Summary
Hier beschreiben wir eine einzellige Mikro-Aspirationsmethode zur Trennung infizierter Amöben. Um virale Subpopulationen in Vermamoeba vermiformis zu trennen, die mit Faustoviren und unbekannten Riesenviren infiziert sind, haben wir das unten beschriebene Protokoll entwickelt und seine Fähigkeit demonstriert, zwei neuartige Riesenviren mit geringem Überfluss zu trennen.
Abstract
Während des Amöben-Cokulturprozesses kann mehr als ein Virus in einem einzigen Brunnen isoliert werden. Wir haben dieses Problem zuvor durch Endpunktverdünnung und/oder Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) gelöst, die auf die Viruspopulation angewendet wurde. Wenn die Viren in der Mischung jedoch ähnliche morphologische Eigenschaften haben und sich eines der Viren langsam vermehrt, wird das Vorhandensein von zwei Viren im Stadium der Genom-Montage entdeckt und die Viren können nicht für eine weitere Charakterisierung getrennt werden. Um dieses Problem zu lösen, haben wir ein einzelliges Mikro-Aspirationsverfahren entwickelt, das die Trennung und das Klonen von sehr ähnlichen Viren ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit stellen wir vor, wie diese alternative Strategie es uns ermöglichte, die kleinen viralen Subpopulationen des Clandestinovirus ST1 und des Usurpativirus LCD7 zu trennen, Riesenviren, die langsam wachsen und nicht zu Amöbenlyse im Vergleich zu der lytischen und schnell wachsenden Faustovirus. Die Reinheitskontrolle wurde durch spezifische Genverstärkung bewertet und Viren für die weitere Charakterisierung produziert.
Introduction
Nukleozytoplasmatische große DNA-Viren (NCLDV) sind extrem vielfältig und werden von vier Familien definiert, die Eukaryote infizieren1. Die ersten beschriebenen Viren mit Genomen über 300 kbp waren Phydcodnaviridae, einschließlich Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 PBCV12. Die Isolierung und die erste Beschreibung des Mimivirus zeigten, dass sich die Größe der Viren sowohl in Bezug auf die Größe des Teilchens (450 nm) als auch auf die Länge des Genoms (1,2 Mb)3verdoppelte. Seitdem wurden viele Riesenviren beschrieben, die in der Regel mit einem Amöben-Co-Kulturverfahren isoliert werden. Mehrere Riesenviren mit unterschiedlichen Morphologien und genetischen Inhaltsstoffen können aus Acanthamoeba sp. Zellen isoliert werden, einschließlich Marseilleviren, Pandoraviren, Pithoviren, Mollivirus, Cedratviren, Pacmanvirus, Tupanvirus und vor kurzem Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Parallel dazu ermöglichte die Isolierung von Vermamoeba vermiformis die Isolierung und Beschreibung der Riesenviren Faustovirus, Kaumoebavirus und Orpheovirus18,19,20. Andere Riesenviren wurden mit ihren Wirtsprotisten isoliert, wie Cafeteria roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23und Bodo saltans 24. Alle diese Isolationen waren das Ergebnis einer wachsenden Anzahl von Teams, die an der Isolation arbeiten, und der Einführung von Strategieaktualisierungen mit hohem Durchsatz25,26,27,28, wie z. B. Verbesserung des Cokultursystems durch den Einsatz von Durchflusszytometrie.
