Summary
כאן, אנו מתארים שיטת מיקרו-השאיפה תא אחד להפרדה של אמבות נגוע. על מנת להפריד אוכלוסיות משנה ויראלי ב Vermamoeba vermiformis נגוע על ידי פאוסטווירוסים ווירוסים ענקיים לא ידוע, פיתחנו את הפרוטוקול מפורט להלן והפגינו את יכולתה להפריד בין שני שפע ווירוסים ענק הרומן.
Abstract
במהלך התהליך שיתוף תרבות אמבה, יותר מווירוס אחד יכול להיות מבודד באר אחת. בעבר פתרנו את הבעיה הזאת באמצעות דילול נקודת הסיום ו/או מיון התא המופעל על ידי הזריחה (FACS) שהוחלו על האוכלוסייה הנגיפית. עם זאת, כאשר וירוסים בתערובת יש תכונות דומות מורפולוגיים ואחד הווירוסים מכפיל לאט, הנוכחות של שני וירוסים מתגלה בשלב של הרכבת הגנום והווירוסים לא ניתן להפריד לאפיון נוסף. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו תא בודד השאיפה מיקרו הליך המאפשר הפרדה ושיבוט של וירוסים דומים מאוד. בעבודה הנוכחית, אנו מציגים כיצד אסטרטגיה חלופית זו אפשרה לנו להפריד את האוכלוסיות הקטנות ויראליות של הST1 וירוס מLCD7, וירוסים ענקיים הגדלים לאט ואינם מובילים לליזה אמבות בהשוואה לליטיק ולגידול מהיר . וירוס פאוסטוו בקרת טוהר הוערך על ידי הגברה גנטית ספציפיים ווירוסים יוצרו לאפיון נוסף.
Introduction
נוקלאוציטופטוצימיק וירוסי DNA גדולים (NCLDV) הם מגוונים ביותר, המוגדרים על ידי ארבע משפחות להדביק eukaryotes1. הווירוסים הראשונים שתוארו עם גנום מעל 300 kbp היו phyd,כולל הנגיף כלורלה בורסאריה 1 PBCV12. הבידוד והתיאור הראשון של Mimivirus, הראה כי הגודל של וירוסים הוכפל במונחים של גודל של החלקיק (450 ננומטר) ואת אורך הגנום (1.2 Mb)3. מאז, וירוסים ענקיים רבים תוארו, בדרך כלל מבודדים באמצעות שיתוף תרבות אמבה הליך. כמה וירוסים ענקיים עם מורפולוגיות שונות ותכנים גנטיים יכולים להיות מבודדים מתאי האקאטאמבה sp., כולל Marseilleviruses, פנדוראוירוסים, Pithoviruses, Mollivirus ירוס, Cedratviruses, Pacmanvirus ירוס, tupanvirus, ולאחרונה וירוס4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. במקביל, הבידוד של vermamoeba vermiformis מותר בידוד ותיאור של וירוסים ענקיים faustovirus, kaumoebavirus, ו orpheovirus18,19,20. וירוסים ענקיים אחרים היו מבודדים עם protists המארחים שלהם, כגון קפטריה roenbergensis21, האוראוקוקוס anopהגאולה22, כריזוכרומלינה אבינה23, ו bodo saltans . עשרים וארבע כל הבודדים האלה היו תוצאה של מספר גדל והולך של צוותים העובדים על בידוד והמבוא של עדכוני אסטרטגיית תפוקה גבוהה25,26,27,28, כגון ה שיפור של מערכת שיתוף התרבות עם השימוש של cy, הזרמת הזרימה.
