Summary
在这里，我们描述了一个单细胞微吸入方法分离受感染的阿米巴。为了分离受福斯托病毒和未知巨病毒感染的Vermamoeba病毒的病毒亚群，我们开发了下面详述的规程，并展示了其分离两种低丰度的新型巨病毒的能力。
Abstract
在阿米巴共同培养过程中，多个病毒可能在一个井中分离。我们之前通过应用于病毒群的端点稀释和/或荧光活化细胞分拣 （FACS） 解决了这个问题。然而，当混合物中的病毒具有相似的形态特性，并且其中一种病毒繁殖缓慢时，在基因组组装阶段发现两种病毒的存在，并且病毒无法分离以进一步表征。为了解决这个问题，我们开发了一个单细胞微吸气程序，允许分离和克隆高度相似的病毒。在目前的工作中，我们介绍这种替代策略如何允许我们分离克兰迪索病毒ST1和Usurpati病毒LCD7的小病毒亚群，与溶酶和快速生长相比，这些巨型病毒生长缓慢，不会导致阿米巴溶血症浮病毒通过特定基因扩增来评估纯度控制，并产生病毒以进一步表征。
Introduction
核细胞质大DNA病毒（NCLDV）是极其多样化的，由四个家族，感染真核生物1定义。第一个描述的病毒基因组超过300kbp是植物dnavire，包括紫杉醇小球状病毒1 PBCV12。咪咪病毒的分离和首次描述表明，病毒的大小在颗粒大小（450nm）和基因组长度（1.2Mb）3方面都增加了一倍。自那时以来，许多巨大的病毒被描述，通常使用阿米巴共培养程序分离。几个具有不同形态和遗传内容的巨型病毒可以从阿坎塔莫巴病毒细胞中分离出来，包括马赛病毒、潘多拉病毒、皮托病毒、莫利病毒、塞德拉病毒、帕克曼病毒、图潘病毒，以及最近美杜莎病毒4，5，6，7，8，9，10，11，1213，14，15，16，17。同时，对Vermamoeba病毒的分离使得对巨病毒福斯托病毒、考莫埃巴病毒和奥菲奥病毒18、19、20的分离和描述得以进行。其他巨型病毒被分离为他们的宿主原虫，如卡福龙根西21，奥雷球菌阿诺费伦斯22，克雷索穆利纳23和博多盐 24.所有这些隔离都是由于越来越多的团队致力于隔离，并引入了高吞吐量策略更新 25、26、27、28，例如利用流式细胞测定，改进共培养系统。
2016年，我们采用一种将共培养和流细胞学相结合的策略来分离巨型病毒27。制定这一策略是为了增加接种的样本数量，使用作细胞支持的培养者多样化，并快速检测细胞支持的莱沙。该系统通过添加补充步骤来更新，以避免初步的分子生物学鉴定和快速检测未知的病毒群，如Pacman病毒29。耦合流细胞测定细胞分类允许分离咪咪病毒和塞德拉病毒A1130的混合物。然而，我们后来遇到了通过流式细胞测定分离和检测这些病毒亚群的局限性。测序后，当我们组装Fausto病毒ST125和Fausto病毒LCD7（未公布的数据）的基因组时，我们惊奇地发现，每个集合中有两个补充基因组，两个新病毒的基因组在公共基因组数据库中未识别。然而，无论是流动细胞学还是传输电子显微镜（TEM）都显示阿米巴感染了两种不同的病毒，即克兰迪索病毒ST1和佩兰皮塔蒂病毒LCD7。我们设计了特定的PCR系统，分别根据其基因组扩增浮法托病毒、汉迪斯坦病毒和克兰迪索病毒标记;我们的目的是建立基于PCR的系统，能够验证被分离的病毒的纯度。然而，端点稀释和流式细胞测量未能将它们分开。分离这一单一病毒种群是困难的，因为无论是克兰斯蒂诺病毒和汉里帕蒂病毒种群的形态或复制元素都没有特征。由于两个种群的重叠（在有效分离后测试），我们只通过流式细胞测定检测出一个病毒群。我们试图用96孔板的单粒子分拣来分离它们，但我们没有观察到任何细胞病的影响，我们也没有通过PCR扩增来检测克兰斯蒂诺病毒和汉皮拉蒂病毒。最后，只有端点稀释和单阿米巴微吸气的组合，才使得这两种低丰度的巨型病毒从浮力病毒中分离出来。这种分离方法是本文的对象。
