نموذج تعبير كيميائي خارج الرحم لاختبار توظيف الضامة في فيفو
Summary
لاختبار تأثير chemokine على تجنيد الضامة في الجسم الحي، تم استخدام جبل كامل في الموقع التهجين للكشف عن التعبير خارج الرحم من chemokine، واستخدمت تلطيخ المناعة لتسمية الضامة. تم استخدام التصوير الحي للمراقبة في الوقت الحقيقي لهجرة الضامة.
Abstract
وتستخدم على نطاق واسع حمار وحشي في البحوث الأساسية والطبية الحيوية. العديد من خطوط حمار وحشي المعدلة وراثيا متاحة حاليا لتسمية أنواع مختلفة من الخلايا. بسبب الجسم الجنيني الشفاف من سمك الحمار الوحشي ، فمن المناسب بالنسبة لنا لدراسة تأثير واحد chemokine على سلوك نوع معين من الخلايا في الجسم الحي. هنا قدمنا سير العمل للتحقيق في وظيفة chemokine على هجرة الضامة في الجسم الحي. قمنا ببناء بلازميد الإفراط في التعبير الأنسجة الخاصة لالإفراط في التعبير IL-34 وحقن بلازميد في مرحلة خلية واحدة أجنة الأسماك المعدلة وراثيا التي وصفت الضامة على وجه التحديد من قبل بروتين الفلورسنت. ثم استخدمنا جبل كامل الفلورسنت في الموقع التهجين والمناعية للكشف عن نمط التعبير chemokine وعدد أو موقع الضامة. تم رفع الأجنة WT حقن لتوليد خط مستقر المعدلة وراثيا. وأخيرا، استخدمنا التصوير الحي البؤري لمراقبة سلوك الضامة مباشرة في الأسماك المعدلة وراثيا مستقرة لدراسة وظيفة IL-34 على الضامة في الجسم الحي.
Introduction
سمك الحمار الوحشي هو صغير الاستوائية الصلبة العظام أسماك المياه العذبة نشأت في الهند. وفيما يتعلق بحفظ الجينات، حمار وحشي لديها تشابه من 87٪ إلى الإنسان1. يمكن أن توفر لنا رؤى حول المواضيع ذات الصلة من الإنسان من خلال دراسة تنظيم الجينات، وظيفة البروتين وسلوك الخلية مثل الهجرة، et.al الانتشار في حمار وحشي. يمكن استخدام جنين سمك الحمار الوحشي لمراقبة تطور الأجنة المبكرة في مراحل مختلفة بعد تثبيط الصباغ. وفي الوقت نفسه، فإنه يأخذ ثلاثة أشهر فقط لحمار وحشي لتطوير إلى النضج الجنسي، ثم حمار وحشي يمكن أن تنتج مئات من البيض كل 4 أيام. صغيرة الحجم، وتربية بسيطة، والقدرة الإنجابية القوية، وهذه المزايا تجعل ثقافة حمار وحشي جدا توفير الفضاء، مما يؤدي إلى ثقافة واسعة النطاق. الماوس نموذج الثدييات التقليدية لديها تكاليف صيانة أعلى من حمار وحشي، وبالتالي الحد من حجم رفع الماوس. في جانب نمو الجنين المبكر ، من الصعب ملاحظة جنين الفأر في حالة حية بسبب خصائص نمو جنين الفئران في رحم الأم. على العكس من ذلك، تتطور أجنة حمار وحشي خارجيا ً وتتسم بالشفافية، وبالتالي يسهل ملاحظتها تحت المجهر. وعلاوة على ذلك، من السهل جدا بناء مجموعة متنوعة من الخطوط المعدلة وراثيا للبحوث ذات الصلة وظيفة الجينات. حاليا، تتوفر خطوط مختلفة من أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثيا لتسمية أنواع مختلفة من الخلايا. فمن المريح جدا الآن لبناء خطوط المعدلة وراثيا لالإفراط في التعبير عن العلاج الكيميائي في مواقع محددة ودراسة وظيفة chemokines على سلوك الخلية في حمار وحشي.
