والتدفق الخلوي للفصل بينهما. وكانت عزله هذه المجموعة الفيروسية الوحيدة صعبه لأنه لم يتم وصف العناصر المورفولوجية والمستنسخة لكلانديستينوفيروس والسكان المغتصبين. اكتشفنا واحد فقط من السكان الفيروسية من خلال تدفق الخلوية بسبب تداخل السكان اثنين (اختبار بعد الانفصال الفعلي). حاولنا فصلهم باستخدام واحد الجسيمات الفرز علي لوحات 96-حسنا ، ولكن لم نلاحظ اي اثار خلوي ، واكتشفنا لا كلانديستينوفيروس ولا مغتصب الفيروسات بواسطة PCR التضخيم. وأخيرا ، لم يكن سوي مزيج من تخفيف نقطه النهاية تليها الأميبا الصغيرة الطموح الذي مكن الفصل بين هذين الفيروسات العملاقة منخفضه الوفرة من فوستوفيروس. هذا الأسلوب للفصل هو الكائن من هذه المقالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الأميبا الثقافة
- استخدام فيرماميبا vermamoeba (سلاله CDC19) كدعم الخلية.
- أضافه 30 مل من البروتياز-peptone-استخراج الخميرة-الجلوكوز المتوسطة (PYG) (الجدول 1) و 3 مل من الأميبا في تركيز 1 × 106 خلايا/مل في 75 سم2 خليه ثقافة قارورة.
- الحفاظ علي الثقافة عند 28 درجه مئوية.
- بعد 48 h ، كميه الأميبا باستخدام الشرائح العد.
- لشطف ، حصاد الخلايا في تركيز 1 × 106 خلايا/مل وبيليه الأميبا بواسطة طرد في 720 x g ل 10 دقيقه أزاله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في الحجم المناسب من الجوع المتوسطة للحصول علي 1 × 106 الخلايا/مل (الجدول 1).
2. انتشار فيروس الأسهم في اموباي
ملاحظه: قبل التخفيف ، من المهم ان ثقافة عينه الأسهم للحصول علي ما يكفي من الثقافة الطازجة ، ثم المضي قدما في الترشيح.
- استخدام 1 × 106 من الثقافة الأميبا في المجاعة المتوسطة.
- تطعيم خليط من الفيروسات الصادرة من الحل الأسهم (فوستوفيروس/مغتصب الفيروس LCD7 أو Faustovirus/كلانديستينوفيروس ST1) بعد عمليه الثقافة المشتركة علي دعم الخلية في تعدد العدوى (موي) من 0.01.
ملاحظه: ومن المهم لوزارة الداخلية الحد من وفره السكان الفيروسيين الرئيسيين وعدد الخلايا المصابة. - احتضان في 30 درجه مئوية حتى اثار خلوي (CPE) والمستحثة ، مثل التقريب الأميبا أو تحلل ، ما يقرب من 10 إلى 14 ساعة بعد الاصابه.
- جمع وسائل الاعلام والترشيح من خلال فلتر 5 μm لأزاله الحطام الخلوي.
3. نهاية نقطه التخفيف
- تنفيذ التخفيف التسلسلي (10-1 إلى 10-11) من العينة الفيروسية في المجاعة المتوسطة (الجدول 1).
- تطعيم 2 مل من 1 × 106 vermamoeba vermamoeba الواردة في كل طبق بتري مع 100 μl من الخليط الداخل.
- وضع اطباق بيتري في كيس من البلاستيك القابلة للإغلاق في 30 درجه مئوية.
- بدء مراقبه اطباق بيتري مع المجهر البصري المقلوب في 6 ح بعد الاصابه والتحقق من الشكل الخلية كل 4 إلى 8 ح.
- في ظهور تاثير خلوي تتميز الخلايا التقريب ، تبدا عمليه الصغيرة الخلية الطموح.
4. خليه واحده الطموح الصغير
-
اعداد المضيف.
ملاحظه: يتم اجراء هذا الاعداد للإفراج عن خلايا واحده مصابه إلى دعم خليه جديده.- علاج الأميبا في الثقافة مع عامل مضادات الميكروبات التي تحتوي علي 10 ميكروغرام/مل من فانكوميسين ، 10 ميكروغرام/مل من imipenem ، 20 ميكروغرام/مل من ciprofloxacin ، 20 ميكروغرام/مل من الدوكسيسيكلين ، و 20 ميكروغرام/مل من voriconazole. يستخدم هذا الخليط لتجنب التلوث البكتيري والفطري.