Im Jahr 2016 haben wir eine Strategie verwendet, die Co-Kultur und Durchflusszytometrie assoziiert, um Riesige Viren zu isolieren27. Diese Strategie wurde entwickelt, um die Anzahl der geimpften Proben zu erhöhen, Protisten, die als Zellstützen verwendet werden, zu diversifizieren und die Lyse der Zellunterstützung schnell zu erkennen. Das System wurde durch hinzufügen eines zusätzlichen Schritts aktualisiert, um eine vorläufige molekularbiologische Identifizierung und schnellen Nachweis einer unbekannten Viruspopulation wie im Fall von Pacmanvirus29zu vermeiden. Die Kopplung der Durchflusszytometrie zur Zellsortierung ermöglichte die Trennung einer Mischung aus Mimivirus und Cedratvirus A1130. Später stießen wir jedoch auf die Grenzen der Trennung und Detektion dieser viralen Subpopulationen durch Durchflusszytometrie. Nach der Sequenzierung, als wir die Genome des Faustovirus ST125 und des Faustovirus LCD7 (unveröffentlichte Daten) zusammenstellten, fanden wir in jeder Baugruppe überraschenderweise zwei zusätzliche Genome von zwei neuartigen Viren, die in öffentlichen Genomdatenbanken nicht identifiziert wurden. Weder die Durchflusszytometrie noch die transmissionselektronische Mikroskopie (TEM) zeigten jedoch, dass die Amöben mit zwei verschiedenen Viren infiziert waren, dem Clandestinovirus ST1 und dem Usurpativirus LCD7. Wir haben spezielle PCR-Systeme entwickelt, um Faustovirus, Usurpativirus und Clandestinovirus-Marker auf der Grundlage ihrer Genome zu verstärken; Unser Ziel war es, PCR-basierte Systeme zu haben, die eine Überprüfung der Reinheit der zu trennenden Viren ermöglichen. Die Endpunktverdünnung und die Durchflusszytometrie konnten sie jedoch nicht trennen. Die Isolierung dieser einzelnen Viruspopulation war schwierig, da weder die Morphologie noch die replizierenden Elemente der Populationen des Clandestinovirus und des Usurpativirus charakterisiert wurden. Wir haben aufgrund der Überlappung der beiden Populationen (getestet nach der effektiven Trennung) nur eine Viruspopulation durch Durchflusszytometrie festgestellt. Wir haben versucht, sie mit einer einzigen Partikelsortierung auf 96-Well-Platten zu trennen, aber wir haben keine zytopathischen Effekte beobachtet, und wir haben weder Clandestinovirus noch Usurpativirus durch PCR-Verstärkung entdeckt. Schließlich war es nur die Kombination der Endpunktverdünnung gefolgt von einem einzigen Amöben-Mikro-Aspiration, die die Trennung dieser beiden mit geringer Häufigkeit reichenden Riesenviren von Faustoviren ermöglichte. Diese Trennungsmethode ist Gegenstand dieses Artikels.
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Protocol
1. Amoeba Kultur
- Verwenden Sie Vermamoeba vermiformis (Stamm CDC19) als Zellunterstützung.
- 30 ml Protease-Pepton-Hefe-Extrakt-Glukosemedium (PYG)(Tabelle 1) und 3 ml Amöben in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml in einem 75 cm2 Zellkulturkolben hinzufügen.
- Pflegen Sie die Kultur bei 28 °C.
- Nach 48 h die Amöbe mit Zählfolien quantifizieren.
- Zum Spülen, Ernten Sie die Zellen in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml und pellet die Amöbe durch Zentrifugation bei 720 x g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet im entsprechenden Volumen des Hungermediums wieder auf, um 1 x 10 6 zu erhalten Zellen/ml (Tabelle 1).
2. Verbreitung des Aktienvirus in Amöben
HINWEIS: Vor der Verdünnung ist es wichtig, die Stammprobe zu kulturisieren, um genügend frische Kultur zu erhalten, und dann zur Filtration überzugehen.
- Verwenden Sie 1 x 106 Amöbenkultur im Hungermedium.
- Impfen Sie die Mischung von Viren, die aus der Stammlösung (Faustovirus/Usurpativirus LCD7 oder Faustovirus/Clandestinovirus ST1) nach dem Kokulturverfahren auf die Zellunterstützung bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 0,01 ausgegeben werden.
HINWEIS: Die MOI ist wichtig, um die Fülle der großen viruspopulation und die Anzahl der infizierten Zellen zu reduzieren. - Inkubieren Sie bei 30 °C, bis zytopathische Wirkungen (CPE) induziert werden, wie Amöbenrundung oder Lyse, etwa 10 bis 14 h nach der Infektion.
- Sammeln Sie die Medien und filtrat durch einen 5 m Filter, um Zellablagerungen zu entfernen.
3. Endpunktverdünnung
- Führen Sie eine serielle Verdünnung (10-1 bis 10-11) der Virusprobe im Hungermedium (Tabelle 1) durch.
