Summary
Burada, enfekte amiplerin ayrılması için tek bir hücreli mikro-aspirasyon yöntemini tanımlıyoruz. Faustovirüsler ve bilinmeyen dev virüsler tarafından enfekte Vermamoeba vermiformis viral alt popülasyonları ayırmak için, aşağıda ayrıntılı protokolü geliştirdi ve iki düşük bolluk yeni dev virüs ayırma yeteneğini gösterdi.
Abstract
Amip ortak kültür süreci sırasında, birden fazla virüs tek bir kuyuda izole edilebilir. Daha önce bu sorunu, viral popülasyona uygulanan son nokta seyreltme ve/veya floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile çözmüştük. Ancak, karışımdaki virüsler benzer morfolojik özelliklere sahip olduğunda ve virüslerden biri yavaş yavaş çoğaldığında, genom montaj aşamasında iki virüsün varlığı keşfedilir ve virüsler daha fazla karakterizasyon için ayrılamaz. Bu sorunu çözmek için, son derece benzer virüslerin ayrılması ve klonlanmasına olanak tanıyan tek bir hücreli mikro aspirasyon prosedürü geliştirdik. Bu çalışmada, bu alternatif strateji bize Clandestinovirus ST1 ve Usurpativirus LCD7, yavaş büyüyen ve amipli ve hızlı büyüyen göre amip lisis yol açmaz dev virüslerin küçük viral alt popülasyonları ayırmak için izin nasıl sayılmızı sıyoruz Faustovirüs. Saflık kontrolü spesifik gen amplifikasyonu ile değerlendirildi ve daha fazla karakterizasyon için virüsler üretildi.
Introduction
Nükleozositoplazmik büyük DNA virüsleri (NCLDV) ökaryotlara bulaşandört aile tarafından tanımlanan son derece çeşitlidir. 300 kbp üzerinde genomları ile ilk açıklanan virüsler Phydcodnaviridaeedildi , Paramecium bursaria Chlorella virüsü dahil 1 PBCV12. İzolasyon ve Mimivirüs ilk açıklaması, virüslerin boyutu parçacık (450 nm) ve genom uzunluğu (1.2 Mb)3hem boyutu açısından iki katına gösterdi . O zamandan beri, birçok dev virüs, genellikle bir amip co-kültür prosedürü kullanılarak izole tarif edilmiştir. Farklı morfolojileri ve genetik içeriği ile birçok dev virüs Marsilyavirüsler, Pandoravirüsler, Pithoviruses, Mollivirus, Cedratviruses, Pacmanvirus, Tupanvirus ve son zamanlarda dahil olmak üzere Acanthamoeba sp. hücreleri, izole edilebilir Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Buna paralel olarak, Vermamoeba vermiformis izolasyon izolasyon ve dev virüsler Faustovirus, Kaumoebavirus ve Orpheovirus18, 19,20açıklamasına izin verdi. Diğer dev virüsler kafeterya roenbergensis21gibi ev sahibi protistler ile izole edildi, Aureococcus anoofagefferens22, Chrysochromulina ericina23, ve Bodo saltans 24. yıl. Tüm bu izolasyonlar izolasyon ve yüksek iş-iş stratejisi güncellemeleri25,26,27,28,gibi giriş üzerinde çalışan ekiplerin artan sayıda sonucu akış sitometrisi kullanımı ile ortak kültür sisteminin iyileştirilmesi.