ב 2016, השתמשנו אסטרטגיה שיוך שיתוף התרבות והזרימה cy, נסה לבודד וירוסים ענקיים27. אסטרטגיה זו פותחה כדי להגדיל את מספר הדגימות מחוסן, כדי לגוון הפרולנים המשמשים כתומך התא, וכדי לזהות במהירות את הליזה של תמיכת התא. המערכת עודכנה על ידי הוספת צעד משלים כדי למנוע זיהוי ראשוני הביולוגיה המולקולרית וזיהוי מהיר של אוכלוסיה נגיפית לא ידוע כמו במקרה של Pacmanvirus29. הזיווגים זרימה cy, לנסות מיון התא מותר להפרדה של תערובת של Mimivirus ו Cedratvirus A1130. עם זאת, נתקלנו מאוחר יותר במגבלות של הפרדה וגילוי של אוכלוסיות משנה ויראליות אלה על ידי זרימה cy, לנסות. לאחר ברצף, כאשר הרכבנו את גנום של faustovirus ST125 ו faustovirus LCD7 (נתונים שלא פורסמו), אנו מוצאים במפתיע בכל הרכבה שני גנום משלים של שני וירוסים רומן לא מזוהה במסדי נתונים הגנום הציבורי. עם זאת, לא להזרים cy, או מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) הראו כי האמבות היו נגועים על ידי שני וירוסים שונים, ST1 הנגיף ו לחאבפטיב LCD7. עיצבנו מערכות PCR ספציפיות כדי להגביר את הנגיף, את הנגיף ואת סמני הפינווירוס בהתאמה על בסיס הגנום שלהם; המטרה שלנו הייתה לקבל מערכות מבוססות PCR המאפשרות אימות של טוהר הווירוסים המופרדים. עם זאת, דילול הנקודה הסופית והזרימה cyאני try לא הצליחו להפריד ביניהם. הבידוד של האוכלוסייה הנגיפית היחידה הזאת היה קשה משום שלא התאפיין במרכיבים מורפולוגיה ולא מרכיבים מחקריים של אוכלוסיות הנגיף והליפאיות. גילינו רק אוכלוסייה אחת ויראלית על ידי זרימה cy, לנסות בגלל חופפים של שתי האוכלוסיות (נבדק לאחר ההפרדה האפקטיבית). ניסינו להפריד ביניהן באמצעות מיון חלקיקים אחד על 96-צלחות, אבל לא הבחנו בשום השפעות סייטואטמית, ולא גילינו את ההשפעות השליליות של הנגיף או החאפיפטיו על ידי ה-PCR. לבסוף, זה היה רק שילוב של דילול נקודת הקצה ואחריו אמבה מיקרו-שאיפה אחת הזמינה הפרדה של שני אלה נמוכה שפע וירוסים ענקיים מן פאוסטוירוסים. שיטת הפרדה זו היא האובייקט של מאמר זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. אמבה התרבות
- השתמש Vermamoeba vermiformis (זן CDC19) כתמיכה תא.
- הוסף 30 מ ל של פרוטאז-peptone-שמרים לחלץ-גלוקוז בינוני (שולחן 1) ו 3 מ ל אמבות בריכוז של 1 x 106 תאים/mL ב 75 ס מ2 תרבות התא בקבוקון.
- שמור על התרבות ב -28 ° c.
- לאחר 48 h, מכמת את האמבות באמצעות ספירת שקופיות.
- כדי לשטוף, לקצור את התאים בריכוז של 1 x 106 תאים/mL ו הגלולה אמבות הצנטריפוגה ב 720 x g עבור 10 דקות. להסיר את supernatant ולהשעות את הגלולה בנפח המתאים של הרעב בינונית כדי לקבל 1 x 106 תאים/mL (טבלה 1).
2. הפצת וירוס מניות באמבות
הערה: לפני דילול, חשוב לתרבות את דגימת המניה כדי להשיג מספיק תרבות טרייה, ולאחר מכן להמשיך לסינון.
- השתמש 1 x 106 של התרבות אמבה ב רעב בינוני.
- איחסן את התערובת של וירוסים שהונפקו מתוך פתרון המניה (פאוסטווירוס/LCD7 או פאוסטווירוס/מST1) לאחר התהליך המשותף של התרבות על התמיכה הסלולרית בריבוי של זיהום (מוי) של 0.01.
הערה: משרד הראשי חשוב להפחית את שפע האוכלוסיה הנגיפית הגדולה ומספר התאים הנגועים. - דגירה ב 30 ° צ' עד ההשפעות אפקט ציטופתי (cpe) הם המושרה, כגון מעגל אמבות או הליזה, כ 10 כדי 14 h לאחר ההדבקה.
- לאסוף את המדיה פילטרט דרך מסנן 5 יקרומטר כדי להסיר פסולת תאית.
3. דילול נקודת הקצה
- בצע דילול טורי (10-1 עד 10-11) של המדגם הנגיפי ב רעב בינונית (שולחן 1).
- האיחסן 2 מ ל של 1 x 106 vermamoeba vermiformis הכלול כל צלחת פטרי עם 100 μl של התערובת התרכובת.
- מניחים את מנות פטרי בשקית פלסטיק בקצב של 30 ° c.