- 2 ml von 1 x 106 Vermamoeba vermiformis in jeder Petrischale mit 100 l des Gemischs Inoculum impfen.
- Die Petri-Gerichte bei 30 °C in eine verschließbare Plastiktüte geben.
- Beginnen Sie mit der Beobachtung der Petrischalen mit invertierter optischer Mikroskopie bei 6 h Nachinfektion und überprüfen Sie die Zellmorphologie alle 4 bis 8 h.
- Beginnen Sie beim Auftreten des zytopathischen Effekts, der durch Rundungszellen gekennzeichnet ist, den einzelzelligen Mikro-Aspirationsprozess.
4. Single Cell Micro-Aspiration
-
Bereiten Sie den Host vor.
HINWEIS: Dieses Präparat wird für die Freisetzung infizierter Einzelzellen in eine Frischzellenstütze hergestellt.- Behandeln Sie die Amöben in der Kultur mit einem antimikrobiellen Mittel, das 10 g/ml Vancomycin, 10 g/ml Imipenem, 20 g/ml Ciprofloxacin, 20 g/ml Doxycyclin und 20 g/ml Voriconazol enthält. Diese Mischung wird verwendet, um bakterielle und Pilzkontamination zu vermeiden.
HINWEIS: Das Verfahren findet auf einer Bank außerhalb der mikrobiologischen Sicherheitsstation statt. Fügen Sie 2 ml Amöbe konzentriert bei 1 x 106 Zellen/ml jeweils in 15 Petrischalen. Für Amöben-Haftung, inkubieren Sie die Kultur bei 30 °C für 30 min.
- Behandeln Sie die Amöben in der Kultur mit einem antimikrobiellen Mittel, das 10 g/ml Vancomycin, 10 g/ml Imipenem, 20 g/ml Ciprofloxacin, 20 g/ml Doxycyclin und 20 g/ml Voriconazol enthält. Diese Mischung wird verwendet, um bakterielle und Pilzkontamination zu vermeiden.
- Wählen Sie die Petrischale, die für die Mikroaspiration verwendet wird, aus der Grenzwertverdünnung nach den folgenden Kriterien aus: 1) Fehlen einer sichtbaren Kontamination durch Pilz- und Bakterienmittel, 2) Nachweis der zytopathischen Wirkung von Amöben aufgrund der Viren und 3) Prälyse und Rundungsphase der Amöbe (um das Abstreben von Viruspartikeln zu vermeiden).
-
Einrichten einer Arbeitsstation mit folgenden Materialien (siehe Abbildung 1A,B):
Mikromanipulator, der mikrokapillare Positionierung ermöglicht;
Manuelle Spulendruckvorrichtung, die zum Aspirieren und Freilassen der Zellen in die Mikrokapillare verwendet wird;
Invertiertes Mikroskop;
Plug&play Motormodule;
Kamera;
Computermodul zur Visualisierung von Manipulationen und Zum Aufnehmen von Bildern. - Wählen Sie eine Mikrokapillare (siehe Abbildung 1C).
HINWEIS: Die Größe der Zellen, die Verformung und Haftung ihrer Membranen an den Oberflächen und die zelluläre Beweglichkeit können den reibungslosen Fortschritt der Mikroaspiration beeinflussen. Der Mikrokapillardurchmesser kann je nach Größe und Aspirationsmethode präzise ausgewählt und an bestimmte Zelltypen angepasst werden. Eine Mikrokapillare mit einem Innendurchmesser von 20 m wurde verwendet, um eine rundende Amöbe (Durchmesser 10 m) zu saugen. Dies ermöglicht die Aerhalt einer inneren Position und eine einfache Freisetzung der Zelle. -
Montieren Sie das System.
- Fixieren Sie den Betriebswinkel des Greifsystems am motorisierten Modul auf 45°.
- Führen Sie eine Doppelinstallation durch, zuerst auf dem Greifsystem und dann auf der Mikrokapillare.
- Konzentrieren Sie sich auf die Zellen, nachdem Sie ein paar Tropfen Öl durch die Mikrokapillare laufen.
HINWEIS: Das Mineralöl mit biologischer Verträglichkeit wird vom Gerät geliefert. - Komplette Montage nach den Empfehlungen des Herstellers.
-
Klonzellen (siehe Abbildung 2A,B).