ملاحظه: يتم الاجراء علي مقعد خارج محطه السلامة الميكروبيولوجية. أضافه 2 مل من اموباي تتركز في 1 × 106 خلايا/مل كل في 15 اطباق بيتري. للانضمام الأميبا ، احتضان الثقافة في 30 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
- علاج الأميبا في الثقافة مع عامل مضادات الميكروبات التي تحتوي علي 10 ميكروغرام/مل من فانكوميسين ، 10 ميكروغرام/مل من imipenem ، 20 ميكروغرام/مل من ciprofloxacin ، 20 ميكروغرام/مل من الدوكسيسيكلين ، و 20 ميكروغرام/مل من voriconazole. يستخدم هذا الخليط لتجنب التلوث البكتيري والفطري.
- حدد طبق بيتري المستخدم لتحقيق الطموح المتناهي الصغر من تخفيف الحد وفقا للمعايير التالية: 1) عدم وجود اي تلوث مرئي من قبل العوامل الفطرية والبكتيرية ، 2) دليل علي تاثير الأميبا من اموباي بسبب الفيروسات ، و 3) بريليسيس والتقريب المرحلة من اموباي (لتجنب الطموح من الجزيئات الفيروسية).
-
اعداد محطه عمل بالمواد التالية (انظر الشكل 1ا ، ب):
الجزئي ، والذي يسمح لتحديد المواقع ميكروشعري ؛
دليل جهاز ضغط التحكم ، وتستخدم ليستنشق والإفراج عن الخلايا في ميكروشعري.
المجهر المقلوب;
التوصيل والتشغيل وحدات المحرك;
كاميرا
وحده الكمبيوتر لتصور التلاعب والتقاط الصور. - اختيار ميكروشعري (انظر الشكل 1ج).
ملاحظه: حجم الخلايا ، وتشوه والتصاق اغشيها علي الأسطح ، والحركية الخلوية يمكن ان تؤثر علي التقدم السلس للتطلع الصغرى. يمكن اختيار قطر الشعيرات المجهرية بدقه وتكييفها مع أنواع خلايا محدده اعتمادا علي احجامها وطرق الطموح. وقد استخدم ميكروشعري من القطر الداخلي 20 ميكرومتر ليستنشق الأميبا التقريب (قطر ~ 10 μm). وهذا يسمح بالحفاظ علي موقف داخلي وسهوله الإفراج عن الخلية. -
جبل النظام.
- إصلاح زاوية التشغيل للنظام تجتاح علي وحده بمحرك في 45 درجه.
- اجراء تثبيت مزدوج ، أولا علي نظام تجتاح ، ومن ثم علي ميكروشعري.
- التركيز علي الخلايا بعد تشغيل بضع قطرات من النفط من خلال ميكروشعري.
ملاحظه: يتم توفير النفط المعدنية مع التوافق البيولوجي من قبل الجهاز. - إكمال المتزايدة التالية توصيات الشركة المصنعة.
-
استنساخ الخلايا (انظر الشكل 2ا ، ب).
ملاحظه: هذا الاجراء مشابه لواحده التي وصفها Fröhlich و كونيغ31.- ضع طبق بيتري الذي يحتوي علي 2 مل من اموباي المصابة تحت المجهر.
- التركيز أولا علي الخلايا ، ومن ثم علي ميكروشعري مغمورة في الثقافة.
- اختيار خليه واحده مدوره وجلب ميكروشعري أقرب إلى الجزئي.
- ممارسه الطموح الناعم مع التحكم في الضغط اليدوي علي الخلية ، مع الأخذ بها داخل ميكروشعري. أزاله خليه واحده من العينة الاولي والإفراج في دعم الخلوية ، ثم احتضان عليه في 30 درجه مئوية.
- اجراء الملاحظات اليومية مع المجهر البصري المقلوب لمراقبه ظهور الخلايا ورصد ظهور تاثير السيتواثيك.
5. فحص PCR
ملاحظه: وبعد الخطوة 4 ، يعد الفحص المنهجي من قبل PCR أمرا حاسما لتاكيد الانفصال. في كل من الفيروسات المغتصبة/Faustovirus و كلانديستينوفيروس/Faustovirus ، تم تصميم وتطبيق التمهيدي محدده ونظم التحقيق باستخدام التمهيدي الانفجار علي الإنترنت32 (الجدول 2).