2016 yılında, dev virüsleri izole etmek için ortak kültür ve akış sitometrisini ilişkilendiren bir strateji kullandık27. Bu strateji aşılanan numune sayısını artırmak, hücre desteği olarak kullanılan protistleri çeşitlendirmek ve hücre desteğinin düzgünliğini hızlı bir şekilde tespit etmek için geliştirilmiştir. Sistem pacmanvirus29durumunda olduğu gibi ön moleküler biyoloji kimlik ve bilinmeyen bir viral popülasyonun hızlı tespiti önlemek için ek bir adım ekleyerek güncellendi . Mimivirüs ve Cedratvirus A1130karışımının ayrılmasıiçin izin verilen hücre ayrıştırma için kaplin akış sitometri . Ancak daha sonra bu viral alt popülasyonların akış sitometrisi ile ayrılması ve saptanması ile ilgili sınırlamalarla karşılaştık. Sıralamadan sonra, Faustovirus ST125 ve Faustovirus LCD7 (yayınlanmamış veriler) genomlarını bir araya getirdiğimizde, şaşırtıcı bir şekilde her derlemede, kamu genom veritabanlarında tanımlanmamış iki yeni virüsün iki ek genomunu bulduk. Ancak, ne akış sitometrisi ne de iletim elektronik mikroskopi (TEM) amiplerin iki farklı virüs, Clandestinovirus ST1 ve Usurpativirus LCD7 ile enfekte olduğunu gösterdi. Faustovirüs, Usurpativirus ve Clandestinovirus belirteçlerini sırasıyla genomlarına göre güçlendirmek için özel PCR sistemleri tasarladık; amacımız, ayrılan virüslerin saflıklarının doğrulanmasını sağlayan PCR tabanlı sistemlere sahip olmaktı. Ancak, son nokta seyreltme ve akış sitometri onları ayırmak için başarısız oldu. Clandestinovirus ve Usurpativirus popülasyonlarının ne morfolojisi ne de çoğaltıcı elementleri karakterize edilmediği için bu tek viral popülasyonun izole edilmesi zordu. İki popülasyonun üst üste binme (etkili ayrışma sonrasında test edildiği) nedeniyle akış sitometrisi ile sadece bir viral popülasyon tespit ettik. 96 kuyulu plakalarda tek partikül ayrıştırma kullanarak ayırmaya çalıştık, ancak herhangi bir sitopatik etki gözlemlemedik ve PCR amplifikasyon uğramı ile ne Clandestinovirus ne de Usurpativirus tespit ettik. Son olarak, faustovirüsler bu iki düşük bolluk dev virüslerin ayrılmasını etkin tek amip mikro-aspirasyon izledi sadece uç nokta seyreltme kombinasyonu oldu. Bu ayırma yöntemi bu makalenin nesnesidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Amip Kültürü
- Bir hücre desteği olarak Vermamoeba vermiformis (zorlanma CDC19) kullanın.
- 75 cm2 hücre kültürü şişesinde 1 x 106 hücre/mL konsantrasyonunda 30 mL proteease-pepton-maya ekstresi-glikoz ortamı (PYG)ve 3 mL amip ekleyin.
- 28 °C'de kültürünü koruyun.
- 48 saat sonra, sayma slaytları kullanarak amip miktarını ölçün.
- Durulama için, 1 x 106 hücre/mL konsantrasyonda hücreleri hasat ve 10 dakika için 720 x g santrifüj ile amip pelet. Supernatant çıkarın ve 1 x 10 6 elde etmek için açlık orta uygun hacimde pelet resuspend hücreler/mL (Tablo 1).
2. Amip stok virüs yayılması
NOT: Seyreltme den önce, yeterli taze kültür elde etmek için stok örnek kültür önemlidir, sonra filtrasyon devam.
- Açlık ortamda 1 x 106 amip kültürünü kullanın.
- 0.01 enfeksiyon (MOI) çokluğu hücre desteği ortak kültür sürecinden sonra stok çözeltisi (Faustovirus / Usurpativirus LCD7 veya Faustovirus / Clandestinovirus ST1) çıkarılan virüslerin karışımı aşılamak.
NOT: MOI büyük viral nüfusun bolluğunu ve enfekte hücrelerin sayısını azaltmak için önemlidir. - 30 °C'de sitopatik etkiler (CPE) indüklenene kadar, amip yuvarlama veya lysis gibi, enfeksiyondan yaklaşık 10 ila 14 saat sonra inküler.
- Hücresel enkazı temizlemek için ortamı toplayın ve 5 μm'lik bir filtreden dosyalayın.
3. Son nokta seyreltme
- Açlık ortasındaki viral numunenin seri seyreltmesini (10-1 ila 10-11)gerçekleştirin (Tablo 1).
- Her Petrus kabında bulunan 1 x 106 Vermamoeba vermiformis'in 2 mL'sini aşılayın ve karışım inokülünün 100 μL'si bulunur.
- Petri tabaklarını 30 °C'de mühürlenebilir bir plastik torbaya yerleştirin.