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Protocol
1. 阿米巴文化
- 使用Vermamoeba 纤维化（应变 CDC19）作为细胞支持。
- 在75cm2细胞培养瓶中，在浓度为1 x 106细胞/mL的阿米巴中加入30 mL蛋白酶-肽-酵母提取物-葡萄糖培养基（PYG）和3mL的阿米巴。
- 将培养保持在28°C。
- 48小时后，使用计数幻灯片对阿米巴进行量化。
- 要冲洗，以1 x106细胞/mL的浓度收获细胞，在720 x g下离心10分钟，将阿米巴颗粒化10分钟。 去除上清液，在适当的饥饿培养液中重新悬浮颗粒，以获得1 x 106细胞/mL （表 1）。
2. 库存病毒在阿米巴的传播
注：在稀释之前，重要的是培养库存样品，以获得足够的新鲜培养，然后继续过滤。
- 在饥饿培养基中使用阿米巴培养的1 x 106。
- 接种从库存溶液（浮华病毒/汉皮塔蒂病毒LCD7或福斯托病毒/克兰迪索病毒ST1）发出的病毒混合物后，在细胞支持的共同培养过程在倍数感染（MOI）0.01。
注：MOI对于减少主要病毒种群的丰度和受感染的细胞数量非常重要。 - 在30°C孵育，直到细胞病效（CPE）被诱导，如阿米巴四舍或溶化，大约10至14小时后感染。
- 收集介质并通过 5 μm 过滤器进行过滤，以清除细胞碎屑。
3. 端点稀释
- 在饥饿培养基中对病毒样本进行连续稀释（10-1至10-11）。
- 接种 2 mL 1 x 106 Vermamoeba vermaeba vermeba vermea纤维化包含在每个培养皿中，含有 100 μL 的混合物接种。
- 将培养皿置于 30°C 的可密封塑料袋中。
- 在感染后6小时用倒置光学显微镜观察培养皿，每4至8小时检查细胞形态。
- 在以四舍五入细胞为特征的细胞病变效应的出现时，开始单细胞微吸气过程。
4. 单细胞微吸
-
准备主机。
注：此制剂用于将受感染的单细胞释放到新的细胞支持。- 使用含有10微克/mL的万古霉素、10微克/mL的伊美宁、20微克/mL的环丙沙星、20微克/mL的多氧环素和20微克/mL的沃利孔素，在培养基中治疗阿米巴。这种混合物用于避免细菌和真菌污染。
注：手术在微生物安全站外的长凳上进行。将2 mL的阿米巴浓缩在1 x 106细胞/mL每个到15个培养皿。对于阿米巴依从性，在 30°C 孵育培养 30 分钟。
- 使用含有10微克/mL的万古霉素、10微克/mL的伊美宁、20微克/mL的环丙沙星、20微克/mL的多氧环素和20微克/mL的沃利孔素，在培养基中治疗阿米巴。这种混合物用于避免细菌和真菌污染。
- 根据以下标准，从极限稀释中选择用于微吸气的培养皿：1） 没有任何真菌和细菌制剂的可见污染，2） 证明阿米巴因病毒而具有细胞病菌效应，以及 3） 预溶和阿米巴的四舍五入阶段（以避免病毒颗粒的吸入）。
-
使用以下材料设置工作站（参见图 1A，B）：
微操作器，允许微毛细管定位;
手动控制压力装置，用于吸入并释放细胞到微毛细管;
倒置显微镜;
即插即用电机模块;
相机;
计算机模块，用于可视化操作和拍照。 - 选择微毛细管（参见图1C）。
注：细胞的大小、膜对表面的变形和粘附性以及细胞运动性会影响微吸气的平滑进度。微毛细管直径可以精确选择，并适应特定的细胞类型，这取决于其大小和吸气方法。内径为20微米的微毛细管用于吸出圆环状阿米巴（直径±10μm）。这允许维护内部位置和轻松释放单元。 -