HINWEIS: Dieses Verfahren ähnelt dem von Fröhlich und König31beschriebenen.- Die Petrischale mit 2 ml infizierter Amöbe unter das Mikroskop stellen.
- Konzentrieren Sie sich zuerst auf die Zellen, und dann auf die Mikrokapillare in der Kultur eingetaucht.
- Wählen Sie eine abgerundete Einzelzelle und bringen Sie die Mikrokapillare näher an den Mikromanipulator.
- Üben Sie weiche Aspiration mit manueller Druckregelung auf die Zelle und nehmen Sie sie in die Mikrokapillare. Entfernen Sie die Einzelzelle aus der ersten Probe und lassen Sie sie in der zellulären Unterstützung frei, und inkubieren Sie sie dann bei 30 °C.
- Führen Sie tägliche Beobachtungen mit einem invertierten optischen Mikroskop durch, um das Aussehen der Zellen zu beobachten und die Entstehung des zytopathischen Effekts zu überwachen.
5. PCR-Screening
HINWEIS: Nach Schritt 4 ist ein systematisches Screening durch PCR entscheidend, um die Trennung zu bestätigen. Sowohl bei Usurpativirus/Faustovirus als auch bei Clandestinovirus/Faustovirus wurden das Design und die Anwendung der spezifischen Primer- und Sondensysteme mit Primer-BLAST online32 (Tabelle 2) durchgeführt.
- Extrahieren Sie DNA aus einem Teil der positiven Kulturproben (d. h. bei beobachteter zytopathischer Wirkung) unter Verwendung eines automatisierten Extraktionssystems gemäß dem Herstellerprotokoll.
- Verwenden Sie entsprechend gestaltete Primer.
HINWEIS: Hier haben wir Primer entwickelt, um Kerngene zu verstärken, die als RpB2 (Faustovirus), LCD7-Hauptcapsidprotein (Usurpatvirus) und kleineres Capsid-Protein (Clandestinovirus) mit Anmerkungen verwoben sind. -
Führen Sie Standard-PCR mit einem Thermocycler aus.
- Führen Sie 20 L PCR-Reaktionen mit 50 m pro Primer(Tabelle 2), 1x Master Mix und RNase-freies Wasser durch.
- Aktivieren Sie die Taq DNA-Polymerase für 5 min bei 95 °C, dann folgen Sie mit 45 Zyklen von 10 s Denaturierung bei 95 °C, Glühen der Primer für 30 s bei 58 °C und Verlängerung für 30 s bei 72 °C.
- Führen Sie die PCR-Produkte auf einem 1,5% Agarose-Gel, Fleck mit DNA-Gel-Färbung (Tabelle der Materialien), und visualisieren mit UV.
6. Virusproduktion und -reinigung
- Setzen Sie den Rest der Petrischale Kultur wieder in einem kleinen Kolben.
- Für die Virusproduktion 15 Kolben von 145 cm2vorbereiten, die 40 ml Vermamoeba vermiformis im Hungermedium und 5 ml des isolierten Virus enthalten, die bereits von der Petrischale auf kleine Kolben übertragen wurden.
- Behandeln Sie mit dem gleichen Antibiotikum und Antimykotika-Mischung in Schritt 4.1 verwendet.
- Bei 30 °C inkubieren. Beobachten Sie jeden Tag mit invertierter optischer Mikroskopie.
- Nach der vollständigen Infektion alle Kolben bündeln. Verwenden Sie einen 0,45 m-Filter, um Schmutz zu beseitigen.
- Ultrazentrifugieren Sie alle Überräube bei 50.000 x g für 45 min.
- Nach der Zentrifugation den Überstand aus jedem Rohr durch Aspiration entfernen und das Pellet in 1 ml Phosphatgepufferter Saline (PBS) wieder aufsetzen.
- Reinigen Sie das Virus, das mit 25% Saccharose (27,5 g Saccharose in 100 ml PBS, sterilisiert durch Filtration) hergestellt wird.
- Zentrifuge 8 ml Saccharose und 2 ml der viralen Suspension bei 80.000 x g für 30 min. Das virale Pellet in 1 ml PBS wieder aufsetzen. Lagern Sie es bei -80 °C.