- استخراج الحمض النووي من جزء من عينات الثقافة الايجابيه (اي ، حيث لوحظ تاثير خلوي) ، وذلك باستخدام نظام استخراج الألى وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- استخدام الإشعال مصممه بشكل مناسب.
ملاحظه: هنا قمنا بتصميم الإشعال لتضخيم الجينات الاساسيه المشروحة كما RpB2 (فوستوفيروس) ، LCD7 البروتين كابسيد الرئيسية (المغتصبة) والبروتين كابسيد طفيفه (كلانديستينوفيروس) -
اجراء PCR القياسية باستخدام ثيرموسيكلير.
- تنفيذ 20 μL PCR ردود الفعل مع 50 μM من كل التمهيدي (الجدول 2) ، 1X ماستر ميكس ، و RNase المياه الحرة.
- قم بتنشيط الحمض النووي الريبي لمده 5 دقائق عند 95 درجه مئوية ، ثم اتبع مع 45 دوره من 10 ليالي التشبع في 95 درجه مئوية ، والصلب من الإشعال لمده 30 ثانيه في 58 درجه مئوية ، والتمديد ل 30 ثانيه في 72 درجه مئوية.
- تشغيل المنتجات PCR علي هلام 1.5 ٪ اجنشا ، وصمه عار مع هلام الحمض النووي وصمه عار (جدول المواد) ، وتصور مع الاشعه فوق البنفسجية.
6. إنتاج وتنقيه الفيروسات
- وضع بقية الثقافة طبق بيتري مره أخرى في قارورة صغيره.
- لإنتاج الفيروس ، واعداد 15 قوارير من 145 سم2، التي تحتوي علي 40 مل من vermamoeba فيرميفورليس في المجاعة المتوسطة و 5 مل من الفيروس معزولة نقلت بالفعل من طبق بيتري إلى قوارير صغيره.
- علاج بنفس المضادات الحيوية والخليط المضاد للفطريات المستخدم في الخطوة 4.1.
- احتضان في 30 درجه مئوية. راقب كل يوم مع المجهر البصري المقلوب.
- بعد العدوى الكاملة ، تجمع جميع قوارير. استخدام فلتر 0.45 μm للقضاء علي الحطام.
- Ultracentrifuge جميع supernatants في 50,000 x g ل 45 دقيقه.
- بعد طرد ، وأزاله ماده طافي من كل أنبوب عن طريق الطموح وأعاده تعليق بيليه في 1 مل من الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا (تلفزيوني).
- تنقيه الفيروس المنتجة باستخدام السكروز 25 ٪ (27.5 ز السكروز في 100 mL من تلفزيوني ، تعقيمها عن طريق الترشيح).
- الطرد المركزي 8 مل من السكروز و 2 مل من تعليق الفيروسية في 80,000 x g لمده 30 دقيقه. أعاده تعليق بيليه الفيروسية في 1 مل من تلفزيوني. خزنه في-80 درجه مئوية.
7. السلبية تلطيخ وانتقال المجهر الكترون
ملاحظه: وقد نشر بو خليل وآخرون هذاالبروتوكول فيالسابق.
- إيداع 5 μl من ماده طافي تحلل علي الشبكة التي خرجت توهج. يترك لمده 20 دقيقه تقريبا في درجه حرارة الغرفة.
ملاحظه: وتوهج التفريغ يسمح لنا للحصول علي شبكه هيدروفيله عن طريق تطبيق البلازما. - تجفيف الشبكة بعناية وإيداع قطره صغيره من 1 ٪ موليبدات الأمونيوم علي ذلك ل 10 ليالي. اترك الشبكة لتجف لمده 5 دقائق.
- المضي قدما إلى ملاحظات المجهر الكتروني في 200 كيلو.