- התחילו להתבונן במנות פטרי עם מיקרוסקופ אופטי הפוך ב -6 החותמות ולבדוק מורפולוגיה של התאים כל 4 עד 8 h.
- במראה של האפקט אפקט ציטופתי המאופיינת על ידי עיגול התאים, להתחיל את התהליך בודד מיקרו השאיפה.
4. תא יחיד מיקרו השאיפה
-
. הכן את הפונדקאי
הערה: הכנה זו מורכבת לשחרור של תאים בודדים נגועים לתמיכה בתאים טריים.- לטפל אמבות בתרבות עם סוכן מיקרוביאלית המכיל 10 μg/mL של vancomycin, 10 μg/mL של שפחקות, 20 μg/mL של ציפרופלוקסאצין, 20 μg/mL של דוקסיציקלין, ו 20 μg/mL של וריקונזול. תערובת זו משמשת כדי למנוע זיהום חיידקי ופטרייתי.
הערה: ההליך מתרחש על ספסל מחוץ לתחנת הבטיחות הביולוגית. הוסף 2 מ ל אמבות מרוכז ב 1 x 106 תאים/mL כל אחד לתוך 15 מנות פטרי. לצורך הדבקות אמבה, התרבות ב 30 ° c עבור 30 דקות.
- לטפל אמבות בתרבות עם סוכן מיקרוביאלית המכיל 10 μg/mL של vancomycin, 10 μg/mL של שפחקות, 20 μg/mL של ציפרופלוקסאצין, 20 μg/mL של דוקסיציקלין, ו 20 μg/mL של וריקונזול. תערובת זו משמשת כדי למנוע זיהום חיידקי ופטרייתי.
- בחר את צלחת פטרי המשמש מיקרו שאיפה מן הגבלת דילול על פי הקריטריונים הבאים: 1) היעדרות של זיהום גלוי על ידי סוכנים פטרייתי וחיידקיים, 2) ראיות של השפעה אפקט ציטופתי של אמבות עקב וירוסים, ו 3) לקדם הפרה ועיגול של האמבות (כדי למנוע שאיפה של חלקיקים ויראליות).
-
הגדר תחנת עבודה עם החומרים הבאים (ראה איור 1א, ב):
מיקרומניפולציה, המאפשרת מיצוב מיקרונימי;
שליטה ידנית המכשיר הלחץ, משמש לסחיטת ולשחרר את התאים לתוך המיקרונימים;
מיקרוסקופ הפוך;
הכנס-הפעל מודולים מוטוריים;
מצלמה
מודול מחשב להמחיש מניפולציה ולצלם. - בחרו מיקרוקפילר (ראו איור 1ג).
הערה: גודל התאים, הדפורמציה והדבקה של הקרומים שלהם למשטחים, והתנועתיות הסלולרית יכולה להשפיע על ההתקדמות החלקה של השאיפה הזעירה. הקוטר המיקרונימי יכול להיבחר במדויק ולהתאים לסוגי תאים ספציפיים בהתאם לגודלם ולשיטות השאיפה שלהם. מיקרוקפילר של 20 יקרומטר קוטר פנימי שימש כדי לבשל אמבה מעוגל (קוטר ~ 10 יקרומטר). הדבר מאפשר לתחזוקת מעמד פנימי ולשחרור קל של התא. -
. לטעון את המערכת
- לתקן את זווית הפעולה של המערכת מרתק על מודול מוטורי ב 45 °.
- בצע התקנה כפולה, תחילה על מערכת האחיזת, ולאחר מכן על המיקרונימים.
- להתמקד בתאים לאחר הפעלת כמה טיפות שמן דרך המיקרונימים.
הערה: השמן המינרלים עם התאימות הביולוגית מסופק על ידי המכשיר. - השלם התקנה מלאה לאחר ההמלצות של היצרן.
-
תאים לשכפול (ראה איור 2א, ב).
הערה: הליך זה דומה לזו המתוארת על ידי Fröליך ו-König31.- מניחים את צלחת פטרי המכילה 2 מ ל אמבות נגוע מתחת למיקרוסקופ.
- התמקד הראשון על התאים, ולאחר מכן על המיקרונימים שקוע בתרבות.
- בחרו תא בודד עגול והביאו את המיקרונימים הקרובים יותר למיקרומניפולציה.