7. Negative Färbe- und Transmissionselektronenmikroskopie
HINWEIS: Bou Khalil et al. haben dieses Protokoll zuvor veröffentlicht27.
- 5 l des Lyseüberstandes auf das glühende Gitter ablagern. Ca. 20 min bei Raumtemperatur lassen.
HINWEIS: Die Glüh-Entladung ermöglicht es uns, ein hydrophiles Gitter durch Plasmaanwendung zu erhalten. - Trocknen Sie das Gitter sorgfältig und legen Sie einen kleinen Tropfen von 1% Ammonium Molybdat auf sie für 10 s. Lassen Sie das Gitter für 5 min trocknen.
- Fahren Sie mit Elektronenmikroskopie-Beobachtungen bei 200 keV fort.
8. Charakterisierung des Clandestinovirus ST1 und des Usurpativirus LCD7
- Charakterisieren Sie reine Populationen von Clandestinovirus ST1 und Usurpativirus LCD7 mit Genomsequenzierung, Genommontage, Bioinformatik-Analysen und Untersuchung ihres reproduktiven Zyklus, wie wir es für andere Viren getan haben10,20, 29.
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Representative Results
Die Einzelzell-Mikro-Aspiration ist ein in diesem Manuskript optimierter Mikromanipulationsprozess (Abbildung 1). Diese Technik ermöglicht die Erfassung einer abgerundeten, infizierten Amöbe (Abbildung 2A) und deren Freisetzung in einer neuartigen Platte, die nicht infizierte Amöben enthält (Abbildung 2). Es ist ein funktionaler Prototyp, der für das Co-Kultur-System gilt und erfolgreich nicht-lytische Riesenviren isoliert hat. Dieser Ansatz wurde zum ersten Mal im Bereich der Riesenviren eingesetzt und ermöglichte es, zwei neue Riesenviren mit geringer Häufigkeit zu isolieren. Wir nannten die neuen Viren Clandestinovirus ST1 und Usurpativirus LCD7, die im Vergleich zu den hohen Mengen Faustoviren in geringer Fülle waren. Um die virale Präsenz in jeder Platte nach dem Mikro-Aspirationsverfahren zu analysieren, haben wir PCR auf die 15 Mikro-Aspirationen angewendet. Wir beobachteten reines Usurpativirus (Vorhandensein von Usurpativirus LCD7 [+] und Fehlen des Faustovirus [–]) nur in Klon 7 (Abbildung 3). Die Reinheit des Klons wurde durch PCR mit spezifischen Protokollen bestätigt, die auf das Clandestinovirus ST1 und das Usurpativirus LCD7 (Tabelle 2 )abzielen. Die Elektronenmikroskopie zeigte das Auftreten des Clandestinovirus ST1 und des Usurpativirus LCD7 (Abbildung 4), die eine typische ikosaedrale Morphologie ohne Fibrillen und ein ikosahedrales Kapsid von etwa 250 nm aufweisen. Nach der Bestätigung der Produktionsreinheit wurde das Klonvirus für die gesamte Genomsequenzierung und weitere Charakterisierung, insbesondere die Transmissionselektronikmikroskopie (TEM) für Multiplikationszyklusstudien, produziert und gereinigt. Wir bestätigten die Überlappung von Populationen (Faustovirus/Neuartiges Virus) durch Durchflusszytometrie (Abbildung 5).