- Petri kaplarını 6 saat postenfeksiyonda ters optik mikroskopi ile gözlemlemeye başlayın ve her 4 ila 8 saatte bir hücre morfolojisini kontrol edin.
- Yuvarlama hücreleri ile karakterize sitopatik etki görünümünde, tek hücreli mikro-aspirasyon süreci başlar.
4. Tek Hücreli Mikro-aspirasyon
-
Ev sahibini hazırlayın.
NOT: Bu hazırlık yeni bir hücre desteği için enfekte tek hücrelerin serbest bırakılması için yapılır.- Kültürdeki amipleri 10 μg/mL vankomisin, 10 g/mL imipenem, 20 g/mL soksiloksin, 20 g/mL doksisiklin ve 20 μg/mL voriconazol içeren bir antimikrobiyal ajanla tedavi edin. Bu karışım bakteriyel ve mantar kontaminasyonunu önlemek için kullanılır.
NOT: Prosedür mikrobiyolojik güvenlik istasyonu dışında bir bankta gerçekleşir. 15 Petri yemeğine 1 x 106 hücre/mL konsantre 2 mL amip ekleyin. Amip yapışması için, 30 °C'de 30 dakika boyunca kültürü kuluçkaya yatırın.
- Kültürdeki amipleri 10 μg/mL vankomisin, 10 g/mL imipenem, 20 g/mL soksiloksin, 20 g/mL doksisiklin ve 20 μg/mL voriconazol içeren bir antimikrobiyal ajanla tedavi edin. Bu karışım bakteriyel ve mantar kontaminasyonunu önlemek için kullanılır.
- Aşağıdaki kriterlere göre limit seyreltme mikro-aspirasyon için kullanılan Petri çanak seçin: 1) mantar ve bakteriyel ajanlar tarafından görünür kontaminasyon yokluğu, 2) virüsler nedeniyle amip sitopatik etkisi kanıt, ve 3) preliz ve amip yuvarlama fazı (viral parçacıkların aspirasyon önlemek için).
-
Aşağıdaki malzemelerle bir iş istasyonu ayarlayın (Bkz. Şekil 1A,B):
Mikromanipülatör, mikrokapiller konumlandırma sağlar;
El ile kontrol basınç cihazı, aspire ve mikrocapiller içine hücreleri serbest bırakmak için kullanılır;
Ters mikroskop;
Motor modüllerini takın ve çalıştırın;
Kamera;
Manipülasyon görselleştirmek ve fotoğraf çekmek için bilgisayar modülü. - Bir mikrokapiller seçin (Bkz. Şekil 1C).
NOT: Hücrelerin büyüklüğü, deformasyon ve yüzeylere membranların yapışması, ve hücresel hareketlilik mikro-aspirasyon düzgün ilerlemesini etkileyebilir. Mikrokapiller çap, boyutlarına ve aspirasyon yöntemlerine bağlı olarak belirli hücre tiplerine tam olarak seçilebilir ve adapte edilebilir. Yuvarlama amipini (çapı ~10 μm) aspire etmek için 20 μm iç çapında bir mikrokapiller kullanıldı. Bu, dahili bir pozisyonun bakımını ve hücrenin kolay bir şekilde serbest bırakılmasını sağlar. -
Sistemi monte edin.
- Motorlu modüldeki kavrama sisteminin çalışma açısını 45°'de düzeltin.
- Bir çift kurulum gerçekleştirin, ilk kavrama sistemi üzerinde, ve sonra mikrocapillary üzerinde.
- Mikrokapiller aracılığıyla yağ birkaç damla çalıştırdıktan sonra hücrelere odaklanın.
NOT: Biyolojik uyumluluğa sahip mineral yağ cihaz tarafından sağlanır. - Üreticinin tavsiyelerine göre montajı tamamlayın.
-
Klon hücreleri (bkz. Şekil 2A,B).
NOT: Bu prosedür Fröhlich ve König31tarafından açıklanan benzer .- 2 mL enfekte amip içeren Petri kabını mikroskop altına yerleştirin.
- Önce hücrelere, sonra da kültüre dalmış mikrokapillera odaklanın.
- Yuvarlak tek bir hücre seçin ve mikrokapillermikromanipülatör yakın getirmek.
