Generation av Chimeric Axolotls med Mutant Haploid lemmar genom embryonala Ympning

Summary

Detta mål med detta protokoll är att producera chimära axolotls med haploida framben som härrör från Cas9-mutagena givare vävnad med embryonalvävnad ympning tekniker.

Abstract

En växande uppsättning genetiska tekniker och resurser gör det möjligt för forskare att undersöka de molekylära ursprunget till förmågan hos vissa arter av salamandrar, såsom axolotls, att regenerera hela lemmar som vuxna. Här beskriver vi tekniker som används för att generera chimära axolotls med Cas9-mutagena haploida framben som kan användas för att utforska genfunktion och trohet lem förnyelse. Vi kombinerar flera embryologiska och genetiska tekniker, inklusive haploid generation via in vitro aktivering, CRISPR/Cas9 mutagenesis, och vävnad ympning i ett protokoll för att producera ett unikt system för haploid genetisk screening i en modell organism av förnyelse. Denna strategi minskar antalet djur, utrymme och tid som krävs för funktionell analys av gener i lem förnyelse. Detta gör det också möjligt att undersöka regenereringsspecifika funktioner hos gener som kan krävas för andra viktiga processer, såsom organogenes, vävnadsmorfgenes och andra viktiga embryonala processer. Den metod som beskrivs här är en unik plattform för att genomföra haploid genetisk screening i en ryggradsdjur modellsystem.

Introduction

Historiskt sett har embryonal vävnad ympning i amfibier varit en viktig teknik för att utforska grundläggande mekanismer för utvecklingsbiologi och förnyelse. Axolotl, en art av salamander, har en imponerande förmåga att regenerera vävnader och komplexa strukturer som lemmar och organ efter skada eller amputation. På samma sätt kan de få, utan avslag, vävnadstransplantat från andra individer på embryonala, unga och vuxna stadier^1,2,3. Regioner av embryon som producerar hela strukturer såsom lemmar, svansar, ögon och huvuden, och mer specifika vävnader, såsom neuroectoderm och somiter, kan ympas mellan embryon för att producera chimära djur^1,2,4,5,6. I nästan ett sekel har studier av sådana chimärdjur gett avgörande insikter i förnyelse, vävnadsdifferentiering, storlekskontroll och mönster^1,7,8.

Under det senaste decenniet har många transkriptionsstudier av regenererande vävnader gett insikter i de genetiska program som ligger till grund för salamanderförnyelse^{9,10,11,12,13}. Dessa studier har lagt till en växande lista över kandidatgener som hittills till stor del är okarakteriserade i samband med förnyelse. Riktade mutagenestekniker, såsom CRISPR/Cas, tillåter nu undersökning av sådana gener, och sådana genetiska metoder underlättas i hög grad av den senaste tidens sekvensering och montering av den stora axolotl^{genomet 14,15,16}.

Vi försökte utveckla tekniker som kopplade klassisk utvecklingsbiologi med ny genetisk teknik i syfte att dissekera mekanismerna för förnyelse. Metoder för att generera haploida embryon från axolotler och andra salamandrar har fastställts i årtionden¹⁷. Även om dessa tekniker länge har noterats vara fördelarna med salamandrar som genetiska modellorganismer^18,har få efterföljande genetiska studier införlivat haploida djur. Vi använder in vitro aktivering i axolotl att producera haploida embryon som fungerar som vävnadgivare för ympning¹⁹. Med hjälp av embryon som transporterar fluorescerande genetiska markörer har vi utarbetat tillförlitliga metoder för att generera lemmar som nästan helt härrör från donatorvävnader(figur 1A). Genom att kombinera dessa två tekniker har vi kringgått den sena embryonala dödligheten i samband med haploidisk, vilket möjliggör produktion av fullt utvecklade, ympade haploida lemmar(figur 1B, figur 1B’och figur 2).

Genom att genomföra CRISPR/Cas-medierad mutagenes i haploida embryon före ympning för att skapa chimära axolotls med mutanta haploid lemmar, kan vi undersöka genfunktion specifikt inom ramen för lem utveckling och förnyelse. Detta gör det möjligt att rädda lemmar från potentiellt embryonala-dödliga mutant fenotyper. Medan CRISPR / Cas microinjection kan generera djur som är mycket mutant, sådana djur är vanligtvis mycket mosaik, med en viss grad av retention av vildtyp alleler och en mängd olika mutationer på riktade platser^14,20. CRISPR-baserade mutagenes i haploida celler ökar penetrans av enda allel förlust-of-function mutationer, eftersom de inte kan maskeras av kvar vildtyp alleler. Av denna anledning, CRISPR-baserad screening i haploid cellinjer används alltmer för att undersöka den genetiska grunden för många cellulära processer^21,22,23. Genom att kombinera CRISPR-baserade härstamning spårning med våra haploid lem knopp ympning protokoll, den strategi som beskrivs här kan fungera som en plattform för haploid genetiska skärmar hos levande djur²⁰.

Protocol

Experimentella förfaranden som används i detta protokoll godkändes av Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, 2017–10557) och var förenliga med alla federala riktlinjer och riktlinjer för användning av ryggradsdjur. Alla djurförsök utfördes på Ambystoma mexicanum (axolotls) i anläggningar vid Yale University. 1. Diploid Embryo Generation Få GFP + diploid embryon att fungera som moderplantor värdar genom naturlig parning med en eller…

Representative Results

Utveckla haploida embryon kan skiljas från diploidembryon genom deras “haploida syndrom” fenotyp29. I transplantatstadiet uppvisar haploida embryon minskad krökning längs den främre posterioraxeln och ofullständig kapsling av äggulans plugg (figur 3A). Ett fluorescerande mikroskop kan användas för att säkerställa att haploida embryon är fria från faderiskt framställda GFP-uttryck(figur…

Discussion

Det finns några kritiska steg i vårt protokoll för att generera haploid-diploid chimärer som driftteknikerbör överväga för konsekvent ympning resultat.

Den mest sannolika orsaken till haploid generation att misslyckas beror på dåliga in vitro aktiveringsförhållanden. De lämpliga mängderna malsperma måste användas för att aktivera ägg. För att förlänga motiliteten bör spermieprover alltid hållas vid 4 °C. Innan du applicerar spermaprov på ägg, kontrollera spermiernas l…

Materials

#55 Dumont Forceps	Fine Science Tools	11295-1	Only use Dumostar material (can be autoclaved)
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2942-20ML	20 mL
Antibiotic-Antimycotic 100x	Thermo Fisher	15240062
Ciprofloxacin	Sigma Aldrich	17850-5G-F
Ficoll 400 (polysucrose 400)	bioworld	40600032-3	Ficoll 400
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1914-250MG
Heating/Cooling Incubator	RevSci	RS-IF-233
Human Chorionic Gonadotropin	Merk		Chorulon
Megascript T7 Transcription Kit	Thermo Fisher	AM1334	40 reactions
Miroscope Cooling Stage	Brook Industries	Custom	Custom
NLS Cas9 Protein	PNAbio	CP01-200	4 vials of 50 µg protein each
Plasmocin	Invivogen	ant-mpt-1	Treatment level
Recipes
1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR)			0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4
40% Holtfreter's solution			20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4