- להפעיל שאיפה רכה עם בקרת לחץ ידני על התא, לקחת אותו בתוך המיקרונימים. הסר את התא היחיד מהדוגמה הראשונה ושחרר בתמיכה הסלולרית, ולאחר מכן הכתיאת הדגם ב-30 ° c.
- היערכו תצפיות יומיות עם מיקרוסקופ אופטי הפוך כדי להתבונן במראה של התאים ולפקח על הופעתה של אפקט אפקט ציטופתי.
5. הקרנת PCR
הערה: לאחר שלב 4, הקרנה שיטתית של ה-PCR היא חיונית לאישור ההפרדה. בשני וירוס לחגם/פאוסטווירוס ובנגיף/פאוסטווירוס, העיצוב והיישום של מערכות תחל ובדיקה ספציפיות שנעשו באמצעות פריימר-הפיצוץ באינטרנט32 (שולחן 2).
- לחלץ DNA מחלק של דגימות תרבות חיובית (כלומר, שם אפקט אפקט ציטופתי הוא נצפתה), באמצעות מערכת החילוץ אוטומטי על פי פרוטוקול של היצרן.
- השתמש בתחל מעוצב כראוי.
הערה: כאן עיצבנו התחל כדי להגביר את הגנים המרכזיים מסומן כמו RpB2 (Faustovirus), LCD7 הגדול capsid חלבון (לדעה) ו capsid הקטין חלבון (הנגיף) -
השתמש ב-PCR הסטנדרטי באמצעות הציקלהטרטרנר.
- בצע את 20 μL PCR תגובות עם 50 μM של כל פריימר (שולחן 2), 1X מיקס מאסטר, ו RNase מים חופשיים.
- להפעיל את ה-DNA Taq פולימראז עבור 5 דקות ב 95 ° c, ולאחר מכן לעקוב אחר 45 מחזורים של 10 הדנטורציה ב 95 ° צ', ריפוי של התחל עבור 30 s ב 58 ° c, ואת השלוחה של 30 ב 72 ° c.
- הפעל את מוצרי ה-PCR על 1.5% agarose ג'ל, כתם עם הכתם ג'ל DNA (טבלת חומרים), ולהמחיש עם UV.
6. וירוס הייצור וטיהור
- שימי את שאר התרבות של צלחת פטרי. בבקבוקון קטן
- עבור ייצור וירוס, להכין 15 מבחנות של 145 ס"מ2, המכיל 40 ML של Vermamoeba vermiformis ב רעב בינוני ו 5 מ ל של וירוס מבודד כבר הועבר ממנה פטרי לצלוחיות קטנות.
- לטפל עם אנטיביוטיקה ותערובת פטריות בשימוש בשלב 4.1.
- מודטה ב -30 ° c. צפו בכל יום עם מיקרוסקופ אופטי הפוך.
- לאחר הזיהום המלא, הבריכה כל מבחנות. השתמש במסנן 0.45 יקרומטר כדי למנוע שרידים.
- Ultracentrifuge כל supernatants ב 50,000 x g עבור 45 min.
- לאחר צנטריפוגה, להסיר את הסופרנטאנט מכל צינור על ידי שאיפה ולהשעות מחדש את הגלולה ב 1 מ ל של מלוחים באגירה פוספט (PBS).
- לטהר את הנגיף המיוצר באמצעות 25% סוכרוז (27.5 g סוכות ב 100 מ ל של PBS, מעוקר על ידי סינון).
- צנטריפוגה 8 מ ל של סוכרוז 2 מ ל של הבולם הנגיפי ב 80,000 x g עבור 30 דקות. השהה את הגלולה הנגיפית ב-1 מ ל של PBS. אחסן אותו ב-80 ° c.
7. שלילי כתמים ושידור אלקטרון מיקרוסקופ
הערה: בו ח'ליל ואח ' פרסם בעבר את פרוטוקול27זה.
- הפקדה 5 μL של הליזה סופר על הרשת משוחררת זוהר. השאירו כ-20 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: הזוהר-פריקה מאפשר לנו להשיג רשת הידרופילית על ידי יישום פלזמה. - יבש את הרשת בזהירות להפקיד טיפה קטנה של 1% אמוניום molybdate על זה 10 s. להשאיר את הרשת להתייבש 5 דקות.