- Mikrokapiller içinde alarak, hücre üzerinde manuel basınç kontrolü ile yumuşak aspirasyon uygulayın. Tek hücreyi ilk örnekten çıkarın ve hücresel destekte bırakın, sonra 30 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Hücrelerin görünümünü gözlemlemek ve sitopatik etkinin ortaya çıkışını izlemek için ters optik mikroskopla günlük gözlemler gerçekleştirin.
5. PCR Tarama
NOT: 4. adımdan sonra, PCR tarafından sistematik bir tarama ayırma onaylamak için çok önemlidir. Hem Usurpativirus/Faustovirus hem de Clandestinovirus/Faustovirus'da, özel astar ve prob sistemlerinin tasarımı ve uygulaması Primer-BLAST online32 (Tablo 2)kullanılarak yapılmıştır.
- Üreticinin protokolüne göre otomatik bir ekstraksiyon sistemi kullanarak pozitif kültür örneklerinin bir kısmından (örneğin, sitopatik etki gözlendiği) DNA ayıklayın.
- Uygun şekilde tasarlanmış astarlar kullanın.
NOT: Burada rpB2 (Faustovirus), LCD7 majör kapsid proteini (Usurpatvirus) ve minör kapsid proteini (Clandestinovirus) olarak ekaçıklamalı çekirdek genlerini güçlendirmek için astarlar tasarladık. -
Bir termocycler kullanarak standart PCR gerçekleştirin.
- Her astarDan 50 μM(Tablo 2),1x Master Mix ve RNase içermeyen su ile 20 μL PCR reaksiyonu gerçekleştirin.
- 95 °C'de 5 dakika boyunca Taq DNA polimeraz'ı etkinleştirin, ardından 95 °C'de 10 s denatürasyondan oluşan 45 döngü, 58 °C'de 30 s ve 72 °C'de 30 s uzatma uygulayın.
- PCR ürünlerini %1,5 agarose jel üzerinde çalıştırın, DNA jeli lekesi(Malzeme Tablosu)ile lekeyi boyölçün ve UV ile görselleştirin.
6. Virüs Üretimi ve Arınması
- Petri çanak kültürünün geri kalanını küçük bir şişeye koy.
- Virüs üretimi için, 145 cm215 şişe hazırlamak , açlık orta ve izole virüs 5 mL 40 mL Vermamoeba vermiformis içeren zaten Petri çanak küçük şişelere transfer.
- Adım 4.1'de kullanılan aynı antibiyotik ve antifungal karışımile tedavi edin.
- 30 °C'de kuluçkaya yatırın. Ters optik mikroskopi ile her gün gözlemleyin.
- Tam enfeksiyon sonra, havuz tüm şişeleri. Enkazı ortadan kaldırmak için 0,45 m filtre kullanın.
- Ultracentrifuge tüm supernatants 50.000 x g için 45 dakika.
- Santrifüjden sonra, aspirasyon ile her tüpten süpernatant çıkarın ve fosfat tamponlu salin (PBS) 1 mL pelet resuspend.
- %25 sakaroz (100 mL PBS'de 27,5 g sakaroz, filtrasyon ile sterilize) kullanılarak üretilen virüsü arındırın.
- Santrifüj 8 mL sakaroz ve 30 dk için 80.000 x g viral süspansiyon 2 mL. PBS 1 mL viral pelet resuspend. -80 °C'de saklayın.
7. Negatif Boyama ve İletim Elektron Mikroskobu
NOT: Bou Khalil ve ark. daha önce bu protokolü27yayınladı .
- Parlak boşalan ızgaraüzerine 5 μL lysis supernatant yatırın. Oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakika bekletin.
NOT: Kızdırma deşarjı plazma uygulaması ile hidrofilik bir ızgara elde etmemizi sağlar. - Izgarayı dikkatlice kurulayın ve üzerine %1 amonyum molybdate küçük bir damla yatırın 10 s. 5 dakika kurumaya ızgara bırakın.
- 200 keV'de elektron mikroskopi gözlemlerine devam edin.