Abbildung 1:Materialien für die Mikromanipulation. (A) Tatsächliche Einrichtung der Arbeitsstation. (B) Schematische Darstellung der Komponenten der Arbeitsstation. (C) Schematische Darstellung der Mikrokapillare. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2:Mikro-Aspirationsschritte. (A) Einzelzellen-Isolationsverfahren (Zoom x40). (B) Schematische Darstellung der verschiedenen Schritte der Einzelzellaspiration: 1) Lokalisierung der Zelle. 2) Aspiration der Zelle. 3) Freigabeschritt. Die schwarzen Pfeile zeigen die Mikrokapillare und die weißen die Einzelzelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3:PCR-Screening und -Bestätigung. Screening PCR von Mikro-Aspirationen für Usurpativirus LCD7 und Faustovirus durchgeführt. Vorhandensein von Usurpativirus LCD7 DNA (+) und Abwesenheit von Faustovirus-DNA (–) für Klon 7 nach Mikro-Aspirationsverfahren beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4:Negative Färbemikroskopie. Negative Färbung der viralen Suspension, zeigt reines Clandestinovirus ST1 (A) und Usurpativirus LCD7 (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5:Repräsentative Torplots. (A) Überlagerung jeder einzelnen Viruspopulation, die zuvor mit fluoreszierenden molekularen Sonden für die Kennzeichnung von Viren-DNA gefärbt war (nach zuvor beschriebenem Protokoll26,30). Der linke Teil des Bildes zeigt die Überlagerung von fünf Stämmen des Faustovirus (dunkelgrün, hellgrün, orange, rot und blau). Auf der rechten Seite ist die Überlagerung des Faustovirus ST1 und des Clandestinovirus ST1 (hellviolett und dunkelviolett) sichtbar. (B) Das Vorhandensein von zwei Viruspopulationen von Faustovirus und Usurpativirus im selben Gate wie das Faustovirus (links). Ein Punktdiagramm des reinen Usurpativirus zeigt das gleiche Tor, das zuvor für das Faustovirus (rechts) definiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| PYG-Zusammensetzung | Mengen |
| Proteose-Pepton | 20 g |
| Hefe-Extrakt | 20 g |
| MgSO4bei 7H2O | 0,980 g |
| CaCl2 | 0,059 g |
| Citrat-Natrium. Dihydrat | 1 g |
| Fe (NH4) 2(SO4) 2 x 6H2O | 0,02 g |
| glukose | 18 g |
| Destilliertes Wasser | 1 L |
| PH bei 6,8 mit HCl oder KOH einstellen | |
| Autoklav 15 min bei 121 °C | |
| Hungermedium | Quantiten |
| Hefe-Extrakt | 2 g |
| glukose | 18 g |
| Fe (NH4) 2(SO4) 2 x 6H2O | 0,02 g |
| PAS (details unten) | 1 L |
| PAS-Lösung A | Quantiten |
| KH2PO4 | 0,136 g |
| Na2HPO4 | 0,142 g |
| PAS-Lösung B | Quantiten |
| MgSO4bei 7H2O | 4,0 mg |
| CaCl2bei 2H2O | 4,0 mg |
| Nacl | 0,120 g |
| Jeweils 10 ml der Lösung A und B werden in 1 L destilliertes Wasser zugegeben. |
Tabelle 1: Zusammensetzung der Kulturmedien.
| Virusziel | Zielgen | Foward Primer (5->3) | Umgekehrte Grundierung (5->3) |
| Faustovirus RpB2 | RpB2 | CWCAATCHGCYGATACHGGTGA | TGATTWGCYAATGGNGCYGC |
| Usurpatvirus LCD7 Major Capsid Gen | Major Capsid Gen | GGGCAAGAAGCTCCAAGCTA | GGGTTGAGGAGTCAACG |
| Clandestinovirus ST1 Minor Capsid Gen | Kleines Capsid-Gen | AAAAATGAACGCGTTGGAGGC | ACCGGCGAATGTTCCTATGG |
Tabelle 2: Primmer-Sequenzen für die PCR.
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Discussion
Die Dauer der einzelzelligen Mikroaspirationsbehandlung und ihre gute Funktion ist bedienerabhängig. Die verschiedenen Schritte des Experiments erfordern Präzision. Die Verwendung der Mikromanipulationskomponenten des Arbeitsplatzes muss durch die Beobachtung des Prozesses der Mikroaspiration und der Freisetzung der Zelle ständig kontrolliert werden. Die Nachbeobachtung durch mikroskopische Beobachtung ist für die Erfassung und Übertragung einer Zelle notwendig. Ein erfahrener Bediener kann 1 bis 2 h nehmen, um 10 Zellen zu isolieren und sie nacheinander zu übertragen, abhängig von der Fülle der zu isolierenden Viren. Die Anzahl der Manipulationen kann variieren. Wir empfehlen, mit 10 Manipulationen zu beginnen. Definitionsgemäß kennen wir die intrinsischen Eigenschaften des unbekannten Virus nicht. Daher sind die Verwendung und Entwicklung verschiedener Isolationsstrategien notwendig, um den Erfolg der Trennung dieser Viren zu optimieren.