- המשך לתצפיות המיקרוסקופיה האלקטרונים ב200 קוו
8. אפיון מST1 וירוס הLCD7
- אפיון אוכלוסיות טהורות של הST1 וירוס הLCD7 באמצעות רצף הגנום, הרכבת הגנום, ניתוחים בביואינפורמטיקה וחקר מחזור replicative שלהם כפי שעשינו עבור וירוסים אחרים10,20, . עשריםושבת
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיקרו-שאיפה תא יחיד הוא תהליך מיקרומניפולציה הממוטב בכתב יד זה (איור 1). טכניקה זו מאפשרת לכידת של אמבה מעוגל, נגוע (איור 2א) ושחרורו בלוח הרומן המכיל אמבות נגוע (איור 2). זהו אב-טיפוס פונקציונלי שחלה על מערכת התרבות המשותף והיא מבודדת בהצלחה וירוסים ענקיים שאינם ליטיים. גישה זו שימש בפעם הראשונה בתחום של וירוסים ענקיים והיה אפשר לבודד שני חדשים בשפע נמוכה וירוסים ענקיים. קראנו לווירוסים החדשים ST1 וירוס מLCD7, שהיו בשפע נמוך בהשוואה לשפע הגדול של פאוסטווירוסים. על מנת לנתח את הנוכחות הנגיפית בכל לוחית לאחר הניתוח המיקרו-שאיפה, החלתי את ה-PCR על 15 השאיפות המיקרו. הבחנו בנגיף הLCD7 הטהור (נוכחות של וירוס לאמפטיב [+] והעדר פאוסטווירוס [–]) רק בשכפול 7 (איור 3). טוהר השיבוט אושר על ידי ה-PCR עם פרוטוקולים ספציפיים המכוונים לST1 וירוס הLCD7 (שולחן 2). המיקרוסקופיה האלקטרונית חשפה את הופעתו של "הST1 וירוס" ומLCD7 (איור 4), הכולל מורפולוגיה מעשית בלתי-מישור טיפוסית ללא פיברילס, והוא מקבל כרפס של כ-250 ננומטר, בהתאמה. לאחר אישור של טוהר הייצור, וירוס המשובטים הופק ומטוהר עבור רצף הגנום השלם אפיון נוסף, במיוחד הילוכים אלקטרוניים מיקרוסקופ (TEM) עבור לימודי הכפל מחזור. אנו אישר את חופפים של אוכלוסיות (פאוסטווירוס/וירוס הרומן) על ידי זרימה cy, (איור 5).
איור 1: חומרים למיקרומניפולציה. (A) התקנה בפועל של תחנת העבודה. (ב) תרשים סכמטי של רכיבי תחנת העבודה. (ג) תרשים סכמטי של המיקרונימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מיקרו-השאיפה צעדים. (א) הליך בידודשל תא יחיד (x40 zoom). (ב) תרשים סכמטי של השלבים השונים של השאיפה התא היחיד: 1) לוקליזציה של התא. 2) השאיפה של התא. 3) שלב שחרור. החיצים השחורים מראים את המיקרוקפילר והלבנים מציגים את התא הבודד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: PCR הקרנה ואישור. הקרנת ה-PCR של שאיפות מיקרו שבוצעו עבור לLCD7 וירוס ופוסטווירוס. נוכחות של הנגיף LCD7 DNA (+) והעדר DNA Faustovirus (–) נצפתה עבור שיבוט 7 לאחר הליך מיקרו השאיפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מיקרוגרף שלילי. כתמים שליליים של ההשעיה הנגיפית, מציג ST1 וירוסהטהור (A) ו-LCD7 וירוס (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מגרשים לשערים מייצגים. (א) הטלת מענק של כל אוכלוסייה ויראלית בעבר מוכתמת בבדיקות פלורסנט מולקולרית עבור תוויות DNA שלוירוסים (בעקבותהפרוטוקול המתואר בעבר 26,30). החלק השמאלי של התמונה מראה את מיקום הסופרפוזיציה של חמישה זנים של Faustovirus (ירוק כהה, ירוק בהיר, כתום, אדום וכחול). מימין, מיקום הסופרפוזיציה של פוסטווירוס ST1 והפיאווירוס ST1 (סגול בהיר וסגול כהה) גלוי. (ב) נוכחות של שני אוכלוסייה ויראלית של פאוסטווירוס ונגיף לדעה באותו שער של פאוסטווירוס (משמאל). מגרש נקודה של וירוס לדעה טהורה מראה את אותו שער שהוגדר בעבר עבור Faustovirus (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| הרכב PYG | כמויות |