8. Clandestinovirus ST1 ve Usurpativirus LCD7 karakterizasyonu
- Clandestinovirus ST1 ve Usurpativirus LCD7'nin saf popülasyonlarını genom dizilimi, genom montajı, biyoinformatik analizleri ve diğer virüsler için yaptığımız gibi çoğaltıcı döngülerinin incelenmesi kullanılarak karakterize edin10,20, 29. yıl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tek hücreli mikro-aspirasyon bu el yazmasında optimize edilmiş bir mikromanipülasyon işlemidir (Şekil 1). Bu teknik, yuvarlak, enfekte olmuş bir amipin(Şekil 2A)yakalanmasını ve enfekte olmamış amipiçeren yeni bir plaka içinde serbest bırakılmasını sağlar (Şekil 2). Ortak kültür sistemine uygulanan ve litik olmayan dev virüsleri başarıyla izole eden işlevsel bir prototiptir. Bu yaklaşım dev virüsler alanında ilk kez kullanıldı ve iki yeni düşük bolluk dev virüsizole etmek mümkün kıldı. Biz yeni virüsler Clandestinovirus ST1 ve Usurpativirus LCD7, düşük bolluk yüksek bolluk Faustoviruses göre vardı adlı. Mikro aspirasyon işleminden sonra her bir plakadaki viral varlığı analiz etmek için 15 mikro aspirasyona PCR uyguladık. Biz saf Usurpativirus gözlendi (Usurpativirus LCD7 varlığı [+] ve Faustovirus yokluğu [–]) sadece klon 7(Şekil 3). Klonun saflığı CLandestinovirus ST1 ve Usurpativirus LCD7 'yi hedefleyen özel protokollerle PCR tarafından doğrulandı(Tablo 2). Elektron mikroskopisi, fibriller olmadan tipik bir ikosahedral morfolojisi ve sırasıyla yaklaşık 250 nm ikosahedral kapsid olan Clandestinovirus ST1 ve Usurpativirus LCD7(Şekil 4)görünümünü ortaya çıkardı. Üretim saflığı onaylandıktan sonra, klonal virüs üretildi ve tüm genom dizilimi ve daha fazla karakterizasyon için saflaştırılmış, özellikle iletim elektronik mikroskopi (TEM) çarpma döngüsü çalışmaları için. Biz akım sitometri(Şekil 5)tarafından popülasyonların örtüşen doğruladı (Faustovirus / roman virüsü).
Şekil 1: Mikromanipülasyon için malzemeler. (A) İş istasyonunun gerçek kurulumu. (B) İş istasyonunun bileşenlerinin şematik çizimi. (C) Mikrokapillerin şematik illüstrasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mikro aspirasyon basamakları. (A) Tek hücre yalıtımı yordamı (zoom x40). (B) Tek hücre aspirasyonunun farklı adımlarının şematik çizimi: 1) Hücrenin lokalizasyonu. 2) Hücrenin aspirasyonu. 3) Serbest bırakma adımı. Siyah oklar mikrokapillerı, beyaz oklar tek hücreyi gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PCR tarama ve onay. Usurpativirus LCD7 ve Faustovirus için yapılan mikro-aspirasyonların PCR taraması. Mikro aspirasyon işleminden sonra klon 7'de Usurpativirus LCD7 DNA (+) varlığı ve Faustovirüs DNA'sının yokluğu (–) gözlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Negatif boyama mikrografı. Viral süspansiyon negatif boyama, saf Clandestinovirus ST1 gösteren (A) ve Usurpativirus LCD7 (B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Temsili kapı parselleri. (A) Daha önce virüs DNA etiketleme için floresan moleküler problar ile boyanmış her bir viral popülasyonun süperimpozisyon (daha önce açıklanan protokol26,30aşağıdaki). Resmin sol kısmında Faustovirus beş suşları (koyu yeşil, açık yeşil, turuncu, kırmızı ve mavi) süperpozisyon gösterir. Sağda, Faustovirus ST1 ve Clandestinovirus ST1 (açık mor ve koyu mor) süperpozisyonu görülebilir. (B) Faustovirus (solda) ile aynı kapıda faustovirus ve Usurpativirus'un iki viral popülasyonunun varlığı. Saf Usurpativirus bir nokta arsa faustovirus (sağda) için daha önce tanımlanan aynı kapıyı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| PYG kompozisyonu | Miktar |
| Proteoz pepton | 20 g |
| Maya özü | 20 g |
| MgSO4·7H2O | 0.980 g |
| CaCl2 | 0,059 g |
| Sitrat sodyum. Dihidrat | 1 g |
| Fe (NH4) 2(SO4) 2 x 6H2O | 0,02 g |
| Glikoz | 18 g |
| Distile su | 1 L |
| HCl veya KOH ile pH'ı 6.8'de ayarlayın | |
| Otoklav 15 dk 121 °C | |
| Açlık orta | nicel |
| Maya özü | 2 g |
| Glikoz | 18 g |
| Fe (NH4) 2(SO4) 2 x 6H2O | 0,02 g |
| PAS (aşağıda ayrıntılı olarak) | 1 L |
| PAS çözeltisi A | nicel |
| KH2PO4 | 0,136 g |
| Na2HPO4 | 0,142 g |
| PAS çözeltisi B | nicel |
| MgSO4·7H2O | 4.0 mg |
| CaCl2·2H2O | 4.0 mg |
| Nacl | 0.120 g |
| 10 mL çözeltisi A ve B distile suya 1 L eklenir. |
Tablo 1: Kültür Medyasının Bileşimi.
