Summary

生体内でのマクロファージ募集をテストするための異所性ケモカイン発現モデル

Published: September 25, 2019
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Summary

生体内でのマクロファージ募集に対するケモカインの効果を試験するために、その位置ハイブリダイゼーション中のマウント全体を使用してケモカインの異所性発現を検出し、免疫染色を用いてマクロファージの標識を行った。ライブイメージングは、マクロファージ移行のリアルタイム観察に使用されました。

Abstract

ゼブラフィッシュは、基礎研究や生物医学研究で広く使用されています。多くのゼブラフィッシュトランスジェニックラインは、現在、様々なタイプの細胞に標識するために利用可能です。ゼブラフィッシュの透明な胚体のために、生体内の特定のタイプの細胞の挙動に対する1つのケモカインの影響を研究することは便利です。ここでは、生体内でのマクロファージ移行に関するケモカインの機能を調べるためのワークフローを提供した。IL-34を過剰発現させる組織特異的過剰発現プラスミドを構築し、マクロファージが蛍光タンパク質によって特異的に標識された1細胞段階のトランスジェニック魚胚にプラスミドを注入した。その後、その場で蛍光全体を使用し、ケモカイン発現のパターンとマクロファージの数または位置を検出した。注入されたWT胚を、安定なトランスジェニックラインを生成するために上げた。最後に、共焦点ライブイメージングを用いて、安定したトランスジェニック魚のマクロファージ挙動を直接観察し、生体内のマクロファージに対するIL-34の機能を調べた。

Introduction

ゼブラフィッシュは、インド発祥の小さな熱帯硬骨淡水魚です。遺伝子保全に関しては、ゼブラフィッシュはヒト1と87%の類似性を持つ。ゼブラフィッシュの遺伝子調節、タンパク質機能、細胞行動(マイブレーション、増殖et.alなどの細胞行動を研究することにより、ヒトの関連する主題に関する洞察を提供します。ゼブラフィッシュ胚は、色素を阻害した後、異なる段階で初期胚の発達を観察するために使用することができる。一方、ゼブラフィッシュが性的成熟に発展するまでに3ヶ月しかかからないうちに、ゼブラフィッシュは4日ごとに数百個の卵を産むことができる。ミニサイズ、単純な繁殖、強力な生殖能力、これらの利点は、ゼブラフィッシュ培養を非常に省スペースにし、大規模な培養に役立ちます。従来の哺乳類モデルマウスはゼブラフィッシュよりもメンテナンスコストが高いため、マウスの飼育の規模が制限されます。初期の胚の発達の側面では、マウス胚は母親の子宮におけるマウス胚の発達の特徴のために生きている状態で観察することは困難である。それどころか、ゼブラフィッシュ胚は外部から発達し透明であるため、顕微鏡下で観察しやすい。さらに、ゼブラフィッシュは、関連する遺伝子機能研究のための様々なトランスジェニックラインを構築することが非常に容易である。現在、様々なゼブラフィッシュトランスジェニックラインは、異なるタイプの細胞に標識するために利用可能である。特定の場所でケモカインを過剰発現させるトランスジェニックラインを構築し、ゼブラフィッシュの細胞挙動に関するケモカイン機能を研究することは、今や非常に便利です。

ここでは、ビボ2、3、4、5、6、7におけるマクロファージ挙動に対するIL-34の機能を調べるためにゼブラフィッシュトランスジェニックラインを使用するワークフローを提供した。まず、遺伝子il34の肝臓特異的過剰発現プラスミドを構築し、蛍光タンパク質GFPによりマクロファージを特異的に標識した1細胞ステージTg(mpeg1:GFP)魚胚にプラスミドを注入した。次いで、その場で蛍光マウント全体を使用し、il34発現のパターンとマクロファージの数または位置を検出した。注入されたWT胚を、安定なトランスジェニックラインを生成するために上げた。これらのステップでは、サイトカイン産生ラインを確立し検証し、マクロファージ分布に及ぼす影響を視覚的に評価しました。最後に、サイトカインに応答するマクロファージの挙動を調べ、共焦点ライブイメージングを用いてマクロファージ移行を直接観察し、生体内のマクロファージ移行におけるil34の機能を確認した。

Protocol

注:全ての試料をフェニルチオール(PTU)卵水で処理し、色素を抑制した。 1. Tgの生成 (fabp10a:il34) トランスジェニックコンストラクトと魚の注入 ゼブラフィッシュの2.8kb fabp10aプロモーター8およびIL-34コード領域(ENSDART0000126460.3)をpTol2ベクターにクローンし、fabp10a-il34構築物を生成する。1細胞ステージTg(mpeg1:GFP)</em…

Representative Results

ゼブラフィッシュのプロトコルに関与する手順を図2に示します。まず、il34がfabp10aプロモーターによって駆動されたpBLK-fabp10a-il34-sv40コンストラクトを生成した(図2)。この構築物を、トランスジェニック安定線を生成するために成人に提起したGFPおよびWT胚でマクロファージに標識できるゼブラフィッシ?…

Discussion

ここで説明するプロトコルは、マクロファージン生体内の挙動に関するケモカインの機能を調べ、手順にはいくつかの技術的専門知識を必要とします。要約すると、プロトコルの合併症を避けるためにいくつかの重要なステップがあります:1)目的の細胞にラベルを付けるために、特定の強いトランスジェニック信号を示す適切なトランスジェニックラインを選択します。2)イメージングおよ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、Tg(fabp10a:DsRed)トランスジェニックラインを共有するためのジンロンペン博士に感謝します。Tg(mpeg1:GFP)トランスジェニックラインを共有するためのジロン・ウェン博士。pTol2ベクターを提供する川上浩一博士。この研究は、中国国家自然科学財団(31771594)、広東科学技術計画プロジェクト(2019A030317001)、中央大学基礎研究基金(D2191450)によって支援されました。

Materials

Antibody
Alexa 488-Anti-Goat antibody Invitrogen A11055
Anti-Digoxigenin-HRP  perkinelmer NEF832001EA
Goat-Anti-GFP antibody Abcam ab6658
Reagent
CaCl2H2O Sigma 21097
Cyanine 3 Plus Amplification Reagent perkinelmer NEL745001KT
E2 solution 15 mM  NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM  KH2PO4 + 50 µM  Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 
Fetal Bovine Serum(FBS) Life 10099-133
formamide Diamond A100314
glycerol  Sigma V900860
heparin sodium Sigma H3149
hybridization buffer(HB) 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
low melting agarose Sigma A9414
methanol GHTECH 1.17112.023
methylene blue  Sigma M9140
MgSO4 Sigma M2643
Na2HPO4 Sigma S5136
NaCl Sigma S5886
NaHCO3  Sigma S5761
paraformaldehyde(PFA) Sigma 158127 Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C  to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask.
10×PBS 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O
phenylthiourea(PTU) Sigma P7629
1×Plus Amplification Diluent perkinelmer NEL745001KT
Proteinase K  Fermentas E00492
20×Saline sodium citrate(SSC) 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0
sodium citrate Sigma A5040
tricaine Sigma E10521
tRNA  Sigma R6625
Tween20 Sigma P2287
Plasmid
pBLK-fabp10a-il34-sv40 For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation
pBSK-il34 For il34 probe preparation
Fish
Tg (mpeg1: GFP) Label macrophages with GFP
Tg (fabp10a: DsRed) Label liver cells with DsRed
Tg (fab10a:il34) Over-expression IL-34 in liver cells

References

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Cite This Article
Jiang, Y., Chen, J., Xu, J. An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo. J. Vis. Exp. (151), e60161, doi:10.3791/60161 (2019).

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