Der Mikro-Aspirationsprozess wird unter unsterilen Bedingungen (auf einer Bank außerhalb der mikrobiologischen Sicherheitsstation) durchgeführt und schränkt so seine Verwendung ein und verhindert deren Anwendung zur Untersuchung menschlicher Krankheitserreger. Daher ist die Verwendung einer Mischung aus Antibiotika und Antifungalen zur Begrenzung von Schadstoffen obligatorisch. Eine weitere Einschränkung des Verfahrens besteht darin, dass es nur an Mikroorganismen durchgeführt werden kann, die durch Lichtmikroskopie beobachtbar sind, auf denen die Mikromanipulationskomponenten montiert wurden, wodurch konzeptionell jede Arbeit an Mikroorganismen, die nicht durch Licht beobachtbar sind, eliminiert wird. Mikroskopie. Wir konnten jedoch riesige Viren von etwa 200 nm trennen, die unter dem Lichtmikroskop unsichtbar bleiben, indem wir eine indirekte Strategie verfolgten, die darin bestand, die infizierten Wirte zu trennen und zu klonen.
Die Entwicklung von einzelligem Mikro-Aspiration für die Amöbenerfassung ist ein Teil der Entwicklung von Populationssortiermethoden. Die Einzelzell-Mikro-Aspiration ermöglichte es uns, zwei neue Riesenviren zu isolieren, das Clandestinovirus ST1 und das Usurpativirus LCD7, mit Merkmalen, die sich von Faustoviren unterscheiden. Die sehr ähnlichen morphologischen Eigenschaften sowohl des Clandestinovirus ST1 als auch des Usurpativirus LCD7 gegenüber dem Faustovirus LCD7 und ihre unterschiedliche Replikation zeigen die Grenze von FACS, die normalerweise bei der Sortierung von Riesenviren verwendet wird. Es wird durch die Überlagerung von zwei virusligen Populationen, Clandestinovirus ST1 und Faustovirus ST1 (Abbildung 5A) und auch durch den Nachweis für Usupartivirus LCD7 und Faustovirus LCD7 dargestellt. Mit dieser neuen Methode wird die gesamte Manipulation jedoch durch sorgfältige Überwachung der Zelle und ihrer Integrität auch nach ihrer Freisetzung unter visueller Kontrolle gestellt. Die Verwendung von Durchflusszytometrie zur direkten Sortierung infizierter Amöben könnte eine alternative Lösung sein, um indirekt neuartige Viren zu sortieren. Auf diese Methode folgt in der Regel das Screening der Platte, um zytopathische Effekte oder Lyse zu erkennen. Das Vorhandensein von nicht-lytischen Viren in der Mischung könnte eine Grenze für die Amöbensortierung darstellen. Dies wurde jedoch bei der Erstellung dieses Protokolls und für diese beiden neuartigen Isolationen nicht untersucht.
Über die Anwendung der Mikromanipulation bei der Positionierung und Haltung von Zellen im Allgemeinen und Eizellen für die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)33hat sich die einzellige Mikroaspiration als praktische Methode zur Isolierung einzelner prokaryotische Zellen, die unter einem optischen Mikroskop beobachtbar sind31. Andere Anwendungen könnten getestet werden, einschließlich der Zellsortierung auf morphologischer Basis, um verschiedene reine Proben aus einer gemischten Probe von Mikroorganismen zu haben. Die beobachtbare Trennung von Mikroorganismen kann mit der oben beschriebenen Strategie ins Blickfeld der Technik eingeplant werden.
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Disclosures
Alle Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken sowohl Jean-Pierre Baudoin als auch Olivier Mbarek für ihren Rat und Claire Andréani für ihre Hilfe bei englischen Korrekturen und Modifikationen. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des französischen Staates unterstützt, das von der Nationalen Forschungsagentur im Rahmen des Programms "Investissements d'avenir (Investitionen für die Zukunft)" mit der Referenz ANR-10-IAHU-03 (Méditerranée Infection) und von Région Provence Alpes verwaltet wurde. Céte d'Azur und europäische Finanzierung FEDER PRIMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 with Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2 | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
References
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