8-توصيف الكلانديستينوفيروس ST1 والفيروس المغتصب LCD7
- توصيف السكان النقيين من كلانديستينوفيروس ST1 والفيروسات المغتصبة LCD7 باستخدام التسلسل الجينوم ، والتجمع الجينوم ، وتحليلات المعلوماتية الحيوية ، ودراسة دورتها المستنسخة كما فعلنا للفيروسات أخرى10،20، 29-الآن
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشفط الدقيق للخلايا الواحدة هو عمليه المعالجة الجزئية الأمثل في هذه المخطوطة (الشكل 1). تمكن هذه التقنية من التقاط الأميبا المدورة المصابة (الشكل 2ا) وإطلاقها في لوحه جديده تحتوي علي اميباي غير مصاب (الشكل 2). وهو نموذج وظيفي التي تنطبق علي نظام الثقافة المشتركة ونجحت في عزل الفيروسات العملاقة غير الليتيك. وقد استخدم هذا النهج لأول مره في مجال الفيروسات العملاقة وجعل من الممكن لعزل اثنين من الفيروسات العملاقة منخفضه الوفرة الجديدة. سمينا الفيروسات الجديدة كلانديستينوفيروس ST1 والفيروسات المغتصبة LCD7 ، التي كانت في وفره منخفضه بالمقارنة مع وفره عاليه فوستوفيروسات. من أجل تحليل الوجود الفيروسي في كل لوحه بعد اجراء الطموح المتناهي الصغر ، قمنا بتطبيق PCR علي الطموحات الصغرى ال 15. لاحظنا الفيروسات المغتصبة النقية (وجود مغتصب الفيروسات LCD7 [+] وغياب Faustovirus [-]) فقط في استنساخ 7 (الشكل 3). وأكدت نقاء استنساخ من قبل PCR مع بروتوكولات محدده تستهدف كلانديستينوفيروس ST1 و مغتصب الفيروسات LCD7 (الجدول 2). وكشف المجهر الكتروني عن ظهور كلانديستينوفيروس ST1 والفيروس المغتصب LCD7 (الشكل 4) ، والتي لها شكل نموذجي من السطوح التقليدية المجسمة بدون ألياف ليفية والغطاء المائل للعشري من حوالي 250 نانومتر ، علي التوالي. بعد تاكيد نقاء الإنتاج ، تم إنتاج وتنقيه الفيروس النسيلي لتسلسل الجينوم الكامل ومزيد من التوصيف ، وخاصه انتقال المجهر الكتروني (TEM) لدراسات دوره الضرب. وأكدنا تداخل السكان (فوستوفيروس/رواية فيروس) من خلال تدفق الخلوي (الشكل 5).
الشكل 1: المواد الخاصة بالتدخل الجزئي. (ا) الاعداد الفعلي لمحطهالعمل. (ب) التوضيح التخطيطي لمكونات محطه العمل. (ج) الرسم التخطيطي للميكروشعري المجهري. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: خطوات الطموح الجزئي. (ا) اجراء عزل خليه واحده (تكبير/تصغير x40). (ب) التوضيح التخطيطي للخطوات المختلفة لطموح الخلية الواحدة: 1) توطين الخلية. 2) الطموح من الخلية. 3) الإفراج عن الخطوة. تظهر الأسهم السوداء الشعرية المجهرية والبيضاء تظهر الخلية الواحدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: فحص وتاكيد PCR. فحص [بكر] من طموحات دقيقه يوفي ل [مغتصب] حمي LCD7 و [فوستوفيروس]. وجود LCD7 الحمض النووي المغتصب (+) وغياب الحمض النووي Faustovirus (–) لاحظ لاستنساخ 7 بعد الاجراء الطموح الجزئي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الرسم المجهري السلبي التلطيخ. تلطيخ سلبي من تعليق الفيروسية ، والتي تبين نقيه كلانديستينوفيروس ST1 (A) و مغتصب الفيروسات LCD7 (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مؤامرات البوابة التمثيلية. (ا) الفرض الفائق لكل واحد من السكان الفيروسيين الملطخين سابقا بالمسبارات الجزيئية الفلورية لوسم الدنا بالفيروس (بعد البروتوكول26و 30 الموصوفسابقا). يظهر الجزء الأيسر من الصورة الوضع الفائق لخمس سلالات من الفيروسات السوداء (الأخضر الداكن والأخضر الفاتح والبرتقالي والأحمر والأزرق). علي اليمين ، والوضع الفائق من Faustovirus ST1 و كلانديستينوفيروس ST1 (الأرجواني الفاتح والأرجواني الداكن) مرئية. (ب) وجود اثنين من السكان الفيروسيين من الفيروس المغتصب والفيروس في نفس البوابة مثل فوستوفيروس (يسار). وهناك مؤامرة نقطه من الفيروسات المغتصبة النقية يظهر نفس البوابة المحددة سابقا ل Faustovirus (يمين). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| تكوين PYG | كميات |
| بروتين بيبتوون | 20 ح |
| مستخلص الخميرة | 20 ح |
| MgSO4· 7h2س | 0.980 غ |
| CaCl2 | 0.059 غ |
| سيترات الصوديوم. هيدرات | 1 ح |
| Fe (NH4) 2 (SO4) 2 × 6h2س | 0.02 غ |
| الجلوكوز | 18 ح |
| الماء المقطر | 1 لتر |
| ضبط درجه الحموضة في 6.8 مع حمض الهيدروكلوريك أو كوة | |
| الاوتوكلاف 15 دقيقه في 121 درجه مئوية | |
| مجاعة متوسطه | quantites |
| مستخلص الخميرة | 2 غ |
| الجلوكوز | 18 ح |
| Fe (NH4) 2 (SO4) 2 × 6h2س | 0.02 غ |
| PAS (مفصله أدناه) | 1 لتر |
| حل PAS A | quantites |
| KH2PO4 | 0.136 غ |
| Na2hpo4 | 0.142 غ |
| حل PAS B | quantites |
| MgSO4· 7h2س | 4.0 ملغ |
| CaCl2· 2h2س | 4.0 ملغ |
| كلوريد | 0.120 غ |
| 10 مل كل من الحل A و B تضاف إلى 1 لتر من الماء المقطر. |
الجدول 1: تكوين وسائل الاعلام الثقافية.