安装系统。
- 将抓取系统的操作角度固定在电动模块上，温度为 45°。
- 执行双重安装，首先在夹持系统上，然后在微毛细管上。
- 在微毛细管中流下几滴油后，专注于细胞。
注：具有生物相容性矿物油由设备提供。 - 按照制造商的建议完成安装。
-
克隆细胞（参见图2A，B）。
注：此过程类似于弗吕利希和柯尼格31所述。- 将含有2 mL感染阿米巴的培养皿置于显微镜下。
- 首先关注细胞，然后关注浸入培养的微毛细管。
- 选择一个圆的单个细胞，使微毛细管更接近微操作器。
- 在细胞上进行手动压力控制，将其吸入微毛细管内，实现软吸气。从第一个样本中取出单个细胞，并在细胞支架中释放，然后在 30°C 孵育。
- 用倒置光学显微镜进行日常观察，观察细胞的外观，并监测细胞病变效应的出现。
5. PCR筛查
注：在步骤 4 之后，PCR 的系统筛选对于确认分离至关重要。在Usurpati病毒/浮法托病毒和克兰斯蒂诺病毒/浮法托病毒中，使用引体-BLAST在线32（表2）完成了特定引录和探测系统的设计和应用。
- 根据制造商的协议，使用自动提取系统从部分阳性培养样本中提取DNA（即观察到细胞病变效应的地方）。
- 使用设计适当的引体。
注：在这里，我们设计了引源来放大核心基因，这些基因被作为RpB2（浮病毒）、LCD7主要辣椒蛋白（Usurpat病毒）和微小辣椒蛋白（克兰迪索病毒）来扩充 -
使用热循环器执行标准 PCR。
- 使用每个引水50μM（表2）、1x主混合物和无RNase水进行20μLPCR反应。
- 在95°C下激活Taq DNA聚合酶5分钟，随后在95°C下进行45次10秒变性，在58°C下退火30秒，在72°C下延长30秒。
- 在1.5%的胶凝糖凝胶上运行PCR产品，用DNA凝胶染色（材料表）染色，并用紫外线可视化。
6. 病毒生产和纯化
- 把剩下的培养皿放回小瓶中。
- 对于病毒的生产，准备15个145厘米2的烧瓶，含有40mL的Vermamoeba在饥饿介质和5 mL的分离病毒已经从培养皿转移到小烧瓶。
- 使用步骤 4.1 中使用的相同抗生素和抗真菌混合物进行治疗。
- 在30°C孵育。每天用倒置光学显微镜观察。
- 完全感染后，将所有烧瓶池。使用 0.45 μm 过滤器消除碎屑。
- 在 50，000 x g下超离所有超生物 45 分钟。
- 离心后，通过吸入从每个管中取出上清液，并将颗粒重新悬浮在1 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
- 用25%蔗糖（27.5克蔗糖在100 mL的PBS中，通过过滤消毒）来纯化病毒。
- 离心8 mL的蔗糖和2 mL的病毒悬浮液在80，000 x g下30分钟。将其储存在-80°C。
7. 负染色和透射电子显微镜
注：布哈利勒等人此前27日公布了这一议定书。
- 将莱沙上清液的5 μL沉积到发光释放的网格上。在室温下离开约20分钟。
注：发光放电使我们能够通过等离子体应用获得亲水网格。 - 小心干燥电网，在网格上沉积1%的少量铵，等待10秒，让电网干燥5分钟。
- 继续以200 keV进行电子显微镜观察。
8. 克兰斯蒂诺病毒ST1和汉地帕蒂病毒LCD7的特性
- 使用基因组测序、基因组组装、生物信息学分析以及研究其复制周期来描述克兰斯提诺病毒ST1和Usurpati病毒LCD7的纯种群，正如我们对其他病毒所做的10、20 29.