| פנימה פרוטקוזה | 20 גר' |
| תמצית שמרים | 20 גר' |
| מדחס4· 7h2O | 0.980 גרם |
| מיכל2 | 0.059 גרם |
| נתרן ציטראט. דידראזה | מיכל הג |
| פה (NH4) 2 (SO4) 2 x 6h 2O | 0.02 גרם |
| גלוקוז | בת 18 |
| מים מזוקקים | 1 ליטר |
| להתאים את ה-pH ב 6.8 עם HCl או KOH | |
| אוטוקלב 15 דקות ב 121 ° צ' | |
| הרעבה בינונית | כמויות |
| תמצית שמרים | 2 הוראות המשחק |
| גלוקוז | בת 18 |
| פה (NH4) 2 (SO4) 2 x 6h 2O | 0.02 גרם |
| PAS (מפורט להלן) | 1 ליטר |
| הפתרון PAS A | כמויות |
| KH2פו4 | 0.136 גרם |
| Na2hpo4 | 0.142 גרם |
| מענה ההPAS B | כמויות |
| מדחס4· 7h2O | 4.0 מ ג |
| כיתה2· 2h2O | 4.0 מ ג |
| מיכל שלמה | 0.120 גרם |
| 10 מ ל כל אחד של פתרון A ו-B מתווספים 1 L של מים מזוקקים. |
שולחן 1: קומפוזיציה של מדיית תרבות.
| מטרת וירוס | גן יעד | (5 > 3) | פריימר הפוכה (5-> 3) |
| פאוסטווירוס RpB2 | RpB2 | המנון מסצ | מיכל התאומים |
| לLCD7 וירוס בנגיף הגדול | . המייג קפסיד ג'ין | מיכל ברקת | מיכל ברקת |
| הנגיף ST1 קטין גן הקפיסיד | הגן הקטן | AAAATGAACGCGTTGGAGGC | מיכאל ברקת |
שולחן 2: רצפי מאמר משמש עבור ה-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
משך הטיפול במיקרו-שאיפה התא היחיד ותפקודו התקין הוא תלוי-מרכזיה. השלבים השונים של הניסוי דורשים דיוק. השימוש ברכיבי המיקרומניפולציה של תחנת העבודה חייב להיות תחת שליטה מתמדת על-ידי התבוננות בתהליך של שאיפה מיקרו ושחרורו של התא. המעקב אחר התבוננות מיקרוסקופית הוא הכרחי ללכידה והעברה של תא. מפעיל מנוסה יכול לקחת 1 כדי 2 כדי לבודד 10 תאים ולהעביר אותם אחד אחר אחד בהתאם לשפע של וירוסים להיות מבודדים. מספר המניפולציות יכול להשתנות. אנו מייעצים להתחיל עם 10 מניפולציות. לפי ההגדרה, אנחנו לא יודעים את המאפיינים הפנימיים של הווירוס לא ידוע. לפיכך, השימוש והפיתוח של אסטרטגיות שונות עבור בידוד נחוצים כדי לייעל את ההצלחה של הפרדת וירוסים אלה.
תהליך המיקרו-שאיפה מבוצע בתנאים לא סטריליים (על ספסל מחוץ לתחנת הבטיחות של מיקרוביולוגית) ובכך מגביל את השימוש בו ומונע את יישומו בחקר פתוגנים אנושיים. לכן, השימוש בתערובת של אנטיביוטיקה ואנטי-בנות כדי להגביל את המזהמים הוא הכרחי. מגבלה נוספת של השיטה היא שניתן לבצעו רק על מיקרואורגניזמים הנצפה על ידי מיקרוסקופ אור שעליו נטענו רכיבי המיקרומניפולציה, ולכן, מבחינה קונספטואלית לחיסול כל עבודה על מיקרואורגניזמים שלא נצפה באור יקרוסקופ. עם זאת, הצלחנו להפריד וירוסים ענקיים של כ 200 ננומטר שנותרו בלתי נראים תחת המיקרוסקופ אור באמצעות אסטרטגיה עקיפה המורכבת הפרדה ושיבוט של המארחים נגועים.