هنا، قدمنا سير العمل لاستخدام حمار وحشي خط المعدلة وراثيا للتحقيق في وظيفة IL-34 على سلوك الضامة في الجسم الحي2،3،4،5،6،7. أولا، قمنا ببناء بلازميد الإفراط في التعبير عن الكبد محددة من الجينات il34 وحقن بلازميد في مرحلة خلية واحدة TG (mpeg1: GFP) أجنة الأسماك التي وصفت على وجه التحديد الضامة من قبل GFP البروتين الفلورسنت. ثم، استخدمنا جبل كامل الفلورسنت في الموقع التهجين وتلطيخ المناعة للكشف عن نمط التعبير il34 وعدد أو موقع الضامة. تم رفع الأجنة WT حقن لتوليد خط مستقر المعدلة وراثيا. في هذه الخطوات، أنشأنا والتحقق من صحة خط إنتاج السيتوكين وتقييم بصريا الآثار التي يمكن رؤيتها على توزيع الضامة. وأخيرا، للتحقيق في سلوك الضامة ردا على السيتوكين، استخدمنا التصوير الحي البؤري لمراقبة مباشرة هجرة الضامة لتأكيد وظيفة il34 على هجرة الضامة في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الموضح هنا يسمح لنا للتحقيق في وظيفة chemokine على سلوك الجسم الحي الضامة والإجراء يتطلب بعض الخبرة التقنية. وباختصار، هناك عدة خطوات حاسمة لتجنب المضاعفات في البروتوكول: 1) اختيار خط مناسب وراثيا الذي يظهر إشارة محددة وقوية المعدلة وراثيا لتسمية الخلية ذات الأهمية؛ (2) اختيار خط من?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور جينغرونغ بنغ لتقاسم Tg (fabp10a: DsRed) خط المعدلة وراثيا; الدكتور زيلونغ ون لتقاسم TG (mpeg1: GFP) خطوط المعدلة وراثيا؛ د. كويتشي كاواكامي لتوفير متجه pTol2. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31771594)، ومشاريع خطة قوانغدونغ للعلوم والتكنولوجيا (2019A030317001) وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (D2191450).
Materials
| Antibody | |||
| Alexa 488-Anti-Goat antibody | Invitrogen | A11055 | |
| Anti-Digoxigenin-HRP | perkinelmer | NEF832001EA | |
| Goat-Anti-GFP antibody | Abcam | ab6658 | |
| Reagent | |||
| CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
| Cyanine 3 Plus Amplification Reagent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| E2 solution | 15 mM NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM KH2PO4 + 50 µM Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 | ||
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Life | 10099-133 | |
| formamide | Diamond | A100314 | |
| glycerol | Sigma | V900860 | |
| heparin sodium | Sigma | H3149 | |
| hybridization buffer(HB) | 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20 | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| low melting agarose | Sigma | A9414 | |
| methanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
| methylene blue | Sigma | M9140 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| paraformaldehyde(PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask. |
| 10×PBS | 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O | ||
| phenylthiourea(PTU) | Sigma | P7629 | |
| 1×Plus Amplification Diluent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
| 20×Saline sodium citrate(SSC) | 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0 | ||
| sodium citrate | Sigma | A5040 | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| tRNA | Sigma | R6625 | |
| Tween20 | Sigma | P2287 | |
| Plasmid | |||
| pBLK-fabp10a-il34-sv40 | For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation | ||
| pBSK-il34 | For il34 probe preparation | ||
| Fish | |||
| Tg (mpeg1: GFP) | Label macrophages with GFP | ||
| Tg (fabp10a: DsRed) | Label liver cells with DsRed | ||
| Tg (fab10a:il34) | Over-expression IL-34 in liver cells |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
- Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
- Wei, S., et al. Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells. Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).
- Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc. PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).
- Segaliny, A. I., et al. Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).
- Zhou, S. L., et al. miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis. Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).
- Gordon, J. I., et al. Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: a practical approach. , (2002).
- Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish. Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).