| Virüs hedefi | Hedef gen | Foward astar (5->3) | Ters astar (5->3) |
| Faustovirüs RpB2 | RpB2 | CWCAATCHGCYGATACHGGTGA | TGATTWGCYAATGGNGCYGC |
| Usurpatvirus LCD7 Majör kapsid geni | Majör kapsid geni | GGGCAAGAAGCTCCAAGCTA | GGGTGtGAGGAGTCAACG |
| Clandestinovirus ST1 Minör kapsid geni | Minör kapsid geni | AAAATGAACGCGTTGGAGGAGGC | ACCGGCGAATGTTCCTATGG |
Tablo 2: PCR için Kullanılan Primmer Dizileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tek hücreli mikro-aspirasyon işleme süresi ve iyi çalışması operatöre bağlıdır. Deneyin farklı adımları kesinlik gerektirir. İş istasyonunun mikromanipülasyon bileşenlerinin kullanımı, mikro-aspirasyon sürecini ve hücrenin salınımını gözlemleyerek sürekli kontrol altında olmalıdır. Mikroskobik gözlem ile takip bir hücrenin yakalanması ve transferi için gereklidir. Deneyimli bir operatör 10 hücreleri izole etmek ve izole edilecek virüslerin bolluğuna bağlı olarak tek tek aktarmak için 1 ila 2 saat sürebilir. Manipülasyon sayısı değişebilir. Biz 10 manipülasyonlar ile başlayan tavsiye ederiz. Tanım olarak, bilinmeyen virüsün içsel özelliklerini bilmiyoruz. Bu nedenle, bu virüsleri ayırma başarısını optimize etmek için izolasyon için farklı stratejilerin kullanılması ve geliştirilmesi gereklidir.
Mikro-aspirasyon işlemi steril olmayan koşullar altında yapılır (mikrobiyolojik güvenlik istasyonu dışında bir bankta) ve böylece kullanımını kısıtlar ve insan patojenlerin çalışma için uygulanmasını engeller. Bu nedenle, kirleticimaddeleri sınırlamak için antibiyotik ve antifungalkarışımı nın kullanılması zorunludur. Yöntemin bir diğer sınırlaması da, sadece mikromanipülasyon bileşenlerinin monte edildiği ışık mikroskobu ile gözlemlenebilen mikroorganizmalar üzerinde yapIlebilen mikroorganizmalar üzerinde yapılabilmesi, bu yÃ1/4zden de ışıkla gözlemlenemeyen mikroorganizmalar Ã1/4nÃ1/4 yapılama Mikroskopi. Ancak, enfekte konakları ayırmak ve klonlama oluşan dolaylı bir strateji kullanarak ışık mikroskobu altında görünmez kalan yaklaşık 200 nm'lik dev virüsleri ayırabildik.