הפיתוח של תא יחיד השאיפה מיקרו לכידת אמבות הוא חלק מפיתוח של שיטות מיון האוכלוסייה. תא יחיד השאיפה מיקרו לנו לבודד שני וירוסים ענקיים חדשים, ST1 וירוס פיאנטאווירוס LCD7, עם מאפיינים ייחודיים מ פאוסטוירוסים. המאפיינים המכולוגיים הדומים מאוד של הST1 והLCD7 של הפיאנטירוס והנגיף לאחר מכן לפוסטווירוס LCD7 והשוני בשכפול מראים את המגבלה של FACS, המשמשת בדרך כלל במיון ענק של וירוסים. הוא מיוצג על ידי מיקום הסופרפוזיציה של שתי אוכלוסיות ויראליות, הST1 ו-Faustovirus ST1 (איור 5א) וגם על-ידי זיהוי של LCD7 ו-faustovirus LCD7. עם זאת, עם שיטה חדשה זו, מניפולציה כולה היא תחת שליטה חזותית עם ניטור זהיר של התא ואת שלמות גם לאחר השקתו. השימוש של cy, לנסות למיין באופן ישיר אמבות נגוע יכול להיות פתרון אלטרנטיבי בעקיפין וירוסים רומן מיון. שיטה זו מלווה בדרך כלל הקרנת הצלחת על מנת לזהות אפקטים אפקט ציטופתי או הליזה. הנוכחות של וירוסים שאינם ליטיים בתמהיל יכול לייצג מגבלה למיון אמבות. עם זאת, לא נחקרו הדבר ביצירת פרוטוקול זה ולשני הבודדים החדשניים.
מעבר ליישום של המיקרומניפולציה במיקום והחזקת התאים בכלל ו-oocytes עבור הזרקת זרע תאיים (ICSI)33, תא יחיד מיקרו שאיפה הוכיחה להיות שיטה מעשית לבידוד של יחיד תאים prokaryotic הנצפה תחת מיקרוסקופ אופטי31. ניתן לבדוק יישומים אחרים, כולל מיון תאים על בסיס מורפולוגי לקבל דגימות טהורות שונות ממדגם מעורב של מיקרואורגניזמים. ניתן לתאר את ההפרדה הנצפה של מיקרואורגניזמים באמצעות האסטרטגיה המתוארת לעיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. לכל הסופרים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות גם לג פייר בודואן ולאוליביה מבארק על העצה שלהם ועל קלייר אנדראני על עזרתה בתיקונים ושינויים באנגלית. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמדינה הצרפתית מנוהלת על ידי סוכנות המחקר הלאומית תחת "מחקר השקעות לעתיד" התוכנית עם התייחסות ANR-10-IAHU-03 (זיהום מסיבי) ועל ידי Région פרובנס אלפ קוט ד'אזור והמימון האירופאי פדר PRIMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 with Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2 | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
References
- Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses. Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).
- Li, Y., et al. Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome. Virology. 237 (2), 360-377 (1997).
- Scola, B. L. A Giant Virus in Amoebae. Science. 299 (5615), 2033 (2003).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Antwerpen, M. H., et al. Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba. Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).
- Legendre, M., et al. In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).
- Legendre, M., et al. Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family. Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).
- Aherfi, S., et al. A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses. Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).
- Andreani, J., et al. Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses. Viruses. 8 (11), 300 (2016).
- Rodrigues, R. A. L., et al. Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses. Journal of Virology. , 00372 (2018).
- Bertelli, C., et al. Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity. Environmental Microbiology. , (2017).
- Levasseur, A., et al. Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution. Genome Biology and Evolution. , (2016).
- Dornas, F. P., et al. A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae. Viruses. 8 (3), 76 (2016).
- Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water. Journal of Virology. , (2019).
- Legendre, M., et al. Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes. Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).
- Abrahão, J., et al. Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere. Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).
- Bajrai, L., et al. Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae. Viruses. 8 (12), 278 (2016).
- Andreani, J., et al. Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses. Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).
- Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Moniruzzaman, M., et al. Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution. Virology. 466-467, 60-70 (2014).
- Gallot-Lavallée, L., Blanc, G., Claverie, J. -M. Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family. Journal of Virology. , (2017).
- Deeg, C. M., Chow, C. -E. T., Suttle, C. A. The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea. eLife. 7, 235 (2018).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).
- Khalil, J. Y. B., et al. High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining. Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).
- Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).
- Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. Updating strategies for isolating and discovering giant viruses. Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).
- Andreani, J., et al. Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses. Journal of Virology. , (2017).
- Khalil, J. Y. B., et al. Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).
- Fröhlich, J., König, H. New techniques for isolation of single prokaryotic cells. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).
- Kimura, Y., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).