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Representative Results
单细胞微吸气是本手稿中优化的微操作过程（图1）。这种技术能够捕获一个圆的，受感染的阿米巴（图2A），并在含有未感染阿米巴（图2）的新型板中释放它。它是一个适用于共培养系统的功能原型，并成功地分离了非溶性巨病毒。这种方法首次在巨病毒领域被应用，并使得分离出两种新的低丰度巨病毒成为可能。我们命名了新的病毒克兰斯蒂诺病毒ST1和Usurpati病毒LCD7，与高丰度浮法病毒相比，其丰度较低。为了分析微吸气程序后每个板的病毒存在，我们在15个微吸入器上应用了PCR。我们仅在克隆7（图3）中观察到纯海伯里塔蒂病毒（存在Usurpati病毒LCD7[]和不存在福托病毒[]）。PCR用针对克兰斯蒂诺病毒ST1和Usurpati病毒LCD7的特定协议确认了克隆的纯度（表2）。电子显微镜揭示了克兰迪斯科病毒ST1和汉皮拉蒂病毒LCD7的外观（图4），它们具有典型的无纤维和约250nm的异体体形态。在确认生产纯度后，克隆病毒被生成并纯化，用于全基因组测序和进一步表征，特别是用于乘法循环研究的传输电子显微镜（TEM）。我们用流动细胞测定法证实了人群（浮病毒/新病毒）的重叠（图5）。
图1：用于微操作的材料。（A） 工作站的实际设置.（B） 工作站组件的原理图。（C） 微毛细管的原理图。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：微吸气步。（A） 单细胞隔离过程 （缩放 x40）。（B） 单细胞吸入的不同步骤的原理图：1） 细胞的定位。2） 细胞的渴望。3） 释放步骤。黑色箭头显示微毛细管，白色箭头显示单个细胞。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：PCR筛选和确认。对帕雷帕蒂病毒LCD7和福多病毒进行微吸量PCR筛查。在微吸入程序后为克隆7观察到的有Usurpati病毒LCD7DNA（+）和不存在福托病毒DNA（*）。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：负染色显微图。病毒悬浮液的阴性染色，显示纯克兰斯泰诺病毒ST1 （A） 和汉地拉蒂病毒 LCD7 （B）.请点击此处查看此图的较大版本。
图5：代表性门图。（A） 对以前沾有荧光分子探针的每种病毒群进行增增，以进行病毒DNA标签（按照先前描述的议定书26，30）。图片的左侧显示了五个浮病毒株的叠加（深绿色、浅绿色、橙色、红色和蓝色）。在右侧，可见浮法病毒ST1和克兰斯蒂诺病毒ST1（浅紫色和深紫色）的叠加。（B） 与福斯托病毒（左）在同一门中存在两种病毒群的福斯托病毒和汉帕蒂病毒。 纯Usurpati病毒的点图显示了以前为福托病毒定义的相同门（右图）。请点击此处查看此图的较大版本。
| PYG 组合 | 数量 |
| 蛋白酶肽 | 20克 |
| 酵母提取物 | 20克 |
| MgSO4+7H2O | 0.980克 |
| CaCl2 | 0.059克 |
| 柠酸钠。迪水合物 | 1 克 |
| Fe （NH4） 2 （SO4） 2 x 6H2O | 0.02克 |
| 葡萄糖 | 18 克 |
| 蒸馏水 | 1 升 |
| 使用 HCl 或 KOH 将 pH 调整为 6.8 | |
| 高压灭菌器 15 分钟，121 °C | |
| 饥饿介质 | 昆蒂特 |
| 酵母提取物 | 2 克 |
| 葡萄糖 | 18 克 |
| Fe （NH4） 2 （SO4） 2 x 6H2O | 0.02克 |
| 考绩制度（详情见下文） | 1 升 |
| PAS 解决方案 A | 昆蒂特 |
| KH2PO4 | 0.136克 |
| 纳2HPO4 | 0.142克 |
| PAS 解决方案 B | 昆蒂特 |
| MgSO4+7H2O | 4.0毫克 |
| CaCl2#2H2O | 4.0毫克 |
| Nacl | 0.120克 |
| 将溶液A和B各10mL加入1升蒸馏水中。 |
表1：文化媒体的构成。
| 病毒目标 | 靶基因 | 引引 （5->3） | 反向底漆 （5>3） |