Amip yakalama için tek hücreli mikro-aspirasyon gelişimi nüfus sıralama yöntemlerinin gelişiminin bir parçasıdır. Tek hücreli mikro-aspirasyon bize iki yeni dev virüs izole etmek için izin, Clandestinovirus ST1 ve Usurpativirus LCD7, Faustovirüsler ayırt edici özellikleri ile. Clandestinovirus ST1 ve Usurpativirus LCD7'nin Faustovirus LCD7'ye olan son derece benzer morfolojik özellikleri ve replikasyon farklılıkları, genellikle dev virüslerin ayıklanmasında kullanılan FACS'nin sınırını göstermektedir. Clandestinovirus ST1 ve Faustovirus ST1(Şekil 5A)olmak üzere iki viral popülasyonun süperpozisyonu ve Usupartivirus LCD7 ve Faustovirus LCD7'nin saptanması ile temsil edilmektedir. Ancak, bu yeni yöntem ile, tüm manipülasyon serbest bırakıldıktan sonra bile hücre ve bütünlüğünü dikkatli bir şekilde izlenmesi ile görsel kontrol altındadır. Doğrudan enfekte amip sıralamak için akış sitometri kullanımı dolaylı olarak yeni virüsler sıralamak için alternatif bir çözüm olabilir. Bu yöntem genellikle sitopatik etkileri veya lysis tespit etmek için plaka tarama takip eder. Karışımda litik olmayan virüslerin varlığı amip ayrıştırma için bir sınır temsil edebilir. Ancak, bu protokol ve bu iki roman izolasyonoluşturulmasında incelenmedim.
Genel olarak hücrelerin konumlandırılması ve tutulmasında mikromanipülasyon uygulaması nın ötesinde ve intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI)33için yumurtalar, tek hücreli mikro-aspirasyon için pratik bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır tek izolasyon optik mikroskop altında gözlemlenebilir prokaryotik hücreler31. Diğer uygulamalar, mikroorganizmaların karışık bir örnek farklı saf örnekleri için morfolojik olarak hücre sıralama dahil test edilebilir. Mikroorganizmaların gözlemlenebilir ayrımı yukarıda açıklanan strateji kullanılarak öngörülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarların açıklayacak bir şeyi yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar hem Jean-Pierre Baudoin ve Olivier Mbarek kendi tavsiye ve Claire Andréani İngilizce düzeltmeler ve değişiklikler ona yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Anr-10-IAHU-03 (Méditerranée Enfeksiyonu) referansı ile "Investissements d'avenir (Gelecek için Yatırımlar)" programı kapsamında Ulusal Araştırma Ajansı tarafından yönetilen Fransız Devleti'nin bağışı ile desteklenmiştir. Côte d'Azur ve Avrupa finansman FEDER PRIMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 with Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2 | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
References
- Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses. Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).
- Li, Y., et al. Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome. Virology. 237 (2), 360-377 (1997).
- Scola, B. L. A Giant Virus in Amoebae. Science. 299 (5615), 2033 (2003).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Antwerpen, M. H., et al. Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba. Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).
- Legendre, M., et al. In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).
- Legendre, M., et al. Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family. Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).
- Aherfi, S., et al. A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses. Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).
- Andreani, J., et al. Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses. Viruses. 8 (11), 300 (2016).
- Rodrigues, R. A. L., et al. Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses. Journal of Virology. , 00372 (2018).
- Bertelli, C., et al. Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity. Environmental Microbiology. , (2017).
- Levasseur, A., et al. Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution. Genome Biology and Evolution. , (2016).
- Dornas, F. P., et al. A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae. Viruses. 8 (3), 76 (2016).
- Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water. Journal of Virology. , (2019).
- Legendre, M., et al. Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes. Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).
- Abrahão, J., et al. Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere. Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).
- Bajrai, L., et al. Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae. Viruses. 8 (12), 278 (2016).
- Andreani, J., et al. Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses. Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).
- Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Moniruzzaman, M., et al. Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution. Virology. 466-467, 60-70 (2014).
- Gallot-Lavallée, L., Blanc, G., Claverie, J. -M. Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family. Journal of Virology. , (2017).
- Deeg, C. M., Chow, C. -E. T., Suttle, C. A. The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea. eLife. 7, 235 (2018).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).
- Khalil, J. Y. B., et al. High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining. Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).
- Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).
- Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. Updating strategies for isolating and discovering giant viruses. Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).
- Andreani, J., et al. Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses. Journal of Virology. , (2017).
- Khalil, J. Y. B., et al. Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).
- Fröhlich, J., König, H. New techniques for isolation of single prokaryotic cells. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).
- Kimura, Y., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).