| هدف الفيروسات | هدف مورثه | النار التمهيدي (5-> 3) | التمهيدي العكسي (5-> 3) |
| فوستوفيروس RpB2 | RpB2 | الجمعية الكاثوليكية | الاسئله التي يمكن ان |
| مغتصب الفيروسات LCD7 الرئيسية كابسيد الجينات | مورثه رئيسيه [كبسيد] | في الانجليزيه | المجموعة الثالثة |
| كلانديستينوفيروس ST1 الجينات كابسيد الصغرى | مورثه صغيره [كبسيد] | الشركة الانجليزيه | في الانجليزيه |
الجدول 2: المتواليات البدائية المستخدمة لل PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتتوقف مده معالجه الاستنشاق الدقيق للخلية الواحدة وأداءها الجيد علي المشغل. تتطلب الخطوات المختلفة للتجربة الدقة. يجب ان يكون استخدام مكونات المعالجة التفصيلية لمحطه العمل تحت السيطرة المستمرة من خلال مراقبه عمليه الطموح المتناهي الصغر وإطلاق الخلية. والمتابعة بالرصد المجهري ضرورية للقبض علي الزنزانة ونقلها. يمكن للمشغل من ذوي الخبرة ان ياخذ 1 إلى 2 ساعة لعزل 10 خلايا وأعاده نقلها واحدا تلو الآخر اعتمادا علي وفره الفيروسات التي سيتم عزلها. يمكن ان يختلف عدد التلاعبات. ونحن ننصح بداية مع 10 التلاعب. بحكم التعريف ، ونحن لا نعرف الخصائص الجوهرية للفيروس غير معروف. التالي ، فان استخدام وتطوير استراتيجيات مختلفه للعزل أمر ضروري لتحقيق النجاح الأمثل للفصل بين هذه الفيروسات.
يتم تنفيذ عمليه الطموح الجزئي في ظل ظروف غير معقمه (علي مقعد خارج محطه السلامة الميكروبيولوجية) التالي يقيد استخدامه ويمنع تطبيقه لدراسة مسببات الامراض البشرية. ولذلك ، فان استخدام خليط من المضادات الحيوية ومضادات الفطريات للحد من الملوثات أمر إلزامي. وهناك قيد آخر علي هذه الطريقة هو انه لا يمكن الا ان يؤديها علي الكائنات المجهرية التي يمكن ملاحظتها بواسطة المجهر الضوئي الذي شنت عليه مكونات الجزئي ، التالي ، القضاء علي اي عمل من الناحية المفاهيمية علي الكائنات المجهرية لا يمكن ملاحظتها بالضوء مجهريه. ومع ذلك ، تمكنا من فصل الفيروسات العملاقة من حوالي 200 نانومتر التي لا تزال غير مرئية تحت المجهر الضوئي باستخدام استراتيجية غير مباشره تتالف من فصل واستنساخ المضيفين المصابين.