| 浮病毒RpB2 | RpB2 | 中国 | T加特格奇亚格格格格格格格格格格格格格格格格格格 |
| 汉皮纳特病毒 LCD7 主要辣椒基因 | 主要辣椒基因 | GGGCAAGCTCCAAGCTA | GGGTTGAGGAGTCAACG |
| 克兰迪索病毒ST1小辣椒基因 | 次要辣椒基因 | AAAATAACGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG | ACCGGGATTCTATGG |
表 2：用于 PCR 的灵位序列。
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Discussion
单细胞微吸气处理的持续时间及其良好功能取决于操作员。实验的不同步骤要求精度。工作站的微操作组件的使用必须通过观察微吸气过程和细胞释放来持续控制。通过微观观察进行随访对于捕获和转移细胞是必要的。有经验的操作员可能需要 1 到 2 小时来分离 10 个细胞，并根据要分离的病毒的丰度逐一重新传输它们。操作的数量可能有所不同。我们建议从 10 个操作开始。根据定义，我们不知道未知病毒的内在特征。因此，有必要使用和开发不同的分离策略，以优化分离这些病毒的成功。
微吸气过程在非无菌条件下（在微生物安全站外的长凳上）进行，从而限制了其使用，并阻止其用于研究人类病原体。因此，使用抗生素和抗真菌的混合物来限制污染物是强制性的。该方法的另一个局限性是，它只能对可安装在微操作元件上的光学显微镜观测到的微生物进行，因此，从概念上讲，消除了对光无法观察到的微生物的任何工作。显微镜。然而，我们通过使用一种间接策略，包括分离和克隆受感染的宿主，分离了大约200纳米的巨型病毒，这些病毒在光显微镜下仍然不可见。
开发单细胞微吸入阿米巴捕获是种群分拣方法发展的一部分。单细胞微吸气使我们能够分离出两种新的巨型病毒，即克兰斯蒂诺病毒ST1和Usurpati病毒LCD7，其特征与浮病毒不同。克兰斯蒂诺病毒ST1和汉地拉蒂病毒LCD7与福斯托病毒LCD7的形态特性高度相似，其复制差异显示了FACS的极限，通常用于巨型病毒分类。它表现为两个病毒群的叠加，即克兰斯蒂诺病毒ST1和法斯托病毒ST1（图5A），以及乌苏帕蒂病毒LCD7和Fausto病毒LCD7的检测。但是，使用这种新方法，整个操作在视觉控制之下，即使在释放后，也会仔细监视单元格及其完整性。使用流式细胞仪直接对受感染的阿米巴进行分类可能是间接对新型病毒进行分类的另一种解决方案。这种方法通常遵循筛选板，以检测细胞病变效应或莱沙。混合物中存在非溶酶病毒可能代表阿米巴分类的限制。然而，在创建该协议和这两种新颖的隔离中，没有探讨这个问题。
除了在一般细胞和卵母细胞的定位和保持中的应用，对于细胞内质精子注射（ICSI）33，单细胞微吸量已被证明是分离单细胞的实用方法。在光学显微镜31下可观察到的原核细胞。可以测试其他应用，包括以形态为基础进行细胞分类，以便从混合微生物样本中分离出不同的纯样品。使用上述策略可以设想微生物的可观察到分离。
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Disclosures
所有作者都没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢让-皮埃尔·包多因和奥利维尔·姆巴雷克的建议，并感谢克莱尔·安德烈尼在英语更正和修改方面的帮助。这项工作得到了法国国家研究局根据"投资未来"方案管理，参考ANR-10-IAHU-03（墨西哥感染）和普罗旺斯阿尔卑斯共和国提供的赠款支持。阿祖尔和欧洲基金FEDER PRIMI。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 with Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2 | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
References
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