تطوير خليه واحده الطموح الصغير للتقاط الأميبا هو جزء من تطوير طرق فرز السكان. سمحت لنا خليه واحده الطموح الصغير لعزل اثنين من الفيروسات العملاقة الجديدة ، كلانديستينوفيروس ST1 و مغتصب الفيروسات LCD7 ، مع خصائص مميزه من فوستوفيروسيس. الخصائص المورفولوجية مشابهه للغاية من كل من كلانديستينوفيروس ST1 والفيروسات المغتصبة LCD7 إلى Faustovirus LCD7 وفرقها من النسخ المتماثل يظهر الحد من FACS ، والتي عاده ما تستخدم في الفيروسات العملاقة الفرز. هو مثلت بالموقعة فائقه من اثنان مجموعه سكانية فيروسية, كلانديستينوفيروس ST1 و [فوستوفيروس] ST1 (شكل 5[ا]) وأيضا بالاكتشاف ل [اوسوبرتيفيروس] LCD7 و [فوستوفيروس] LCD7. ومع ذلك ، مع هذه الطريقة الجديدة ، والتلاعب بأكمله تحت السيطرة البصرية مع رصد دقيق للخلية وسلامتها حتى بعد الإفراج عنها. استخدام التدفق الخلوي لفرز مباشره الأميبا المصابة يمكن ان يكون حلا بديلا لفرز غير مباشر الفيروسات الرواية. وعاده ما يتبع هذا الأسلوب من خلال فحص لوحه من أجل الكشف عن اثار خلوي أو تحلل. وجود الفيروسات غير الليتيك في المزيج يمكن ان تمثل حدا للفرز الأميبا. ومع ذلك ، لم يتم استكشاف هذا في إنشاء هذا البروتوكول ولهذه العزلة الرواية اثنين.
ما وراء تطبيق الجزئية في تحديد المواقع وعقد الخلايا بشكل عام والبويضات لحقن السائل المنوي داخل الداخل (المجهري)33، وقد ثبت الطموح الصغير خليه واحده لتكون طريقه عمليه لعزل واحد الخلايا البدائية النواة يمكن ملاحظتها تحت المجهر البصري31. ويمكن اختبار التطبيقات الأخرى ، بما في ذلك فرز الخلايا علي أساس مورفولوجية لتكون عينات نقيه مختلفه من عينه مختلطة من الكائنات المجهرية. يمكن تصور الفصل المرئي للكائنات المجهرية باستخدام الاستراتيجية الموصوفة أعلاه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
جميع الكتاب ليس لديهم شيء للكشف عنه.
Acknowledgments
ويود المؤلفان ان يشكرا كلا من جان بيير باودوين واوليفييه مباريك علي مشورتهما وكلير اندرياني لمساعدتها في التصحيحات والتعديلات الانكليزيه. وكان هذا العمل مدعوما بمنحه من الدولة الفرنسية التي تديرها وكاله البحوث الوطنية في اطار برنامج "إينفيستيسيمينتس d'avenir (الاستثمارات من أجل المستقبل)" مع الاشاره ANR-10-اياهو-03 (عدوي البحر المتوسط) وبواسطة ريوجيون بروفانس الألب كوت دازور والتمويل الأوروبي FEDER PRIMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 with Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2 | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
References
- Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses. Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).
- Li, Y., et al. Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome. Virology. 237 (2), 360-377 (1997).
- Scola, B. L. A Giant Virus in Amoebae. Science. 299 (5615), 2033 (2003).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Antwerpen, M. H., et al. Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba. Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).
- Legendre, M., et al. In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).
- Legendre, M., et al. Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family. Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).
- Aherfi, S., et al. A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses. Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).
- Andreani, J., et al. Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses. Viruses. 8 (11), 300 (2016).
- Rodrigues, R. A. L., et al. Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses. Journal of Virology. , 00372 (2018).
- Bertelli, C., et al. Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity. Environmental Microbiology. , (2017).
- Levasseur, A., et al. Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution. Genome Biology and Evolution. , (2016).
- Dornas, F. P., et al. A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae. Viruses. 8 (3), 76 (2016).
- Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water. Journal of Virology. , (2019).
- Legendre, M., et al. Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes. Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).
- Abrahão, J., et al. Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere. Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).
- Bajrai, L., et al. Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae. Viruses. 8 (12), 278 (2016).
- Andreani, J., et al. Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses. Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).
- Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Moniruzzaman, M., et al. Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution. Virology. 466-467, 60-70 (2014).
- Gallot-Lavallée, L., Blanc, G., Claverie, J. -M. Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family. Journal of Virology. , (2017).
- Deeg, C. M., Chow, C. -E. T., Suttle, C. A. The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea. eLife. 7, 235 (2018).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).
- Khalil, J. Y. B., et al. High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining. Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).
- Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).
- Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. Updating strategies for isolating and discovering giant viruses. Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).
- Andreani, J., et al. Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses. Journal of Virology. , (2017).
- Khalil, J. Y. B., et al. Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).
- Fröhlich, J., König, H. New techniques for isolation of single prokaryotic cells. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).
- Kimura, Y., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).
